Линимент ранозаживляющий, содержащий бактериостатические метаболиты T. atrobrunneum F-1434 и сумму биофлавоноидов гречихи

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологической промышленности, ветеринарии, косметологии и предназначено для заживления раневых повреждений кожи, в том числе осложненных (инфицированных).

Известен ранозаживляющий препарат на основе Trichoderma harzianum Rifai ВКПМ F-180 (Патент РФ №2528065) [1]. Недостаток данного препарата заключается в том, что его применяют при лечении неинфицированных ран.

Задачей предлагаемого способа является расширение арсенала средств для заживления раневых повреждений кожи, в том числе с инфекционным осложнением.

Техническим результатом изобретения является то, что предлагаемое средство сокращает средние сроки заживления ран за счет ускорения элиминирования инфекционного агента.

Поставленная задача и указанный технический результат достигаются благодаря тому, что линимент ранозаживляющий, содержит бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum F-1434 и сумму биофлавоноидов гречихи, при следующем соотношении компонентов, мас %: экстракт культуральной жидкости Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 - 3,0; Na-КМЦ - 1,0%; сумма биофлавоноидов гречихи - 0,01; NaOH 30% (рН 6,0-6,5); вода очищенная до 100,0.

Штамм Т. atrobrunneum занесен в национальное патентное депонирование, №1434. Культура Trichoderma atrobrunneum 14. Дата депонирования 4 мая 2018 года. Депозитор ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени Н.В. Парахина». Продукт, продуцируемый штаммом (область применения): Биологически активные соединения, обладающие антигрибной и антибактериальной активностью. Регистрационный номер ВКПМ: F-1434.

Сумма биофлавоноидов гречихи под торговой маркой «Рутифлав» свидетельство на товарный знак №551481. Владелец свидетельства: Общество с ограниченной ответственностью "Биосинтез". Дата государственной регистрации: 28.08.2015, срок действия свидетельства: 2024-03-17. Класс 5 по Международной классификации товаров и услуг. Рутин и кверцетин, входящие в состав суммы биофлавоноидов гречихи под торговой маркой «Рутифлав» улучшают кровообращение, обладают противовоспалительным эффектом.

Экстракт культуральной жидкости, содержащей бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434, получали следующим образом.

Для приготовления инокулята недельную агаровую культуру Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 суспендировали в физрастворе до мутности 1,5 McF, засевали на жидкую среду Чапека в соотношении 1:10, инкубировали 5 суток на качалке при температуре 28°С.

Продуцент культивировали в ферментере Minifors производства Infers (Герания), объемом 5 л с коэффициентом заполнения 0,8. Ферментер оснащен лопастной мешалкой, фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры и рН. Питательную среду готовили непосредственно в аппарате. Среда для глубинного культивирования состояла из 0,2% натрия азотнокислого, 0,1% калия фосфата однозамещенного, 0,05% магния сернокислого гептагидрата, 0,05% калия хлористого, 0,001% железа сернокислого на 1 литр воды (w/v). Простерилизовав, устанавливали рН 7,4 и асептически вносили стерильный концентрат сахарозы. Вводили инокулят в количестве 0,5% объема среды, инкубировали 5 суток при 28,0°С, перемешивая с частотой оборотов 120 мин^-1. Культуральную жидкость последовательно фильтровали через марлю и бумажный фильтр, центрифугировали 10 минут с ускорением 10000g, супернатант отделяли и фильтровали через мембраны «Владипор» типа МФА-МА (ТУ 6-05-1903-87). Фильтрат соединяли с гидрофобным растворителем 1:1 и перемешивали 3 часа, отстаивали до разделения слоев и отбирали неполярную фракцию, которую упаривали досуха при t 40°С. Осадок восстанавли в 5 мл 60% раствора этанола. В спиртовом растворе препарат представляет собой маслянистую жидкость оранжевого цвета, при стоянии в холоде оседает в виде капель, при взбалтывании переходит в эмульсию. Растворим в этилацетате, ацетоне, ацетонитриле. Рабочий раствор, имеет желтый оттенок, прозрачен и/или слегка опалесцирует. При УФ-спектрометрии определяется максимум поглощения на длине волны 275 нм. После ТСХ в системе хлороформ: метанол (3:1) определяется Rf=0,44. Условия создания ранозаживляющего средства.

Выбор оптимальной концентрации бактериостатических метаболитов Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434, обеспечивающей угнетение роста инфекционных агентов, основывался на определении минимальной ингибирующей концентрации в отношении условно-патогенной микрофлоры (Гнеушева И.А., Лушников А.В., Павловская Н.Е. Антимикробная активность ветеринарных бактериостатических композиций на основе Trichoderma harzanum Rifai / И.А. Гнеушева, А.В. Лушников, Н.Е. Павловская // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. - 2018. - №9. - С. 65-74.) [2]. В результате скрининга тест-культур определена эффективная концентрация экстракта культуральной жидкости Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 - 3% (v/v). В качестве формообразующей основы использовали натриевую соль карбоксиметилцелюлозы (Na-КМЦ).

Таким образом, в результате комплекса физико-химических, биологических и реологических исследований разработан следующий состав предлагаемого средства, масс %.:

Изготовление средства начинают с подготовки экстракта культуральной жидкости, содержащей бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 и формообразующей основы. В операцию подготовки основы входит процесс растворения и набухания, а также установления заданного показателя рН.

Линимент ранозаживляющий, содержит экстракт культуральной жидкости Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434 - 3,0 (Гнеушева И.А. Оценка биологической активности бактериостатической композиции на основе Trichoderma atrobrunneum ВКПМ F-1434 для ветеринарии / И.А. Гнеушева, А.В. Лушников, О.А. Маркина // В сборнике: Современные аспекты биобезопасности продукции животноводства. Материалы всероссийской научно-практической конференции, 2018. С.25-29 [3], Павловская Н.Е. Биологическая активность бактериостатических метаболитов на основе Trichoderma atrobrunneum ВКПМ F-1434 / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, А.В. Лушников, О.А. Маркина // В сборнике: Микробные технологии в птицеводстве и животноводстве. Материалы всероссийской научно-практической конференции, 2018. С. 27 [4]); Na-КМЦ - 1,0; сумма биофлавоноидов гречихи под торговой маркой «Рутифлав» - 0,01; вода очищенная - до 100,0; NaOH 30% - рН 6,0-6,5 (при соотношении компонентов, мас %).

В производственной емкости соединяют рассчитанное количество очищенной воды и навеску Na-КМЦ, перемешивают с помощью механической мешалки до гомогенного состояния. Основу Na-КМЦ стерилизуют 10 минут автоклавированием при 1 амт. 120°С, охлаждают до 45°С. Полученную основу Na-КМЦ асептически нагружают экстрактом культуральной жидкости, содержащей бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434, и суммой биофлавоноидов гречихи; тщательно перемешивают и оставляют в течение суток при температуре 2-8°С до полного завершения структурообразования. Готовую форму разливают во флаконы-дозаторы.

Белым лабораторным мышам (по 5 единиц в каждой экспериментальной группе) скарификатором наносили поверхностные раны, инфицировали равнодолевой смесью стандартных и клинических штаммов Е. coli АТСС 25922, 11/1; К. pneumoniae АТСС 13883, 24/4. На стадии воспаления инфицированные раны начинали обрабатывать: 1 группа - предлагаемым средством; 2 группа - основой Na-КМЦ (плацебо); 3 группа - контроль без лечения.

Установлено, что предлагаемое средство с экстрактом культуральной жидкости, содержащей бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434, и суммой биофлавоноидов гречихи оказывает ранозаживляющее действие (таблица), ускоряет элиминирование инфекционного агента в среднем на 16,6%, сокращает средние сроки заживления ран на 6,4% по сравнению с контрольной группой. В сравнении с группой, получавшей плацебо, элиминирование инфекционного агента сокращается в среднем на 14,3%, средние сроки заживления ран - на 3,7%.

Полученные результаты экспериментальных исследований показали ускорение заживления ран при использовании средства с 3% экстракта культуральной жидкости, содержащей бактериостатические метаболиты Т. atrobrunneum ВКПМ F-1434, и 0,01% суммы биофлавоноидов гречихи на основе Na-КМЦ.