23.04.2020
220.018.17ff

СЕЛЕКТИВНОЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИСТЕИНОВЫХ ОСТАТКОВ В АНТИТЕЛАХ ПРОТИВ IL-17

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
№ охранного документа
0002719563
Дата охранного документа
21.04.2020
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Заявленное изобретение относится к биотехнологиям, а точнее к способам селективного восстановления CysL97 в препарате антител секукинумаб, которые рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих. Также предоставлен очищенный препарат антител секукинумаб, полученный посредством данных способов, в котором уровень интактных антител секукинумаб составляет по меньшей мере приблизительно 90% и где уровень активности антител секукинумаб в указанном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 14 пр., 17 ил., 52 табл.
Реферат Свернуть Развернуть

Родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США № 62/095361, поданной 22 декабря 2014 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее раскрытие относится к способам селективного восстановления CysL97 в препарате антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов, напр., препарате секукинумаб, которые рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих.

Уровень техники раскрытия

Классические антитела состоят из двух легких цепей (L) с молекулярной массой, составляющей приблизительно 25 кДа каждая, и двух тяжелых цепей (H) с молекулярной массой, составляющей приблизительно 50 кДа каждая. Легкие и тяжелые цепи соединены посредством дисульфидной связи (L-S-S-H), и две LH-единицы дополнительно связаны между тяжелыми цепями посредством двух дисульфидных связей. Общая формула классического антитела представляет собой L-SS-H(-SS-)2H-SS-L или просто H2L2 (HHLL). Помимо данных консервативных межцепочечных дисульфидных связей, имеется также консервативный внутрицепочечный дисульфид. Оба типа дисульфидных связей являются важными для стабильности и поведения (напр., аффинности) антитела. В целом, дисульфидная связь образуется двумя цистеиновыми остатками (Cys-SH), находящимися в консервативных положениях в цепях антитела, которые спонтанно образуют дисульфидную связь (Cys-S-S-Cys). Формирование дисульфидных связей определяется редокс-потенциалом окружающей среды и присутствием ферментов, специализированных на тиол-дисульфидном обмене. Внутренние дисульфидные связи (Cys-S-S-Cys) стабилизируют трехмерную структуру антитела.

Существуют необычные антитела, которые содержат добавочный свободный цистеин (цистеины) (т.е. неспаренный цистеин), который участвует в распознавании и связывании антигена. Для данных антител модификация свободного цистеина может иметь отрицательное действие на активность и стабильность молекулы, и может приводить к повышенной иммуногенности. В результате процессинг данных антител может быть затруднен, поскольку конечный продукт может содержать значительное количество неактивного, неправильно свернутого и бесполезного антительного материала. US20090280131, который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, предоставляет антитела против IL-17, напр., секукинумаб (т.е. AIN457) со свободным цистеиновым остатком после цис-пролина в петле участка 3, определяющего комплементарность (CDR) легкой цепи (L-CDR3) (т.е. аминокислота восемь L-CDR3, как представлено в SEQ ID NO:6, которая соответствует аминокислоте 97 вариабельной области легкой цепи, как представлено в SEQ ID NO:10, в дальнейшем в данной заявке именуемой «CysL97»). С целью сохранения полной активности, неспаренный цистеиновый остаток секукинумаба не может быть замаскирован посредством окислительного дисульфидного спаривания с другими цистеиновыми остатками или посредством окисления экзогенными соединениями (напр., посредством образования смешанных дисульфидов с другими белками, дериватизации с помощью клеточных метаболитов [напр., цистеина или глутатиона] и образования сульфоксидов посредством кислорода). К сожалению, поскольку секукинумаб производят с применением клеток млекопитающих, возникают нежелательные клеточные модификации CysL97.

В литературе описан рефолдинг белков млекопитающих, экспрессируемых в бактериальных клетках, которые продуцируют белки млекопитающих в виде развернутых нерастворимых агрегатов, имеющих смешанные дисульфиды (тельца включения). Чтобы получить белки млекопитающих из бактерий, белки телец включения выделяют, растворяют и денатурируют сильными хаотропными реагентами и восстанавливающими агентами. Для правильного рефолдинга растительных белков, полученных из коммерческих источников или рекомбинантно полученных в дрожжах (US 4766205), также применяют полную денатурацию и восстановление дисульфидных связей с применением денатурирующего агента, восстанавливающего агента, образующего дисульфидный аддукт агента и умеренной окислительной/восстановительной среды (pH 7-9). Данные способы, в которых задействуют полную денатурацию и рефолдинг белков, являются дорогостоящими, разрушающими, трудоемкими и ненужными для белка, продуцируемого в клетках млекопитающих.

Известно применение окислительно-восстановительных связующих реагентов для исправления неправильного слияния не встречающихся в природе белков, слитых с Fc (WO02/68455). Белки, слитые с Fc, WO02/68455, предположительно содержат межцепочечные дисульфиды в Fc-области, которые восстанавливаются и реоксигенируются посредством раскрытого способа, но в нем нет никакой идеи о том, как получить молекулу, имеющую селективно восстановленный остаток цистеина. Более того, белок, слитый с Fc, является не просто антителом, а очень сложным иммуноглобулином, который зависит от множества должным образом связанных межцепочечных и внутрицепочечных дисульфидов для структуры и активности.

US20050123532 предоставляет способы получения антитела, имеющего свободный цистеин, посредством активации антитела восстанавливающим агентом, или посредством культивирования антителопродуцирующих клеток в бессывороточной среде, обогащенной L-цистеином. При применении данного способа культивирования клеток более поздние стадии процессинга, напр., фильтрация, вирусная инактивация и хроматография, могут приводить к окислению свободного цистеина, полученного посредством способов культивирования клеток. В данных случаях, свободный цистеин идеально защищен во время более поздних стадий посредством модифицирования свободной тиольной группы окисляющим агентом, который сам позднее удаляют с применением различных методик, напр., фильтрации (US20060257393). Для производства в промышленных масштабах данные способы требуют больших количеств восстанавливающего агента в исходной среде для культивирования, больших количеств окисляющего агента во время более позднего процессинга и дополнительных способов фильтрации для удаления окисляющего агента, дополнительного времени и расходов на издержки производства.

В Патенте США № 7928205 описано предпочтительное применение редокс-пар для рефолдинга антител IgG2, полученных из клеточных культур млекопитающих, а также способы децистеинилирования свободного цистеина в вариабельной области антитела 146B7 (IgG1). Соответствующая исследовательская публикация, Banks et al. (2008) J. Pharmaceutical Sci. 97:764-779, описывает децистеинилирование неспаренного сульфгидрила в вариабельной области рекомбинантного моноклонального антитела IgG1 (MAB007). Banks с соавторами исследовал, требовалось ли при децистеинилирования MAB007 применение сильного денатурирующего агента (GdnHCL) и восстанавливающего агента (цистеин) или происходило ли селективное восстановление в присутствии одного лишь цистеина. Авторы изобретения определили, что из MAB007 эффективно исключали цистеинилирование в присутствии и отсутствии денатурирующего агента.

Ни в одной из приведенных выше ссылок не показано, возможно ли селективное восстановление CysL97 в секукинумабе. В приведенных выше ссылках не описаны реагенты и условия, необходимые для селективного восстановления CysL97 в секукинумабе, которые зависят, помимо прочего, от первичной, вторичной и третичной структуры секукинумаба; положения и локализации окисленного CysL97 в секукинумабе (напр., доступного или недоступного для растворителя); и относительной прочности консервативных дисульфидных связей в антителе (например, реагирует ли CysL97 с данным восстанавливающим агентом сначала или только после того, как консервативные цистеины были восстановлены). Более того, ни в одной из данных ссылок не описано, приведет ли селективное восстановление окисленного CysL97 в секукинумабе к изменениям в структуре антитела (напр., в укладке), в химическом составе (напр., к дезаминированию) или в свойствах (связывающей активности, склонности к агрегации или деградации), каждое из которых может сделать его технически нецелесообразным/непрактичным для селективного восстановления секукинумаба в коммерческих масштабах.

СУЩНОСТЬ РАСКРЫТИЯ

С целью сохранения максимальной антигенсвязывающей активности секукинумаба авторы изобретения определили, что во время процессинга секукинумаба необходимо превратить CysL97 из замаскированной (1) в свободную (2) форму (см. I, ниже) без значительного восстановления консервативных дисульфидных связей; в противном случае более низкая активность и неактивные варианты с более низкой молекулярной массой будут образовываться путем разрыва цепи (H2L2 → H2L, HL2, HL, H и L).

Введение условий восстановления при получении антител в коммерческом масштабе является противоречивым (см., напр., Trexler-Schmidt et al. 2010 Biotech и Bioengineering 106:452-61, в котором используются различные реагенты и способы для предотвращения восстановления дисульфидной связи антитела во время получения антител в культуре клеток). Тем не менее авторы изобретения определили, что селективное восстановление CysL97 в секукинумабе во время крупномасштабного промышленного производства в клетках млекопитающих возможно без значительной денатурации антитела. В данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в антигенсвязывающих участках антител против IL-17 (и их фрагментах), раскрытых в US20090280131, в частности секукинумаб. Данные способы способствуют восстановлению связывающей активности данных антител и, таким образом, увеличивают биологическую активность их препаратов. Более того, данные способы способствуют повышению уровня интактных антител и увеличению однородности препаратов данных антител. Раскрытые способы зависят от комбинированного действия конкретных соотношений антитело:восстановитель и регулируемых скоростей переноса кислорода в системе во время инкубации.

Соответственно, в данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препарате антител против IL-17, которые были рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих, включающие:

а) приведение препарата в контакт по меньшей мере с одним восстанавливающим агентом в системе для образования восстанавливающей смеси; и

b) инкубацию восстанавливающей смеси при сохранении объемного коэффициента массопереноса кислорода (kLa*) в системе, составляющем приблизительно ≤0,37 ч-1, где указанный kLa* вычисляют посредством адаптации кривой растворенного кислорода к кривой насыщения;

где каждое антитело против IL-17 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина, содержащий три участка, определяющих комплементарность (CDR) VH, изложенный в SEQ ID NO:8, и вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий три CDR VL, изложенный в SEQ ID NO:10, и дополнительно где перед стадией a) начальный процент насыщения кислородом в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 60%, как измерено с применением кислородного зонда, откалиброванного при 25°C.

Также в данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препарате антител против IL-17, которые были рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих, включающие:

a) приведение препарата в контакт с набором окислительно-восстановительных реагентов, выбранных из цистеина/цистина и цистеина/цистамина для образования восстанавливающей смеси; и

b) инкубацию восстанавливающей смеси при температуре приблизительно 37°C в анаэробных условиях в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов, или инкубацию восстанавливающей смеси при температуре приблизительно 18-24°C в течение приблизительно 16-24 часов;

в которых каждое антитело против IL-17 содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина, содержащий три участка, определяющих комплементарность (CDR) VH, изложенный в SEQ ID NO:8, и вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий три CDR VL, изложенный в SEQ ID NO:10.

Также в данной заявке раскрыты очищенные препараты секукинумаба, в которых уровень интактного секукинумаба в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%, как измерено посредством капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), и в которых уровень активности секукинумаба в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%, как измерено посредством катионообменной хроматографии с цистамином.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигура 1 демонстрирует процентное содержание интактного антитела (LHHL) с течением времени после воздействия различных восстанавливающих агентов.

Фигура 2A демонстрирует процентное содержание интактного антитела (LHHL) с течением времени при комнатной температуре после воздействия селективного восстановления посредством 8 мМ цистеина в анаэробных условиях. Фигура 2B демонстрирует процентное содержание интактного антитела (LHHL) с течением времени при комнатной температуре после воздействия селективного восстановления посредством 8 мМ цистеина в аэробных условиях. Фигура 2C демонстрирует процентное содержание интактного антитела (LHHL) с течением времени при 37°C после воздействия селективного восстановления посредством 8 мМ цистеина в анаэробных условиях. Фигура 2D демонстрирует процентное содержание интактного антитела (LHHL) с течением времени при 37°C после воздействия селективного восстановления посредством 8 мМ цистеина в аэробных условиях.

Фигура 3 демонстрирует процентное содержание интактного антитела с течением времени при температуре 37°C после воздействия селективного восстановления посредством 8 мМ цистеина при различных концентрациях растворенного кислорода.

Фигура 4A демонстрирует контурную диаграмму 4D активности посредством катионообменной хроматографии. Фигура 4B демонстрирует контурную диаграмму 4D чистоты согласно CE-SDS. Диаграммы фигуры 4 анализируют влияние и взаимодействие концентрации цистеина, содержания белка и соотношения цистеин:цистин на выходные параметры активность согласно CEX и чистоту согласно CE-SDS.

Фигура 5A демонстрирует контурную диаграмму 4D активности согласно CEX. Фигура 5B демонстрирует контурную диаграмму 4D чистоты согласно CE-SDS. Диаграммы фигуры 5 анализируют влияние и взаимодействие концентрации цистеина, содержания белка и концентрации цистина на выходные параметры активность согласно CEX и чистоту согласно CE-SDS.

Фигура 6 демонстрирует контурную диаграмму 4D активности согласно CEX с учетом влияния и взаимодействия pH, времени, температуры и концентрации цистеина.

Фигура 7 демонстрирует контурную диаграмму 4D чистоты согласно CE-SDS с учетом влияния и взаимодействия pH, времени, температуры и концентрации цистеина.

Фигура 8 демонстрирует график растворенного кислорода при обработке цистеином в опыте 1 подтверждения.

Фигура 9 демонстрирует график растворенного кислорода при обработке цистеином в опыте 2 подтверждения.

Фигура 10 демонстрирует график растворенного кислорода при обработке цистеином в опыте 3 подтверждения.

Фигура 11 демонстрирует график растворенного кислорода при обработке цистеином в опыте 4 подтверждения.

Фигура 12 сравнивает кинетику реакций опыта 3 подтверждения и опыта 4 подтверждения в отношении активности согласно CEX и чистоты согласно CE-SDS.

Фигура 13A демонстрирует масштабированную и центрированную диаграмму коэффициентов для активности согласно CEX в REACT.P.

Фигура 13B демонстрирует контурную диаграмму 4D активности согласно CEX REACT.P. Диаграммы фигуры 13 анализируют влияние и взаимодействие концентрации цистеина, содержания белка и скорости мешалки на выходные параметры активность согласно CEX и чистоту согласно CE-SDS.

Фигура 14A демонстрирует профили растворенного кислорода в опытах по созданию характеристики способа при 0 об/мин (числа в легенде указывают номер опыта, скорость мешалки и концентрацию цистеина и антитела). Фигура 14B демонстрирует профили растворенного кислорода в опытах по созданию характеристики способа при 50 об/мин (числа в легенде указывают номер опыта, скорость мешалки и концентрацию цистеина и антитела). Фигура 14C демонстрирует профили растворенного кислорода в опытах по созданию характеристики способа при 100 об/мин (числа в легенде указывают номер опыта, скорость мешалки и концентрацию цистеина и антитела). Фигура 14D сравнивает профили растворенного кислорода двух опытов, выполненных в масштабе 50 мл при 50 об/мин и 6,0 мМ цистеина, один без антитела, а другой с 12,7 г/л антитела.

Фигура 15 демонстрирует кинетику селективного восстановления активности согласно CEX при различных температурах инкубации.

Фигура 16 демонстрирует наложение графиков растворенного кислорода из квалификационных опытов с моделью в уменьшенном масштабе с указанием на продолжительность различных этапов способа (добавления цистеина, нагревания, инкубации, охлаждения и регулирования pH).

Фигура 17 демонстрирует кинетику активности согласно CEX в опытах в промышленном масштабе и опытов с моделью в уменьшенном масштабе во время селективного восстановления.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ РАСКРЫТИЯ

Целью раскрытия является предоставление способов селективного восстановления CysL97 в антигенсвязывающих участках определенных антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов, таких как секукинумаб. Посредством «селективного восстановления» обозначают, что CysL97 в раскрытых антителах против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментах восстанавливается до окисленной формы без восстановления консервативных цистеиновых остатков данных антител. Консервативные цистеиновые остатки, в случае классического антитела IgG1, представляют собой: два дисульфидных мостика в шарнирной области, два межцепочечных дисульфидных мостика (один из каждого Fab), четыре внутрицепочечных дисульфидных мостика в Fc-области и восемь внутрицепочечных дисульфидных мостиков в Fab-участке антитела. Во время процесса селективного восстановления может происходить временное восстановление консервативных цистеинов некоторых антител в конкретном препарате. Однако по завершении реакции подавляющее большинство консервативных цистеинов, которые были временно восстановлены, будут повторно окисляться с образованием консервативных дисульфидных связей, обнаруженных в типичных антителах, приводя к высокой чистоте и активности в селективно восстановленном препарате (то есть очищенном препарате) антител. Понятно, что не ожидается, что после завершения реакции селективного восстановления селективно восстановленный препарат (то есть очищенный препарат) не должен содержать 100% интактных антител; вместо этого селективно восстановленный препарат в идеале должен содержать по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно 100% (относительно теоретического максимума) интактных антител, как измерено согласно CE-SDS.

Термин «содержащий» охватывает «включающий», а также «состоящий», напр., композиция, «содержащая» X, может состоять исключительно из X или может включать что-либо дополнительно, напр., X+Y.

Термин «приблизительно» по отношению к численному значению x обозначает, например, +/-10%. При использовании перед числовым диапазоном или рядом чисел термин «приблизительно» применяется к каждому числу в последовательности, напр., фразу «приблизительно 1-5» следует интерпретировать как «приблизительно 1 - приблизительно 5» или, напр., фразу «приблизительно 1, 2, 3, 4» следует интерпретировать как «приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4» и т.д.

Относительная молекулярная масса секукинумаба на основании посттрансляционной аминокислотной последовательности составляет 147944 Дальтон. Данную молекулярную массу (т.е., 147944 Дальтон) применяют при подсчете значений моляльности секукинумаба и молярных соотношений на протяжении всего настоящего раскрытия. Однако во время образования в клетках CHO С-концевой лизин обычно удаляют из каждой тяжелой цепи. Относительная молекулярная масса секукинумаба с отсутствующим С-концевым лизином из каждой тяжелой цепи составляет 147688 Дальтон. Препарат секукинумаба содержит смесь молекул с остатками С-концевого лизина и без них в тяжелой цепи. Значения моляльности секукинумаба (и соотношения, использующие данные значения моляльности), применяемые в настоящем раскрытии, являются, таким образом, оценками, а термин «около», «приблизительно» и тому подобное в отношении к данным числовым значениям охватывает по меньшей мере данные колебания в относительной молекулярной массе и полученные в результате этого расчеты.

Слово «по существу» не исключает «полностью», напр., композиция, которая «по существу не содержит» Y, может полностью не содержать Y. При необходимости слово «по существу» может быть удалено из определения раскрытия.

Термин «антитело», как упоминается в данной заявке, включает антитела в целом и любой антигенсвязывающей участок или его одиночные цепи. Встречающееся в природе «антитело» представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенную в данной заявке как VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенную в данной заявке как VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. VH и VL области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, обозначенные термином гипервариабельные области или участки, определяющие комплементарность (CDR), чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, обозначенными термином каркасные области (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (напр., эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, как используется в данной заявке, относится к фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (напр., IL-17). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться на фрагментах полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченные термином «антигенсвязывающий участок» антитела, включают Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL, VH, CL и CH1 домена; F(ab)2 фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; Fd-фрагмент, состоящий VH и CH1 домена; Fv-фрагмент, состоящий из VL и VH домена одного плеча антитела; dAb-фрагмент (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), который состоит из VH домена; и выделенный CDR. Иллюстративные антигенсвязывающие участки включают CDR секукинумаба, как изложено в SEQ ID NO:1-6 и 11-13 (Таблица 1), предпочтительно CDR3 тяжелой цепи. Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с применением рекомбинантных способов, посредством синтетического линкера, который позволяет им составлять единую белковую цепь, в которой пары VL- и VH-областей образуют моновалентные молекулы (известные как одноцепочечная цепь Fv (scFv); см., напр., Bird et al., 1988 Science 242:423-426; и Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Данные одноцепочечные антитела также предназначены для охвата термином «антитело». Одноцепочечные антитела и антигенсвязывающие участки получают с применением общепринятых методик, известных квалифицированным специалистам в данной области.

«Выделенное антитело», как используется в данной заявке, относится к антителам, которые по существу не содержат других антител, имеющих иную антигеномную специфичность (напр., выделенные антитела, которые специфически связывают IL-17, по существу не содержат антител, которые специфически связывают антигеномы, не являющиеся IL-17). Термин «моноклональное антитело» или «композиция моноклональных антител», как используется в данной заявке, относится к препарату молекул антител одномолекулярной композиции. Термин «человеческое антитело», как используется в данной заявке, предназначено для включения антител, имеющих вариабельные области, в которых и каркасные, и CDR области получены из последовательностей человеческого происхождения. Нет необходимости, чтобы «человеческое антитело» вырабатывалось человеком, тканями человека или клетками человека. Человеческие антитела раскрытия могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человека (напр., мутации, вносимые случайным или сайтспецифическим мутагенезом in vitro, путем добавления N-нуклеотида в соединениях in vivo при рекомбинации генов антитела или соматической мутации in vivo). В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов и композиций антитело против IL-17 представляет собой человеческое антитело, выделенное антитело и/или моноклонального антитело.

Термин «IL-17» относится к IL-17A, ранее известному как CTLA8, и включает IL-17A дикого типа от различных видов (напр., человека, мыши и обезьяны), полиморфные варианты IL-17A и функциональные эквиваленты IL-17A. Функциональные эквиваленты IL-17A в соответствии с настоящим раскрытием предпочтительно имеют по меньшей мере приблизительно 65%, 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже 99% общую идентичность последовательностей с IL-17A дикого типа (напр., IL-17A человека), и по существу сохраняют способность индуцировать выработку IL-6 фибробластами дермы человека.

Термин «KD» предназначен для обозначения скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин «KD», как используется в данной заявке, предназначен для обозначения постоянной диссоциации, которая получается из отношения Kd к Ka (т.е. Kd/Ka) и выражается в виде молярной концентрации (M). Значения KD для антител могут быть определены с использованием методов, хорошо известных в данной области. В способе определения KD антитела используется поверхностный плазмонный резонанс или используется биосенсорная система, например, система Biacore®. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 или антигенсвязывающий фрагмент, напр., секукинумаб, имеет KD, составляющий приблизительно 100-250 пМ для IL-17 человека.

Термин «аффинность» относится к силе взаимодействия между антителом и антигеном в единых иммунодоминантных сайтах. В каждом иммунодоминантном сайте вариабельная область антитела, «плечо», взаимодействует посредством слабых нековалентных сил с антигеном в ряде сайтов; чем больше взаимодействий, тем сильнее аффинность. В данной области известны стандартные анализы для оценки аффинности связывания антител к IL-17 различных видов, включая, например, ELISA, вестерн-блоты и RIA. Кинетика связывания (например, аффинность связывания) антител также может быть оценена с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как анализ Biacore.

Антитело, которое «ингибирует» одно или более функциональных свойств (напр., биохимическую, иммунохимическую, клеточную, физиологическую или другие виды биологической активности и тому подобное) данных IL-17, как определено в соответствии с методологиями, известными в данной области и описанными в данной заявке, как будет понятно, относится к статистически значимому снижению конкретной активности по отношению к активности, наблюдаемой в отсутствии антитела (или когда присутствует контрольное антитело неактуальной специфичности). Антитело, которое ингибирует активность IL-17, влияет на статистически значимое снижение, например, по меньшей мере на 10% от измеренного параметра, по меньшей мере на 50, 80 или 90%, а в некоторых вариантах осуществления раскрытых способов и композиций используемое антитело против IL-17 может ингибировать более 95%, 98% или 99% функциональной активности IL-17.

«Ингибируют IL-6», как используется в данной заявке, относится к способности антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента (напр., секукинумаба) снижать выработку IL-6 из первичных фибробластов дермы человека. Выработка IL-6 в первичных (дермальных) фибробластах человека зависит от IL-17 (Hwang et al., (2004) Arthritis Res Ther; 6:R120-128). Кратко, фибробласты дермы человека стимулируются рекомбинантными IL-17 в присутствии различных концентраций молекул, связывающих IL-17, или рецептора к IL-17 человека с Fc-частью. В качестве негативного контроля можно успешно использовать химерное анти-CD25 антитело Simulect® (базиликсимаб). Супернатант берут после 16 ч стимуляции и анализируют на IL-6 посредством ELISA. Антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент, напр., секукинумаб, как правило, имеет IC50 для ингибирования выработки IL-6 (в присутствии 1 нМ IL-17 человека), составляющей приблизительно 50 нМ или менее (напр., от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 нМ) при тестировании, как указано выше, т.е. указанную ингибирующую активность измеряют по выработке IL-6, индуцированной hu-IL-17 в фибробластах дермы человека. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов и композиций антитела против IL-17 или их антигенсвязывающие фрагменты, напр., секукинумаб, и их функциональные производные имеют IC50 для ингибирования выработки IL-6, как определено выше, составляющей приблизительно 20 нМ или менее, более предпочтительно составляющей приблизительно 10 нМ или менее, более предпочтительно составляющей приблизительно 5 нМ или менее, более предпочтительно составляющей приблизительно 2 нМ или менее, более предпочтительно составляющей приблизительно 1 нМ или менее.

Термин «производное», если не указано иное, используют для определения вариантов аминокислотной последовательности и ковалентных модификаций (напр., пегилирования, дезаминирования, гидроксилирования, фосфорилирования, метилирования и т.д.) антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, напр., секукинумаба, в соответствии с настоящим раскрытием, напр., специфической последовательности (напр., вариабельного домена). «Функциональное производное» включает молекулу, имеющую качественную биологическую активность, общую с раскрытыми антителами против IL-17. Функциональное производное включает фрагменты и аналоги пептидов антитела против IL-17, как раскрыто в данной заявке. Фрагменты содержат области в последовательности полипептида в соответствии с настоящим раскрытием, напр., специфической последовательности. Функциональные производные антител против IL-17, раскрытые в данной заявке (напр., функциональные производные секукинумаба), предпочтительно включают VH- и/или VL-домен, имеющий по меньшей мере приблизительно 65%, 75%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% общую идентичность последовательностей с последовательностями VH и/или VL антител против IL-17 и их антигенсвязывающих фрагментов, раскрытых в данной заявке (напр., последовательностями VH- и/или VL- Таблицы 1), и по существу сохраняет способность связывать IL-17 человека или, напр., ингибируют выработку IL-6 IL-17-индуцированными фибробластами дермы человека.

Фраза «по существу идентичный» обозначает, что релевантная аминокислотная или нуклеотидная последовательность (напр., VH или VL домен) будет идентичной или иметь несущественные отличия (напр., за счет замещения консервативной аминокислоты) при сравнении с конкретной ссылочной последовательностью. Несущественные отличия включают небольшие изменения аминокислот, такие как 1 или 2 замещения в 5 аминокислотной последовательности конкретной области (напр., VH или VL домена). В случае антител второе антитело имеет такую же специфичность и имеет по меньшей мере 50% аффинности к этому антителу. Последовательности, по существу идентичные (например, последовательности с по меньшей мере приблизительно 85% идентичностью) с последовательностями, раскрытыми в данной заявке, также являются частью данной заявки. В некоторых вариантах осуществления идентичность последовательностей производного антитела против IL-17 (напр., производного секукинумаба, напр., биоподобного антитела секукинумаб) может составлять приблизительно 90% или более, напр., 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше по отношению к раскрытым последовательностям.

«Идентичность» в отношении нативного полипептида и его функционального производного определяется в данной заявке, как процентное содержание аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными остаткам соответствующего нативного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, при необходимости, чтобы достичь максимального процента идентичности, и не рассматривая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательностей. Ни N- или С-терминальные расширения, ни вставки не должны истолковываться как уменьшающие идентичности. Хорошо известны методы и компьютерные программы для выравнивания. Процент идентичности может быть определен с помощью стандартных алгоритмов выравнивания, например, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), описанного Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 410); алгоритма Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 453); или алгоритма Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17). Набор параметров может являться матрицей замен Blosum 62 со штрафом за пропуск в последовательности, составляющим 12, штрафом за продолжение гэпа, составляющим 4, и штрафом за пробел в рамке, составляющим 5. Процент идентичности между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями также можно определить с применением алгоритма E. Meyers и W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы весов замен остатков PAM120, штрафа за продление гэпа, составляющим 12, и штрафа за пропуск в последовательности, составляющим 4.

«Аминокислота (аминокислоты)» относится, напр., ко всем встречающимся в природе L-α-аминокислотам и включает D-аминокислоты. Фраза «варианты аминокислотной последовательности» относится к молекулам с некоторыми различиями в их аминокислотных последовательностях в сравнении с последовательностями в соответствии с настоящим раскрытием. Варианты аминокислотной последовательности антитела в соответствии с настоящим раскрытием, напр., специфической последовательности, все еще имеют способность связывать IL-17 человека или, напр., ингибировать выработку IL-6 IL-17-индуцированными фибробластами дермы человека. Варианты аминокислотной последовательности включают замещающие варианты (варианты, которые имеют по меньшей мере один удаленный аминокислотный остаток и другую аминокислоту, вставленную на ее место в том же положении в полипептиде в соответствии с настоящим раскрытием), инсерционные варианты (варианты с одной или более аминокислотами, вставленными непосредственно вблизи аминокислоты в конкретном положении в полипептиде в соответствии с настоящим раскрытием) и делеционные варианты (варианты с одной или более аминокислотами, удаленными в полипептиде в соответствии с настоящим раскрытием).

Фразы «свободный цистеин», «нетрадиционный цистеин» и «неспаренный цистеин» взаимозаменяемо относятся к цистеину, который не участвует в консервативных дисульфидных связях антител. Свободный цистеин может присутствовать в каркасной области или вариабельной области (напр., в пределах CDR) антитела. В секукинумабе аминокислота восемь L-CDR3, как изложено в SEQ ID NO:6, которая соответствует аминокислоте 97 вариабельной области легкой цепи, как изложено в SEQ ID NO:10 (в данной заявке именуемая далее CysL97) представляет собой свободный цистеин. Каждая молекула секукинумаба содержит два данных свободных цистеиновых остатка - по одному в каждом VL домене. Раскрытые способы способны селективно восстанавливать оба свободных цистеиновых остатка в секукинумабе. В некоторых вариантах осуществления, напр., вследствие делеций и/или замещений в легкой цепи раскрытого антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, свободный цистеин не будет присутствовать в положении CysL97. В данном случае соответствующий свободный цистеин является мишенью реакции селективного восстановления и включен в термин «CysL97».

Антитела против IL-17 и их антигенсвязывающие фрагменты

Различные раскрытые способы относятся к селективному восстановлению определенных антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов (например, секукинумаба). В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), содержащий гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, а указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (VL), содержащий гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', причем указанный CDR1' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, а указанный CDR3' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), содержащий гипервариабельные области CDR1-x, CDR2-x и CDR3-x, где указанная CDR1-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, указанная CDR2-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, а указанная CDR3-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13.

В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один VH домен иммуноглобулина и по меньшей мере один VL домен иммуноглобулина, где: a) VH домен содержит (напр., в последовательности): i) гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, где указанная CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, указанная CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, а указанная CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; или ii) гипервариабельные области CDR1-x, CDR2-x и CDR3-x, где указанная CDR1-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11, указанная CDR2-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:12, а указанная CDR3-x имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13; и b) VL домен содержит (напр., в последовательности) гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', где указанная CDR1' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, указанная CDR2' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, а указанная CDR3' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: a) вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:8; b) вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:10; c) VH домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:8 и VL домен иммуноглобулина содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:10; d) VH домен иммуноглобулина содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, и SEQ ID NO:3; e) VL домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; f) VH домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13; g) VH домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, и SEQ ID NO:3 и VL домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; или h) VH домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13 и VL домен иммуноглобулина, содержащий гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6.

Для удобства ссылок аминокислотные последовательности гипервариабельных областей моноклонального антитела секукинумаб, основанные на определении Кабата и определенные рентгенографическим анализом и с использованием подхода Chothia и его коллег, представлены в таблице 1 ниже.

Легкая цепь
CDR1' Kabat R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A (SEQ ID NO:4)
Chothia R-A-S-Q-S-V-S-S-S-Y-L-A (SEQ ID NO:4)
CDR2' Kabat G-A-S-S-R-A-T (SEQ ID NO:5)
Chothia G-A-S-S-R-A-T (SEQ ID NO:5)
CDR2' Kabat Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T (SEQ ID NO:6)
Chothia Q-Q-Y-G-S-S-P-C-T (SEQ ID NO:6)
Тяжелая цепь
CDR1 Kabat N-Y-W-M-N (SEQ ID NO:1)
CDR1-x Chothia G-F-T-F-S-N-Y-W-M-N (SEQ ID NO:11)
CDR2 Kabat A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y-V-G-S-V-K-G (SEQ ID NO:2)
CDR2-x Chothia A-I-N-Q-D-G-S-E-K-Y-Y (SEQ ID NO:12)
CDR3 Kabat D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W-Y-F-D-L (SEQ ID NO:3)
CDR3-x Chothia C-V-R-D-Y-Y-D-I-L-T-D-Y-Y-I-H-Y-W-Y-F-D-L-W-G (SEQ ID NO:13)

Таблица 1: Аминокислотные последовательности гипервариабельных областей моноклональных антител секукинумаба.

В предпочтительных вариантах осуществления домены константной области предпочтительно также включают подходящие домены константной области человека, например, как описано в «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Kabat E.A. et al., Департамент здравоохранения и социальных служб США, Служба общественного здравоохранения, Национальный институт здравоохранения. ДНК, кодирующая VL секукинумаба, изложена в SEQ ID NO:9. ДНК, кодирующая VH секукинумаба, изложена в SEQ ID NO:7.

В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент (напр., секукинумаб) содержит три CDR SEQ ID NO:10. В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR SEQ ID NO:8. В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR SEQ ID NO:10 и три CDR SEQ ID NO:8. CDR SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:10 можно найти в Таблице 1. Свободный цистеин в легкой цепи (CysL97) можно увидеть в SEQ ID NO:6.

В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь SEQ ID NO:14. В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь SEQ ID NO:15 (с С-концевым лизином или без него). В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь SEQ ID NO:14 и тяжелую цепь SEQ ID NO:15 (с С-концевым лизином или без него). В некоторых вариантах осуществления, антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR SEQ ID NO:14. В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR SEQ ID NO:15. В других вариантах осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR SEQ ID NO:14 и три CDR SEQ ID NO:15. CDR SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:15 можно найти в Таблице 1.

Гипервариабельные области могут быть связаны с любыми видами каркасных областей, хотя предпочтительно они имеют человеческое происхождение. Подходящие каркасные области описаны у Kabat E.A. et al., ibid. Предпочтительный каркас тяжелой цепи представляет собой каркас тяжелой цепи человека, например каркас антитела секукинумаб. Он состоит в последовательности, например, из областей FR1 (аминокислота 1-30 SEQ ID NO: 8), FR2 (аминокислота 36-49 SEQ ID NO: 8), FR3 (аминокислота 67-98 SEQ ID NO: 8) и FR4 (аминокислота 117-127 из SEQ ID NO: 8). Принимая во внимание определенные с помощью рентгеновского анализа гипервариабельные участки секукинумаба, другой предпочтительный каркас тяжелой цепи состоит из последовательности FR1-x (аминокислота 1-25 из SEQ ID NO: 8), FR2-x (аминокислота 36-49 SEQ ID NO: 8), FR3-x (аминокислоты от 61 до 95 SEQ ID NO: 8) и FR4 (аминокислоты от 119 до 127 из SEQ ID NO: 8) областей. Таким же образом каркас легкой цепи состоит из последовательностей FR1'(аминокислоты 1-23 из SEQ ID NO: 10), FR2' (аминокислота 36-50 из SEQ ID NO: 10), FR3'(аминокислоты от 58 до 89 SEQ ID NO: 10) и FR4 '(аминокислота от 99 до 109 SEQ ID NO: 10) областей.

В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент (напр., секукинумаб) выбирают из антител против IL-17 человека, которые содержат по меньшей мере: a) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий вариабельный домен, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3 и константную часть или ее фрагмент тяжелой цепи человека; где указанная CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, указанная CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, а указанная CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; и b) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий вариабельный домен, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области CDR1', CDR2', и CDR3' и константную часть или ее фрагмент легкой цепи человека, где указанная CDR1' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, указанная CDR2' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, а указанная CDR3' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

В одном варианте осуществления антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент выбирают из одноцепочечного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который содержит антигенсвязывающий сайт, содержащий: a) первый домен, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3, где указанная CDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, указанная CDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, а указанная CDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; и b) второй домен, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области CDR1', CDR2' и CDR3', где указанная CDR1' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, указанная CDR2' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, а указанная CDR3' имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6; и c) пептидный линкер, который связан либо с N-концевой частью первого домена и с C-концевой частью второго домена, либо или с C-концевой частью первого домена и с N-концевой частью второго домена.

В качестве альтернативы, антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент, как применяется в раскрытых способах, может включать производное антител против IL-17, изложенное в данной заявке посредством последовательности (напр., пегилированная версия секукинумаба). В качестве альтернативы, VH или VL домен антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, применяемые в раскрытых способах, могут иметь VH или VL домены, которые являются по существу идентичными VH или VL доменам, изложенным в данной заявке (напр., домены, изложенные в SEQ ID NO:8 и 10). Антитело против IL-17 человека, раскрытое в данной заявке, может включать тяжелую цепь, которая по существу идентична тяжелой цепи, изложенной в виде SEQ ID NO:15 (с С-концевым лизином или без него) и/или легкую цепь, которая по существу идентична легкой цепи, изложенной в виде SEQ ID NO:14. Антитело против IL-17 человека, раскрытое в данной заявке, может содержать тяжелую цепь, которая содержит SEQ ID NO:15 (с С-концевым лизином или без него) и легкую цепь, которая содержит SEQ ID NO:14. Антитело человека против IL-17, раскрытое в данной заявке, может включать: a) одну тяжелую цепь, которая содержит вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:8, и константную часть тяжелой цепи человека; и b) одну легкую цепь, которая содержит вариабельный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу идентичную аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:10, и константную часть легкой цепи человека.

В качестве альтернативы, антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент, применяемое в раскрытых способах, может представлять собой вариант аминокислотной последовательности ссылочных антител против IL-17, изложенных в данной заявке, поскольку оно содержит CysL97. Раскрытие также включает антитела против IL-17 или их антигенсвязывающие фрагменты (напр., секукинумаб), в которых один или более аминокислотных остатков VH или VL доменов секукинумаба (но не CysL97), как правило, лишь немногие (напр., 1-10) изменены; например, посредством мутации, напр., сайт-направленного мутагенеза соответствующих последовательностей ДНК. Во всех таких случаях производных и вариантов антитело IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент способны ингибировать активность приблизительно 1 нМ (= 30 нг/мл) человеческого IL-17 в концентрации приблизительно 50 нМ или менее, приблизительно 20 нМ или менее, приблизительно 10 нМ или менее, приблизительно 5 нМ или менее, приблизительно 2 нМ или менее или более предпочтительно приблизительно 1 нМ или менее указанной молекулы на 50%, где указанную ингибирующую активность измеряют на выработку IL-6, индуцированную hu-IL-17 в фибробластах дермы человека, как описано в Примере 1 WO 2006/013107.

В некоторых вариантах осуществления антитела против IL-17 или их антигенсвязывающие фрагменты, напр., секукинумаб, связываются с эпитопом зрелого IL-17 человека, содержащим Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17, напр., секукинумаб, связывается с эпитопом зрелого IL-17 человека, содержащим Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17, напр., секукинумаб связывается с эпитопом гомодимера IL-17, имеющим две цепи зрелого IL-17 человека, где указанный эпитоп содержит Leu74, Tyr85, His86, Met87, Asn88, Val124, Thr125, Pro126, Ile127, Val128, His129 на одной цепь и Tyr43, Tyr44, Arg46, Ala79, Asp80 на другой цепи. Схема нумерации остатков, используемая для определения данных эпитопов, основана на том, что остаток один является первой аминокислотой зрелого белка (т.е., IL-17A, не содержащего N-концевого сигнального пептида из 23 аминокислот и начинающегося с глицина). Последовательность для незрелого IL-17A изложена в записи Swiss-Prot Q16552. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 имеет KD, составляющий приблизительно 100-200 pM. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 имеет IC50, составляющую приблизительно 0,4 нМ для нейтрализации биологической активности in vitro, составляющей приблизительно 0,67 нМ IL-17A человека. В некоторых вариантах осуществления абсолютная биодоступность (подкожно) вводимого антитела против IL-17 имеет диапазон приблизительно 60 - приблизительно 80%, напр., приблизительно 76%. В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17, такое как секукинумаб, имеет период полуэлиминации, составляющий приблизительно 4 недели (напр., от приблизительно 23 до приблизительно 35 дней, от приблизительно 23 до приблизительно 30 дней, напр., приблизительно 30 дней). В некоторых вариантах осуществления антитело против IL-17 (такое как секукинумаб) имеет Tmax, составляющее приблизительно 7-8 дней.

Особенно предпочтительными антителами против IL-17 или их антигенсвязывающими фрагментами, применяемыми в раскрытых способах, являются человеческие антитела, особенно секукинумаб, как описано в примерах 1 и 2 WO 2006/013107. Секукинумаб представляет собой рекомбинантное высокоаффинное полностью человеческое моноклональное антитело против человеческого интерлейкина-17А (IL-17A, IL-17) изотипа IgG1/каппа, который в настоящее время находится в клинических испытаниях для лечения иммуноопосредованных воспалительных состояний. Секукинумаб (см., напр., WO2006/013107 и WO2007/117749) обладает весьма высокой аффинностью для IL-17, т.е. KD, составляющим приблизительно 100-200 пМ, и IC50 для нейтрализации биологической активности in vitro приблизительно 0,67 нМ IL-17A человека, составляющей приблизительно 0,4 нМ. Таким образом, секукинумаб ингибирует антиген в молярном соотношении, составляющем приблизительно 1:1. Данная высокая связывающая аффинность делает антитело секукинумаб особенно подходящим для терапевтического использования. Более того, было определено, что секукинумаб имеет очень длительный период полужизни, т.е. приблизительно 4 недели, что делает возможным продолжительные периоды между введением, исключительное свойство при лечении хронических пожизненных расстройств, таких как ревматоидный артрит.

В данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препаратах указанных выше антител против IL-17 и их антигенсвязывающих фрагментов (напр., секукинумаб). Раскрытые способы обычно могут выполняться на препаратах антител (напр., антител против IL-17, напр., секукинумабе), чтобы снизить стоимость. «Препарат» антител относится к композиции (напр., раствору), имеющей множество молекул антител. «Препарат» содержит любую жидкую композицию, содержащую антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент. Как таковой, препарат может содержать, напр., антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент, напр., секукинумаб, в воде или буфере, в элюате колонки, в диализном буфере и т.д. В некоторых вариантах осуществления первичный препарат антител содержит пул антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов, напр., секукинумаб, в буфере (напр., Трис, напр., 1 мМ - 1 M Трис, pH 6,0-8,0) или в воде для инъекций. Перед добавлением восстанавливающего агента к антителу, препарат может быть отрегулирован посредством изменения уровней растворенного кислорода, раствора pH, концентрации антител и т.д. В некоторых вариантах осуществления перед добавлением восстанавливающего агента концентрацию антител (напр., секукинумаба) в препарате доводят до между приблизительно 4 мг/мл - приблизительно 19,4 мг/мл, напр., приблизительно 10 мг/мл - приблизительно 19,4 мг/мл, приблизительно 10 мг/мл - приблизительно 15,4 мг/мл, приблизительно 12 мг/мл - приблизительно 15 мг/мл или приблизительно 13,5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления перед добавлением восстанавливающего агента процентное насыщение кислорода в препарате доводят по меньшей мере до приблизительно 60% (как измерено с применением кислородного зонда, откалиброванного при 25°C), напр., по меньшей мере до приблизительно 80%. В некоторых вариантах осуществления перед добавлением восстанавливающего агента pH препарата доводят до приблизительно 7,3 - приблизительно 8,5, напр., приблизительно 7,8 - приблизительно 8,2, напр., приблизительно 7,9 - приблизительно 8,1, напр., приблизительно 8,0. Концентрацию антител, pH и уровень кислорода также можно регулировать тотчас после (или даже во время) добавления восстановителя, и таким образом, следует интерпретировать как эквивалентные.

Препараты антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов для применения в раскрытых способах могут быть рекомбинантно продуцированы любыми клетками млекопитающих с применением любой клеточной линии млекопитающих, напр., клеток яичника китайского хомячка (CHO), клеток миеломы мыши NS0, клеток почки новорожденного хомяка (BHK), эмбриональной клеточной линии почки человека HEK-293, клеточной линии сетчатки человека Per.C6 (Crucell, NL), клона клеток HKB11 (полученных от слияния гибридных клеток HEK 293S с лимфомой Беркитта линии 2B8) и т.д. «Рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих» означает, что выработка антител в клетках млекопитающих достигается с применением технологии рекомбинантной ДНК. Препарат антител против IL-17, подвергаемый селективному восстановлению, может представлять собой пул антител, собранных из клеток млекопитающих посредством центрифугирования (с последующим очищением или без него). В качестве альтернативы, препарат антител против IL-17, подвергаемых селективному восстановлению, может представлять собой пул антител из дополнительной стадии нисходящей хроматографии, напр., элюат из колонки для аффинной хроматографии (напр., колонки белка А), анионообменной колонны, анионообменной колонны и т.д. В качестве альтернативы, препарат антител против IL-17, подвергаемых селективному восстановлению, может представлять собой пул антител из стадии нисходящей фильтрации, напр., глубинной фильтрации, нанофильтрации, ультрафильтрации и т.д. В качестве альтернативы, препарат антител против IL-17, подвергаемых селективному восстановлению, может представлять собой пул антител стадии нисходящей фильтрации, где пул обработали для удаления белков клетки-хозяина и/или для инактивации вирусов. В одном варианте осуществления препарат антител против IL-17, подвергаемых селективному восстановлению, представляет собой пул антител элюата белка А.

В зависимости от выбранных условий способа, напр., температуры, продолжительности реакции, рН и т. д., концентрация антител в исходном препарате будет варьировать. В некоторых вариантах осуществления концентрация антител против IL-17, применяемая в исходном препарате составляет от приблизительно 2 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, от приблизительно 3,8 мг/мл до приблизительно 19,5 мг/мл, от приблизительно 4 мг/мл до приблизительно 19,5 мг/мл, от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 19,4 мг/мл, напр., от приблизительно 10 мг/мл до приблизительно 15,4 мг/мл, напр., от приблизительно 12 мг/мл до приблизительно 15 мг/мл, напр., от приблизительно 13,5 мг/мл антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов. Перед селективным восстановлением концентрация антител в первичном препарате антитела может быть отрегулирована при необходимости с применением воды для инъекций (WFI) или наиболее подходящего буфера.

Способы селективного восстановления, описанные в данной заявке, могут быть выполнены в сосуде любого размера. В некоторых вариантах осуществления сосуд имеет лабораторную шкалу (напр., 1 л - 2 л). В других вариантах осуществления сосуд имеет экспериментальный масштаб (напр., 12 л - 20 л). В дополнительных вариантах осуществления сосуд является коммерческого масштаба (напр., более чем 10000 л, напр., 14000 л, 15000 л, 16000 л и т.д.).

Восстанавливающие агенты

Восстанавливающие агенты представляют собой вещества, способные к донорству электронов в редокс (окислительно-восстановительной) реакции. Конкретно, данные агенты применяют для доставки водорода замаскированному (или блокированному) цистеину, присутствующему в антителе против IL-17 или его антигенсвязывающем фрагменте (напр., антителе секукинумаб). В способе, раскрытом в данной заявке, используются восстанавливающие агенты для селективного восстановления антитела против IL-17. Каждый восстанавливающий агент, относящийся к данной заявке, включает его производные (напр., соли, сложные эфиры и амиды). Таким образом, напр., ссылка на «цистеин» включает цистеин и цистеин-HCL, ссылка на «TCEP» включает TCEP и TCEP-HCL, ссылка на тиогликолевую кислоту включает тиогликолят натрия, и т.д. Восстанавливающие агенты для применения в раскрытых способах включают бисульфат натрия, аммиак, триэтилсилан, глицилцистеин, цианоборгидрид натрия, тиогликолят аммония, тиогликолят кальция, тиогликолят натрия, аскорбиновую кислоту, гидрохинон, аминометансульфокислоту, цистеиновую кислоту, цистеинсульфиновую кислоту, этандисульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, гомотаурин, гипотаурин, изетионовую кислоту, меркаптоэтансульфокислоту, N-метилтаурин (MTAU), TCEP (трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид), N-N-диметил-N-N бис(меркаптоацетил)гидразин (DMH), дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол (бета-меркаптоэтанол), 2-меркаптоуксусную кислоту (тиогликолевую кислоту, TGA), цистеин (L-цистеин), цистеамин (бета-меркаптоэтиламин, или MEA), глутатион и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий агент для применения в раскрытом способе представляет собой тиолсодержащий восстанавливающий агент (т.е. соединение, имеющее R-SH группу), напр., сероорганическое соединение. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий агент для применения в раскрытом способе представляет собой, напр., дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, 2-меркаптоуксусную кислоту, цистеин, цистеамин, глутатион и комбинации.

На силу восстанавливающего агента указывает его окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал), E°, который дается в вольтах (В) и традиционно определяется при pH 7,25°C. Например, стандартный окислительно-восстановительный потенциал, E°, для CSH/CSSC приводится в виде приблизительно от -0,20 В до приблизительно -0,23 В (pH 7,25°C) (P. C. Jocelyn (1967) Eu. J. Biochem 2:327-31; Liu «The role of Sulfur in Proteins», in The Proteins, 3rd Ed. (ed. Neurath) p. 250-252 Academic Press 1977). Стандартный окислительно-восстановительный потенциал, E°, DTT приводится в виде приблизительно -0,33 В (pH 7,25°C) (M.J.O'Neil, ed. by (2001). Merck Index: an encyclopedia of chemicals, drugs, & biologicals: 13th ed. (13. ed. ed.) United States: MERCK & CO INC.; Liu, supra). Стандартный окислительно-восстановительный потенциал, E°, глутатиона приводится в виде приблизительно -0,24 В или приблизительно -0,26 В (pH 7, 25°C) (Rost and Rapoport (1964) Nature 201:185; Gilbert (1990) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 63:69-172; Giles (2002) Gen. Physiol Biophys 21:65-72; Liu, supra). Стандартный окислительно-восстановительный потенциал, E°, 2-меркаптоэтанола приводится в виде приблизительно -0,26 В (Lee and Whitesides (1990) J. Org. Chem 58:642-647). В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий агент имеет стандартный окислительно-восстановительный потенциал, E°, аналогичный цистеину (напр., от приблизительно -0,20 В до приблизительно -0,23 В, от приблизительно -0,20 В до приблизительно -0,22 В, от приблизительно -0,20 В до приблизительно -0,21 В, от приблизительно -0,21 В до приблизительно -0,23 В, от приблизительно -0,21 В до -0,22 В, от приблизительно -0,22 В до приблизительно -0,23 В, приблизительно -0,20 В, приблизительно -0,21 В, приблизительно -0,22 В, приблизительно -0,23 В).

Стандартный окислительно-восстановительный потенциал E° тиол-содержащих соединений можно измерять посредством термического анализа, восстановления NAD+, полярографии, реакции с Fe++ или исследований тиол-дисульфидного обмена (Jocelyn, supra; Borsook et al. (1937) J. Biol. Chem 117:281; Ghosh et al. (1932) J. Indian Chem. Soc. 9:43; Kolthoff et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:4739; Tanaka et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:2004; Kolthoff et al. (1955) J. Am. Chem. Soc. 77:4733; Eldjarn (1957) J. Am. Chem. Soc. 79:4589). В некоторых вариантах осуществления стандартный окислительно-восстановительный потенциал E° определяется посредством термического анализа, полярографии, реакции с Fe++ или исследований тиол-дисульфидного обмена, напр., предпочтительно посредством исследований тиол-дисульфидного обмена. В некоторых вариантах осуществления стандартный окислительно-восстановительный потенциал E° определяли при pH 7,25°C.

Восстанавливающий агент, в комбинации с препаратом антитела, образует «восстанавливающую смесь». Восстанавливающая смесь в дополнение к восстанавливающему агенту и антителу против IL-17 может содержать эксципиенты. Например, в определенных вариантах осуществления небольшая молярная доля окисленной формы (напр., цистина, цистамина) восстанавливающего агента может быть добавлена к восстанавливающей смеси либо одновременно с восстанавливающим агентом, либо последовательно, напр., через 10-30 минут или более после начала инкубации. Например, если восстанавливающим агентом является цистеин, то небольшое количество цистина может быть добавлено к восстанавливающей смеси, напр., одновременно с цистеином или, напр., через 15, 20, 30 минут после того, как цистеин скомбинировали с антителом против IL-17 или его антигенсвязывающим фрагментом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления восстанавливающая смесь содержит набор окислительно-восстановительных реагентов. Посредством «набора окислительно-восстановительных реагентов» обозначают редокс-пару или редокс-двойку, т.е., окисляющий и восстанавливающий агент, которые возникают на противоположных сторонах полууравнения (напр., восстанавливающий вид и его соответствующая окисленная форма, напр., Fe2+/Fe3+, цистеин:цистин, цистеамин/цистамин).

В зависимости от условий реакции (температуры, продолжительности реакции, количества антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, pH и т.д.), концентрация восстанавливающего агента, применяемого в конкретной восстанавливающей смеси и реакции селективного восстановления, будет варьировать. В некоторых вариантах осуществления количество восстанавливающего агента, применяемого в восстанавливающей смеси, будет варьировать от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация восстанавливающего агента, задействованного в восстанавливающей смеси, составляет приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 мМ. В одном варианте осуществления количество восстанавливающего агента (напр., цистеина) составляет между приблизительно 4 мМ и приблизительно 8 мМ, напр., 5,9 мМ, 6 мМ, 7,7 мМ, 7,9 мМ, 8 мМ.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой бета-меркаптоэтанол. В определенных вариантах осуществления бета-меркаптоэтанол используют в концентрации, составляющей от приблизительно 2,0 мМ до приблизительно 8,0 мМ.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой глутатион. В определенных вариантах осуществления глутатион используют в концентрации, составляющей от приблизительно 2,0 мМ до приблизительно 5,0 мМ.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет собой цистеамин. В определенных вариантах осуществления цистеамин используют в концентрации, составляющей от приблизительно 1,0 мМ до 20 мМ, от приблизительно 4,0 мМ до приблизительно 19 мМ, от приблизительно 2,0 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 4,0 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 4,8 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 5,5 мМ до приблизительно 6,7 мМ или приблизительно 6,0 мМ.

В одном варианте осуществления восстанавливающий агент представляет цистеин. В определенных вариантах осуществления концентрация цистеина в восстанавливающей смеси составляет от приблизительно 1,0 мМ до 20 мМ, от приблизительно 4,0 мМ до приблизительно 19 мМ, от приблизительно 2,0 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 4,0 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 4,8 мМ до приблизительно 8,0 мМ, от приблизительно 5,5 мМ до приблизительно 6,7 мМ, или приблизительно 6,0 мМ. Концентрация цистеина может быть отрегулирована с применением базового раствора, напр., 120 мМ цистеин-HCL.

Каждое антитело против IL-17 имеет два остатка CysL97, нуждающихся в селективном восстановлении. Вследствие этого, количество задействованного восстанавливающего агента должно быть достаточным для селективного восстановления обоих остатков CysL97 у существенной части антител против IL-17 в препарате антител, без одновременного избыточного восстановления антител посредством необратимого восстановления традиционных дисульфидных связей. В зависимости от условий реакции (присутствия окисляющего агента, температуры, продолжительности реакции, pH и т.д.) молярное соотношение восстанавливающий агент:антитело против IL-17, используемое в конкретной восстанавливающей смеси и реакции селективного восстановления, будет варьировать. Авторы изобретения обнаружили, что молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело (напр., секукинумаб) может находиться в диапазоне от приблизительно 11:1 (Пример 5.2) до приблизительно 546:1 (Пример 6.2). В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело (напр., секукинумаб) составляет между приблизительно 11:1 и приблизительно 462:1 (напр., приблизительно 21:1), от приблизительно 31:1 до приблизительно 545:1 (напр., от приблизительно 31:1 до приблизительно 156:1), от приблизительно 21:1 до приблизительно 296:1 или от приблизительно 46:1 до приблизительно 91:1. В других вариантах осуществления молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело (напр., секукинумаб) составляет между приблизительно 23:1 и приблизительно 91:1 (напр., от приблизительно 23:1 до приблизительно 57:1), от приблизительно 44:1 до приблизительно 275:1 (напр., приблизительно 44:1), от приблизительно 44:1 до приблизительно 66:1 (напр., от приблизительно 44:1 до приблизительно 66:1), предпочтительно от приблизительно 46:1 до приблизительно 118:1 (напр., от приблизительно 56:1 до приблизительно 118:1), более предпочтительно от приблизительно 54:1 до приблизительно 82:1. В одном варианте осуществления молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело (напр., секукинумаб) составляет приблизительно 66:1.

Если используется более высокое молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело (напр., секукинумаб) (представляющее избыточный восстанавливающий агент по сравнению с антителом), то добавление небольшого количества соответствующего окисляющего агента (напр., цистина или цистамина) может быть полезным для смягчения восстановительной силы восстанавливающего агента (напр., цистеина или цистеамина). Это является особенно полезным в анаэробной среде. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления селективное восстановление выполняется с применением набора окислительно-восстановительных реагентов (напр., в аэробной или анаэробной среде, предпочтительно анаэробной среде). В некоторых вариантах осуществления селективное восстановление выполняется с применением молярного соотношения восстанавливающий агент (напр., цистеин):окисляющий агент (напр., цистин), составляющего от приблизительно 2:1 до приблизительно 80:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 80:1, от приблизительно 26:1 до приблизительно 80:1, от приблизительно 2:1 до приблизительно 10:1 (напр., от приблизительно 6:1 до приблизительно 10:1), от приблизительно 4:1 до приблизительно 28:1 (от приблизительно 4:1 до приблизительно 18:1), от приблизительно 27:1 до приблизительно 53:1 (напр., приблизительно 27:1) в восстанавливающей смеси. В определенных вариантах осуществления цистеин применяют в восстанавливающей смеси в комбинации с окисляющим агентом цистином или цистамином (предпочтительно цистином). В некоторых вариантах осуществления селективное восстановление выполняется в условиях с применением приблизительно 4 мМ-14 мМ цистеина (напр., от приблизительно 7,7 мМ до приблизительно 8,0 мМ цистеина) и от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мМ цистина (напр., приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3 мМ цистина) в восстанавливающей смеси. В определенных вариантах осуществления восстанавливающая смесь содержит приблизительно 8,0 мМ цистеина и приблизительно 0,1 мМ цистина, приблизительно 7,9 мМ цистеина и приблизительно 0,1 мМ цистина или приблизительно 7,7 мМ цистеина и приблизительно 0,3 мМ цистина. Должно быть понятно, что если окисляющий агент, напр., цистин, используют в комбинации с восстанавливающим агентом, напр., цистеином, в раскрытом способе, окисляющий агент, напр., цистин, может быть добавлен в момент после того, как восстанавливающий агент, напр., цистеин, скомбинировали с антителом против IL-17 или его антигенсвязывающим фрагментом. Например, антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть скомбинированы с цистеином для образования восстанавливающей смеси, которую затем инкубируют в течение, напр., 15-30 минут; в дальнейшем в реакцию может быть добавлен цистин.

Растворенный кислород

Как используется в данной заявке, «растворенный кислород», «dO2» и «DO» относится к количеству кислорода, которое растворено или содержится в заданной среде. Его можно измерить кислородным зондом, таким как кислородный датчик или оптод в жидких средах. О DO сообщается либо в виде концентрации (миллиграммы на литр (мг/л)), либо в виде «процента насыщения». Миллиграммы на литр представляют собой количество кислорода в литре растворителя, а также являются эквивалентным частям на миллион=ч./млн. Процент насыщения кислорода представляет собой количество кислорода в растворе по отношению к общему количеству кислорода, которое раствор может содержать при конкретной температуре.

Как используется в данной заявке, «начальный процент насыщения кислорода» относится к количеству растворенного кислорода в препарате антител против IL-17 (напр., секукинумабе) перед введением препарата в контакт с восстанавливающим агентом в сосуде для образования восстанавливающей смеси. Начальный процент насыщения кислородом можно регулировать непосредственно (напр., посредством разбрызгивания) или опосредованно (напр., с помощью перемешивания), чтобы достичь желаемого уровня кислорода перед началом способа селективного восстановления. Например, в некоторых вариантах осуществления начальный процент насыщения кислородом в препарате антител против IL-17 перед контактом с восстанавливающим агентом регулируют по меньшей мере до 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или даже до величины 100%. Это можно сделать с целью изначально смягчить силу восстанавливающего агента, как только агент добавляют в препарат антител против IL-17 для образования восстанавливающей смеси, что предупреждает частичное или полное восстановление традиционных дисульфидов антитела, что в ином случае могло бы привести к потере активности и чистоты. В предпочтительных вариантах осуществления начальный процент насыщения кислородом в препарате антител против IL-17 регулируют по меньшей мере до 60% (как измерено с применением кислородного зонда, откалиброванного при 25°C). В предпочтительных вариантах осуществления начальный процент насыщения кислородом в препарате антител против IL-17 регулируют по меньшей мере до 80% (как измерено с применением кислородного зонда, откалиброванного при 25°C).

Авторы изобретения определили, что повышенные уровни кислорода во время стадии обработки цистеином оказывают вредное воздействие на активность антител, что, вероятно, связано с кислородом, прекращающим действие восстановительной силы цистеина, что приводит к недостаточному восстановлению C97 секукинумаба. Эту проблему поглощения кислорода из атмосферы можно регулировать посредством варьирования количества восстанавливающего агента, варьирования молярного соотношения восстанавливающий агент:антитело с применением определенных скоростей перемешивания или даже использования прерываний при перемешивании, особенно при работе в масштабе производства. Должно быть понятно, что более высокие количества восстанавливающего агента (напр., цистеина) способны к переработке более высоких уровней кислорода в восстанавливающей смеси. В некоторых вариантах осуществления во время стадии инкубации способа селективного восстановления, насыщение кислородом в восстанавливающей смеси в целом сохраняется при низком процентом содержании (напр., менее чем приблизительно 40%, менее чем приблизительно 30%, менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 10%, менее чем приблизительно 5%).

Потеря восстановительной силы восстанавливающего агента (напр., цистеина), вероятно, приводит к неполному разблокированию CysL97-SH в более ранних моментах времени во время стадии инкубации, а в отсутствии остаточного восстанавливающего агента (напр., цистеина), способного к защите разблокированного Cys97L на более поздних частях стадии инкубации (либо во время стадии охлаждения), может возникнуть повторное окисление разблокированного Cys97L-SH. Вследствие этого, в идеале, низкий процент насыщения кислородом будет сохраняться в течение по меньшей мере от приблизительно 60 минут до приблизительно 330 минут, напр., по меньшей мере приблизительно 60 минут, по меньшей мере приблизительно 90 минут, по меньшей мере приблизительно 120 минут, по меньшей мере приблизительно 150 минут, по меньшей мере приблизительно 180 минут, по меньшей мере приблизительно 210 минут, по меньшей мере приблизительно 240 минут, по меньшей мере приблизительно 270 минут, по меньшей мере приблизительно 300 минут, или по меньшей мере приблизительно 330 минут. В некоторых вариантах осуществления данный низкий процент насыщения кислородом будет сохраняться в течение всей стадии инкубации, а также части стадии охлаждения.

Процент насыщения кислородом можно регулировать непосредственно (напр., посредством разбрызгивания) или опосредованно (напр., посредством перемешивания), чтобы достичь желаемого уровня кислорода во время инкубации восстанавливающей смеси. В аэробной среде низкий процент насыщения кислородом можно достичь посредством применения периодического (а не непрерывного) перемешивания восстанавливающего раствора, напр., <15 мин/ч, напр., <2 мин/ч, или посредством применения непрерывного перемешивания с низкой скоростью вращения. В анаэробной среде кислород не присутствует (либо присутствует небольшое количество), что может приводить к расходу восстанавливающего агента.

Объемный коэффициент массопереноса кислорода (kLa*)

Когда селективное восстановление проводят в аэробных условиях, уровень кислорода в реакции регулируют не непосредственно, а через другие технологические параметры, напр., скорость перемешивания. Физическая настройка каждой реакции также влияет на уровень кислорода, присутствующего в реакционной смеси. Вследствие этого, важно определить переменную, которую можно применять для сравнения кислорода, перенесенного в раствор между физическими настройками и во время конкретных этапов процессинга антитела - данной переменной является «kLa*» (см., напр., Garcia-Ochoa and Gomez (2009) Biotechnology Advances 27:153-176; Bandino et al. (2001) Biochem. Engineering J. 8:111-119; Juarez and Orejas (2001) Latin Am. Appl. Res. 31:433-439; Yange and Wang (1992) Biotechnol. Prog. 8:244-61). KLa* представляет количество кислорода, перенесенного в раствор с течением времени через пространство над продуктом без разбрызгивания. Данное значение является специфическим для каждой настройки и масштаба, и зависит от типа мешалки, скорости мешалки, объема наполнения и площади поверхности раствора в контакте со свободным пространством над продуктом, которое зависит от индивидуальной геометрии каждого сосуда. Несмотря на то, что kLa* каждой физической настройки отличается, поскольку уровень кислорода в растворе во время способа селективного восстановления действует на активность и целостность секукинумаба, авторы изобретения ожидают, что способ селективного восстановления при выполнении в системах, демонстрирующий сходные диапазоны kLa*, будет приводить к препаратам секукинумаба, имеющим схожее качество.

Как используется в данной заявке, термин «система» охватывает как физическую настройку (сосуд, тип перемешивания и т.д.), так и технологические условия (объем наполнения, скорость вращения и т.д.), которые влияют на перенос кислорода в раствор с течением времени через пространство над продуктом без разбрызгивания, т.е. масштаб, скорость мешалки, объем наполнения, площадь поверхности раствора в контакте с пространством над продуктом, на которое влияет индивидуальная геометрия каждого сосуда, и т.д.

Как используется в данной заявке, термин «сосуд» обозначает любой контейнер, в котором имеет место реакция селективного восстановления. Сосуды включают, без ограничения, биореакторы (напр., стальной смесительный бак одноразового или многоразового использования и т.д.), применяемые в экспериментальных и промышленных масштабах производства антител, а также обычные лабораторные контейнеры, такие как колбы, пробирки и т.д. В некоторых вариантах осуществления сосуд представляет собой биореактор, способный поддерживать объем, составляющий по меньшей мере приблизительно 2 литра, по меньшей мере приблизительно 100 литров, по меньшей мере приблизительно 500 литров, по меньшей мере приблизительно 1000 литров, по меньшей мере приблизительно 2000 литров, по меньшей мере приблизительно 5000 литров, по меньшей мере приблизительно 10000 литров, по меньшей мере приблизительно 15000 литров или более.

KLa* не может быть определен непосредственно в экспериментах по переносу кислорода. Вместо этого dO2 в тестируемом растворе заменяют азотом, а увеличение dO2 во времени отслеживают с помощью калиброванного зонда dO2, что позволяет создать экспериментальную кривую dO2. В дальнейшем значения kLa*, применяемые в данной заявке, рассчитывают для конкретных систем посредством адаптации экспериментальной кривой dO2 к кривой насыщения (напр., с применением Mathcad®), в соответствии с уравнением, показанным ниже:

DO=C×(1-e-kLa*×(t-t0)), где DO=измеренное значение растворенного кислорода, C представляет собой значение насыщения кислородом (означает 100% при бесконечном перемешивании и достижении насыщения), число Эйлера e=2,718281…., t=временная точка, соответствующая значению DO, а t0=начальная временная точка.

Уравнение представляет интегральную форму эмпирической формулы, установленной для определения переноса кислорода в растворы (значение kLa*). Формула была подтверждена разными авторами в различных экспериментах (Doran, P. M. 1995. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, San Diego, California).

Авторы изобретения определили, что стадии нагревания и охлаждения способа селективного восстановления в целом более переносимы с более высоким kLa*, чем стадия инкубации. Это связано с тем, что повышенные уровни кислорода во время стадии инкубации могут оказывать вредное воздействие на активность антитела, что, вероятно, обусловлено увеличенным переносом кислорода, прекращающего действие восстановительной силы восстанавливающего агента (напр., цистеина), приводя к недостаточному восстановлению C97 секукинумаба. В аэробной среде повышение скорости перемешивания (или времени перемешивания) в восстанавливающей смеси во время способа селективного восстановления повышает kLa*. Непрерывное перемешивание восстанавливающей смеси, которое приводит к более высоким значениям kLa*, может выдерживаться во время стадий нагревания и охлаждения. В некоторых вариантах осуществления kLa* во время стадий нагревания и охлаждения (раздельно) может составлять от приблизительно 0,12 ч-1 до приблизительно 1,69 ч-1, от приблизительно 0,08 ч-1 до приблизительно 0,69 ч-1, от приблизительно 0,24 ч-1 до приблизительно 0,44 ч-1, от приблизительно 0,39 ч-1 до приблизительно 0,69 ч-1. В некоторых вариантах осуществления kLa* в системе во время стадии нагревания или охлаждения составляет ≤ приблизительно 0,69 ч-1, где указанный kLa* вычисляют посредством адаптации кривой насыщения к кривой растворенного кислорода.

Предпочтительно сохранять kLa* более низким во время стадии инкубации с применением, напр., непрерывного перемешивания с низкими скоростями вращения, или, предпочтительно, прерывистого перемешивания. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающую смесь инкубируют при сохранении объемного коэффициента массопереноса кислорода (kLa*) в системе, составляющего ≤ приблизительно 0,37 ч-1, ≤ приблизительно 0,27 ч-1 или ≤ приблизительно 0,18 ч-1, где указанный kLa* вычисляют посредством адаптации кривой растворенного кислорода к кривой насыщения. Если kLa* в системе во время стадии инкубации реакции селективного восстановления составляет менее чем (<) 0,37 ч-1, то молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело может варьировать между 46,11:1 (приблизительно 46:1) и 118,36:1 (приблизительно 118:1) (и для более короткого, и для более длинного времени инкубации, напр., от приблизительно 210 до приблизительно 330 минут). kLa* в системе во время стадии инкубации реакции селективного восстановления может составлять до (≤) 0,37 ч-1, если молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):белок составляет между 69,89:1 (приблизительно 70:1) и 118,36:1 (приблизительно 118:1) (для более короткого времени инкубации, напр., вплоть до приблизительно 240 минут культивирования) или между 76,85 (приблизительно 77:1) и 118,36:1 (приблизительно 118:1) (для более длительного времени инкубации, напр., вплоть до приблизительно 300 минут инкубации).

Способ селективного восстановления целиком (т.е. стадия нагревания, стадия инкубации и стадия охлаждения) обычно может выполняться с применением kLa*, составляющего < 0,37 ч-1, который включает время инкубации от приблизительно 210 до приблизительно 330 минут (напр., время инкубации от приблизительно 240 минут до 300 минут), если молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело составляет между приблизительно 46:1 и приблизительно 118:1. Способ селективного восстановления целиком (т.е. стадия нагревания, стадия инкубации и стадия охлаждения) обычно может выполняться с применением kLa*, составляющего < 0,37 ч-1, если молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело составляет между приблизительно 70:1 и приблизительно 118:1, а инкубация занимает до приблизительно 240 минут; или если молярное соотношение восстанавливающий агент (напр., цистеин):антитело составляет между приблизительно 77:1 и приблизительно 118:1, а инкубация занимает до приблизительно 300 минут.

Дополнительные Компоненты Способа

Настоящее раскрытие предоставляет способ селективного восстановления CysL97 в определенных антителах против IL-17, таких как секукинумаб, включающий приведение антитела в контакт с восстанавливающим агентом для образования восстанавливающей смеси. Должно быть понятно, что восстанавливающая смесь может содержать компоненты в дополнение к антителу против IL-17 или его антигенсвязывающему фрагменту и восстанавливающему агенту. Восстанавливающая смесь может содержать водный компонент (напр., буфер, такой как Трис-буфер), а также реагенты, применяемые для увеличения или уменьшения pH восстанавливающей смеси, соль, ЭДТА и т.д. Таким образом, при том, что восстанавливающая смесь обязательно будет содержать антитело против IL-17 (напр., секукинумаб) и восстанавливающий агент, восстанавливающая смесь может содержать или не содержать дополнительные компоненты. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающая смесь содержит металлохелатор (напр., ЭДТА, DMSA, DMPS). В некоторых вариантах осуществления восстанавливающая смесь содержит от 1,3 мМ до приблизительно 0,8 мМ, от приблизительно 1,1 до приблизительно 0,9 мМ или приблизительно 1,0 мМ ЭДТА (напр., ди-Na-ЭДТА).

В зависимости от условий реакции (температуры, продолжительности реакции, количества антитела против IL-17, концентрации восстанавливающего агента, соотношения восстанавливающий агент:антитело и т.д.), pH конкретного препарата антитела может варьировать. Однако признано, что в зависимости от условий реакции, описанных в данной заявке, данные условия могут варьировать с целью достижения желаемого селективного восстановления. В некоторых вариантах осуществления pH препарата антитела перед контактом с восстанавливающим агентом будет варьировать от приблизительно 6,5 до приблизительно 9,5, напр., от приблизительно 7 до приблизительно 9. В других вариантах осуществления pH препарата антитела будет составлять от приблизительно 7,4 до приблизительно 8,5, от приблизительно 7,8 до приблизительно 8,2, от приблизительно 7,9 до приблизительно 8,1 или приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления pH препарата антитела может быть отрегулирован (напр., после газирования для регулирования начального процента насыщения кислородом) с применением буфера, напр., 1M Трис-буфера (напр., 1M Трис-буфера с pH 10,8).

После введения препарата, содержащего антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент (напр., секукинумаб), в контакт с восстанавливающим агентом может иметь место начальное восстановление уровня интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента (HLLH). Термин «интактное» относится к антителу, имеющему все консервативные дисульфидные мостики (напр., 14 консервативных дисульфидных мостиков в случае классического антитела IgG1). Образование различных фрагментов антитела против IL-17, т.е., H2L, HL2, HL, H и L полос, а также интактных полос H2L2 (HHLL) можно определить с применением различных инструментов для анализа, известных в данной области (таких как ДСН-ПААГ-электрофорез, катионообменная ВЭЖХ). Предпочтительно, уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в смеси измеряют посредством капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия (CE-SDS). CE-SDS разделяет белки в соответствии с их молекулярными размерами в электрическом поле. CE-SDS при невосстанавливающих условиях можно применять для оценки вариантов размеров в препарате антител. В некоторых вариантах осуществления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в смеси снижается по меньшей мере до приблизительно 80%, как измерено согласно CE-SDS, в пределах приблизительно 1-30 минут (напр., приблизительно 15 минут) после добавления восстанавливающего агента к препарату антитела. В некоторых вариантах осуществления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в смеси снижается по меньшей мере до приблизительно 83%, как измерено согласно CE-SDS. В некоторых вариантах осуществления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в смеси снижается до между приблизительно 75% и приблизительно 87%. В некоторых вариантах осуществления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в смеси снижается по меньшей мере до приблизительно 38, 39, 40, 41, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 или 87%, как измерено согласно CE-SDS.

Анализы CE-SDS могут быть выполнены с применением системы капиллярного электрофореза Beckman Coulter PA-800. Для анализов используются непокрытые капилляры из плавленого кварца с внутренним диаметром, составляющим 50 мкм и длиной, составляющей 30 см (с 20 см и 10 см диапазонами разделения для анализов CE-SDS в восстанавливающих условиях и CE-SDS в невосстанавливающих условиях, соответственно). Разделение контролируется УФ-детектором при 214 нм. Для анализа CE-SDS в невосстанавливающих условиях образцы антител разводят до 6,0 мг/мл водой, тщательно смешивают с буфером для образца CE-SDS в невосстанавливающих условиях (0,1 M Трис/1,0% SDS, pH 7,0) и 250 мМ иодацетамидом, в соотношении, составляющем 20/75/5 (о/о/о), и нагревают при 70°C в течение 10 минут для предотвращения перестановки дисульфидных мостиков. Температуру капилляров устанавливают при 25°C для разделения. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 15 кВ в режиме нормальной полярности в течение 20 минут.

В некоторых вариантах осуществления восстанавливающую смесь нагревают. В некоторых вариантах осуществления нагревание происходит перед стадией инкубации. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающую смесь нагревают до температуры между приблизительно 32°C и приблизительно 42°C, до между приблизительно 35°C и приблизительно 39°C, до приблизительно 37°C. В некоторых вариантах осуществления нагревание происходит в течение от приблизительно 30 до приблизительно 120 минут, от приблизительно 45 до приблизительно 90 минут, от приблизительно 45 до приблизительно 75 минут, приблизительно 60 минут. Во время нагревания восстанавливающую смесь можно перемешивать, напр., постоянно или с перерывами, с применением любых средств для перемешивания. Перемешивание может быть осевым (напр., с применением крыльчатки с наклонными лопастями) или радиальным (напр., с применением турбинной мешалки Раштона). В некоторых вариантах осуществления во время нагревания восстанавливающую смесь постоянно перемешивают при 65-200 об/мин (напр., 50 об/мин, 65 об/мин, 75 об/мин, 85 об/мин, 100 об/мин или 200 об/мин).

Во время стадии инкубации, восстанавливающую смесь будут, как правило, инкубировать в течение предварительно заданного времени, чтобы сделать возможным селективное восстановление свободного цистеина (напр., свободного цистеина секукинумаба). В некоторых вариантах осуществления культивирование происходит после нагревания восстанавливающей смеси. В зависимости от условий реакции (восстанавливающего агента, температуры, количества антител против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, pH и т.д.) предварительно заданное времени для культивирования восстанавливающей смеси будет варьировать. В некоторых вариантах осуществления время будет варьировать между приблизительно 1 и 24 часами (напр., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 18, 20 или 24 часа). В некоторых вариантах осуществления инкубацию проводят в течение от приблизительно 200 до приблизительно 500 минут, от приблизительно 210 до приблизительно 420 мин, от приблизительно 210 до приблизительно 330 минут, от приблизительно 240 до приблизительно 300 минут, приблизительно 250 минут.

Во время стадии инкубации инкубация будет проводиться при предварительно заданной температуре, чтобы сделать возможным селективное восстановление намеченного свободного цистеина (напр., CysL97 в антигенсвязывающих участках секукинумаба). В зависимости от условий реакции (восстанавливающего агента, времени, количества антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента, pH и т.д.) температура инкубации будет варьировать. В некоторых вариантах осуществления предварительно заданная температура будет варьировать между приблизительно 20 и приблизительно 42°C. В некоторых вариантах осуществления предварительно заданная температура будет составлять приблизительно 32°C - приблизительно 42°C, между приблизительно 35°C - приблизительно 39°C или приблизительно 37°C.

Во время стадии инкубации восстанавливающую смесь можно будет перемешивать для обеспечения однородности продукта в то время как восстановитель инкубируют с препаратом антител против IL-17, напр., секукинумабом. Однако во время данной части реакции селективного восстановления уровень кислорода в сосуде должен оставаться низким, чтобы позволить восстанавливающему агенту эффективно избирательно восстанавливать CysL97 в антителах против IL-17. В аэробных условиях низкий кислород может быть достигнут посредством избегания непрерывного перемешивания, напр., посредством применения прерывистого перемешивания, напр., ≤15 мин/ч, напр., ≤2 мин/ч. В анаэробных условиях перенос кислорода ограничен и поэтому перемешивание может продолжаться в течение более длительных периодов времени или может быть непрерывным. Более того, в анаэробных условиях строгий контроль переноса кислорода (напр., посредством регулируемого разбрызгивания) также позволил бы использовать более длительные периоды времени перемешивания (включая непрерывное перемешивание).

В некоторых вариантах осуществления смесь охлаждают после стадии инкубации. В некоторых вариантах осуществления смесь охлаждают до комнатной температуры (напр., температуры между приблизительно 16°C и приблизительно 28°C). В некоторых вариантах осуществления охлаждение происходит в течение от приблизительно 30 до приблизительно 120 минут, от приблизительно 45 до приблизительно 90 минут, от приблизительно 45 до приблизительно 75 минут, приблизительно 60 минут. Во время охлаждения восстанавливающую смесь можно перемешивать, напр., постоянно или прерывисто с применением любых средств в течение перемешивания. Перемешивание может быть осевым (напр., с применением крыльчатки с наклонными лопастями) или радиальным (напр., с применением турбинной мешалки Раштона). В некоторых вариантах осуществления во время охлаждение восстанавливающую смесь постоянно перемешивают при 65-200 об/мин (напр., 50 об/мин, 65 об/мин, 75 об/мин, 85 об/мин, 100 об/мин или 200 об/мин).

Реакция селективного восстановления может быть остановлена, напр., с применением йодоацетамида или О-фосфорной кислоты (напр., с применением базового раствора 0,3 M О-фосфорной кислоты). В некоторых вариантах осуществления остановка происходит после стадии охлаждения. В некоторых вариантах осуществления реакцию селективного восстановления останавливают посредством регулирования рН смеси до между приблизительно 5,0 и приблизительно 5,5, приблизительно 5,1 и приблизительно 5,3, приблизительно 5,2. Регулирование pH можно достичь с применением О-фосфорной кислоты.

Фраза «очищенный препарат» относится к смеси антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов, которые подвергли селективному восстановлению. После завершения селективного восстановления будет происходить повышение уровня интактных антител против IL-17 в очищенном препарате. Уровень интактных антител в очищенном препарате после селективного восстановления может быть измерен посредством различных хорошо известных методик (напр., SDS PAGE в невосстанавливающих условиях, капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия, эксклюзионная хроматография (SEC), ВЭЖХ). В некоторых вариантах осуществления уровень интактного антитела измеряют согласно CE-SDS. В некоторых вариантах осуществления после завершения селективного восстановления (напр., после стадии охлаждения) уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 80%, как измерено согласно CE-SDS. В некоторых вариантах осуществления после селективного восстановления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно 100%, как измерено согласно CE-SDS. В некоторых вариантах осуществления после селективного восстановления уровень интактного антитела против IL-17 или его антигенсвязывающего фрагмента в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%, как измерено согласно CE-SDS.

Активность (напр., аффинность, биологическая активность и т.д.) антител в препарате перед селективным восстановлением, во время селективного восстановления или после селективного восстановления (т.е. в очищенном препарате) может быть измерена посредством различных хорошо известных методик (см., напр., WO2006/013107; WO2007/117749; Shen and Gaffen (2008) Cytokine. 41(2): 92-104). В определенных вариантах осуществления активность измеряют с применением анализа на основе ELISA или клеточного анализа (напр., ингибирование IL-17-IL-6 или GRO-альфа из, напр., хондоцитов C-20/A4 или клеточной линии BJ). В некоторых вариантах осуществления активность измеряют посредством способа катионообменной хроматографии с цистамином (катионообменной хроматографии). Способ катионообменной хроматографии с цистамином включает дериватизацию антитела цистамином (2,2'-дитиобис (этиламин)) с последующим аналитическим разделением с использованием катионообменной хроматографии (CEX). Поскольку активность антител, раскрытых в данной заявке (напр., секукинумаба), снижается, если CysL97 находится в окисленной форме, дериватизация CysL97 цистамином служит в качестве прокси для измерения активности антител, т.е. если селективное восстановление достигает успеха, тогда восстановленный CysL97 может быть дериватизирован цистамином, тогда как если селективное восстановление не удается, тогда окисленный CysL97 не может быть дериватизирован цистамином. Дериватизация цистамином приводит к добавлению одного положительного заряда на свободный Cys97 остаток. Полученные дериватизированные формы секукинумаба (например, заряд +2, +1) затем могут быть отделены от недериватизированной формы и количественно определены посредством катионообменной хроматографии. В теории дериватизированная цистамином молекула секукинумаба с двумя связями цистамина с неспаренным Cys97 на обеих легких цепях может считаться 100% биологически активной. Дериватизированная цистамином молекула секукинумаба с добавлением одной связи цистамина с неспаренным Cys97 в одной из легких цепей может считаться биологически активной на 50%. Дериватизированная цистамином молекула секукинумаба без какой-либо связи цистамина с молекулой может считаться биологическая неактивной. Уровень дериватизации цистамином в препарате антител (напр., препарата антител секукинумаба), при сравнении с теоретически максимальным уровнем дериватизации цистамином в таком препарате (напр., выражаемого в виде процентной доли теоретического максимума) тогда можно применять в качестве меры активности препарата.

Кратко катионообменная хроматография с цистамином может быть выполнена следующим образом. Образцы антитела (50 мкг) сначала обрабатывают карбоксипептидазой B (1:40, о:о) для удаления С-концевого лизина в тяжелой цепи, а затем дериватизируют с 4 мМ цистамина в 5 мМ ацетате натрия, 0,5 мМ ЭДТА, pH 4,7 при комнатной температуре в течение 2 часов. Дериватизацию останавливают посредством добавления 2 мкл 1 M ортофосфорной кислоты. Катионообменную хроматографию проводят на образцах дериватизированного цистамином антитела с применением аналитической колонки ProPac™ WCX-10 (4 мМ x 250 мМ, Dionex). Для разделения применяют градиент от 12,5 мМ до 92,5 мМ хлорида натрия в 25 мМ фосфате натрия, pH 6,0 при скорости потока, составляющей 1,0 мл/мин. Абсорбцию при 220 нМ регистрировали посредством UV-детектора (Agilent HPLC 1200).

Некоторые первичные препараты антитела против IL-17 с окисленным свободным цистеином имеют уровни активности до 45%. В некоторых вариантах осуществления перед инициированием способа селективного восстановления уровень активности антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов в препарате составляет менее чем приблизительно 80%, менее чем приблизительно 75%, менее чем приблизительно 70%, менее чем приблизительно 65%, менее чем приблизительно 60%, менее чем приблизительно 55%, менее чем приблизительно 50% или менее чем приблизительно 45% (напр., как измерено посредством способа катионообменной хроматографии с цистамином). Во время селективного восстановления уровень активности антител против IL-17 в очищенном препарате будет повышаться. В некоторых вариантах осуществления уровень активности антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов в препарате антитела повышается по меньшей мере приблизительно на 15 процентных пунктов (напр., от приблизительно 60% до по меньшей мере приблизительно 75%), по меньшей мере приблизительно на 20 процентных пунктов (напр., от приблизительно 60% до по меньшей мере приблизительно 80%), по меньшей мере приблизительно на 25 процентных пунктов (напр., от приблизительно 60% до по меньшей мере приблизительно 85%) или по меньшей мере приблизительно на 30 процентных пунктов (напр., от приблизительно 60% до по меньшей мере приблизительно 90%) в течение приблизительно 60 минут после введения препарата антитела в контакт с восстанавливающим агентом для образования восстанавливающей смеси (напр., как измерено посредством способа катионообменной хроматографии с цистамином).

После селективного восстановления очищенный препарат будет обогащен антителами против IL-17, имеющими восстановленную форму CysL97, и будет демонстрировать увеличенный уровень активности по отношению к первоначальному препарату. В некоторых вариантах осуществления после завершения селективного восстановления уровень активности антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 80% (по отношению к теоретическому максимуму), как измерено посредством катионообменной хроматографии с цистамином, ELISA или клеточного анализа (напр., анализа катионообменной хроматографии с цистамином). В некоторых вариантах осуществления после завершения селективного восстановления уровень активности антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 80, 81 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99 или приблизительно 100%, как измерено посредством катионообменной хроматографии, ELISA или клеточного анализа (напр., анализа катионообменной хроматографии с цистамином). В некоторых вариантах осуществления после завершения селективного восстановления уровень активности антител против IL-17 или их антигенсвязывающих фрагментов в очищенном препарате составляет по меньшей мере приблизительно 93%, как измерено посредством катионообменной хроматографии с цистамином, ELISA или клеточного анализа (напр., анализа катионообменной хроматографии с цистамином).

Соответственно, в данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препарате антител против IL-17, которые были рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих, включающие:

а) приведение препарата в контакт по меньшей сере с одним восстанавливающим агентом в системе для образования восстанавливающей смеси; и

b) инкубацию восстанавливающей смеси при сохранении объемного коэффициента массопереноса кислорода (kLa*) в системе, составляющего ≤ приблизительно 0,37 ч-1, где указанный kLa* вычисляют посредством адаптации кривой растворенного кислорода к кривой насыщения;

где каждое антитело против IL-17 содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), содержащий три участка, определяющих комплементарность (CDR) VH, как изложено в виде SEQ ID NO:8, и вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий три CDR VL, как изложено в виде SEQ ID NO:10, и кроме того где перед стадией a) начальный процент насыщения кислородом в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 60%, как измерено с применением кислородного зонда, откалиброванного при 25°C.

Также в данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препарате антител против IL-17, которые были рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих, включающие:

a) приведение препарата в контакт с набором окислительно-восстановительных реагентов, выбранных из цистеина/цистина и цистеина/цистамина для образования восстанавливающей смеси; и

b) инкубацию восстанавливающей смеси при температуре приблизительно 37°C в анаэробных условиях в течение по меньшей мере приблизительно 4 часов, или инкубацию восстанавливающей смеси при температуре приблизительно 18-24°C в течение приблизительно 16-24 часов;

где каждое антитело против IL-17 содержит вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (VH), содержащий три участка, определяющие комплементарность (CDR) VH, как изложено в виде SEQ ID NO:8, и вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий три CDR VL, как изложено в виде SEQ ID NO:10.

Также в данной заявке раскрыты способы селективного восстановления CysL97 в препарате антитела секукинумаба, которые были рекомбинантно продуцированы клетками млекопитающих, включающие:

а) регулирование концентрации секукинумаба в препарате до между приблизительно 4 мг/мл - приблизительно 19,4 мг/мл, напр., приблизительно 10 мг/мл - приблизительно 19,4 мг/мл, напр., приблизительно 10 - приблизительно 15,4, напр., приблизительно 12 мг/мл - приблизительно 15 мг/мл, напр., приблизительно 13,5 мг/мл;

b) регулирование процентного насыщения кислорода в препарате до по меньшей мере приблизительно 60%, напр., по меньшей мере приблизительно 80%;

с) регулирование рН препарата до приблизительно 7,4 - приблизительно 8,5, напр., приблизительно 7,8 - приблизительно 8,2, напр., приблизительно 7,9 - приблизительно 8,1, напр., приблизительно 8,0;

d) приведение препарата в контакт с цистеином в сосуде для образования восстанавливающей смеси, где концентрация цистеина в восстанавливающей смеси составляет приблизительно 4,0 мМ - приблизительно 8,0 мМ, напр., приблизительно 4,8 мМ - приблизительно 8,0 мМ, напр., приблизительно 5,5 мМ - приблизительно 6,7 мМ, напр., приблизительно 6,0 мМ;

е) нагревание восстанавливающей смеси до температуры между приблизительно 32°C - приблизительно 42°C, напр., до между приблизительно 35°C - приблизительно 39°C, напр., до приблизительно 37°C, где указанное нагревание происходит в течение приблизительно 45 - приблизительно 90 минут, напр., приблизительно 45 - приблизительно 75 минут, напр., приблизительно 60 минут;

f) культивирование восстанавливающей смеси из стадии e) при температуре между приблизительно 20°C - приблизительно 42°C, напр., 32°C - приблизительно 42°C, напр., до между приблизительно 35°C - приблизительно 39°C, напр., до приблизительно 37°C, где указанное культивирование происходит в течение приблизительно 210 - приблизительно 420 минут, напр., приблизительно 210 - приблизительно 330 минут, напр., приблизительно 240 - приблизительно 300 минут, напр., приблизительно 250 минут при сохранении объемного коэффициента массопереноса кислорода (kLa*) в сосуде, составляющем ≤ 0,37 ч-1, где указанный kLa* вычисляют посредством адаптации кривой насыщения к кривой растворенного кислорода,

g) охлаждение смеси, полученной после стадии f), до температуры между приблизительно 16°C - приблизительно 28°C, где указанное охлаждение происходит в течение приблизительно 45 - приблизительно 90 минут, напр., приблизительно 45 - приблизительно 75 минут, напр., приблизительно 60 минут; и

h) регулирование рН смеси, полученной после стадии g), до между приблизительно 5,1 - приблизительно 5,3, напр., приблизительно 5,2.

Также в данной заявке раскрыты также очищенные препараты секукинумаба, где уровень интактного секукинумаба в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%, как измерено посредством капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), и где уровень активности секукинумаба в препарате составляет по меньшей мере приблизительно 90%, как измерено посредством катионообменной хроматографии с цистамином.

Общая часть

В некоторых вариантах осуществления указанных выше способов антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: i) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:8; ii) вариабельный домен легкой цепи (VL) иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:10; iii) VH домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:8 и VL домен иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность, как изложено в виде SEQ ID NO:10; iv) VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; v) VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; vi) VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13; vii) VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 и VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6; и viii) VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:13 и VL домен иммуноглобулина, содержащий, в последовательности, гипервариабельные области, как изложено в виде SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов антитело против IL-17 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой человеческое антитело изотипа IgG1. В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов антитело представляет собой секукинумаб.

Подробности одного или более вариантов осуществления раскрытия изложены в сопровождающем описании выше. Хотя на практике или для тестирования настоящего раскрытия можно применять любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в данной заявке, далее будут описаны предпочтительные способы и материалы. Из описания и из формулы изобретения будут понятны другие признаки, цели и преимущества раскрытия. В описании и приложенной формуле изобретения единственные формы включают множественные ссылки, если в контексте ясно не описано иное. Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данной заявке, имеют такое же значение, которое обычно понимается квалифицированным специалистом в области, к которой относится данное раскрытие. Все патенты и публикации, перечисленные в данном описании, включены посредством ссылки. Следующие примеры представлены с целью более полного иллюстрирования предпочтительных вариантов осуществления раскрытия. Данные примеры никоим образом не должны истолковываться как ограничивающие объем раскрытого вопроса о пациенте, как определено прилагаемой формулой изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Восстановление промежуточного продукта Белка A секукинумаба посредством различных сульфгидрильных агентов

Пример 1.1

Ряд восстанавливающих агентов, содержащих сульфгидрильную группу (напр., дитиотреитол (DTT), 2-меркаптоэтанол, 2-меркаптоуксусную кислоту, цистеин, цистеамин, глутатион) подвергали скринингу для их использования в селективном восстановлении окисленного Cys97 в легкой цепи секукинумаба. В первом наборе экспериментов порции 1 мл неактивного исходного материала, полученного из более раннего способа ферментации, после стадии захвата Белка A инкубировали при 37°C при различных pH с различными концентрациями β-меркаптоэтанола, цистеина и глутатиона. После определенных моментов времени образцы обессоливали посредством гель-фильтрации в 20 мМ ацетатном буфере с pH 6, и возобновление активности определяли ELISA. Также, содержание свободных сульфгидрильных групп определяли тестом Эллмана (разблокирование сульфгидрильной группы должно приводить к значению 2 моль свободных SH на моль антитела). Результаты приведены в таблице 2 ниже.

2-ME° Активность Свободная SH Цистеин Активность Свободная SH Глутатион Активность Свободная SH
%* Моль/моль %* Моль/моль %* Моль/моль
pH 7
37°C 5 мМ/1 ч 59 1,3
/4 ч 85 1,6
/8 ч 85 1,6
pH8
37°C 1 мМ/2 ч 61 1,4
/8 ч 90 1,8
2 мМ/1 ч 64 1,4 2 мМ/2 ч 80 1,8 2 мМ/2 ч 45 1,4
/4 ч 82 1,9 /4 ч 98 1,9 /8 ч 65 2,0
/8 ч 88 n.p.
4 мМ/1 ч 88 1,3 4 мМ/1 ч 77 0,9 4 мМ/2 ч 59 1,6
/4 ч 91 1,8 /4 ч 105 1,9 /4 ч 94 1,8
/8 ч 106 2,0
8 мМ/1 ч 58 1,4
/4 ч 75 1,7
pH 9
37°C 1 мМ/2 ч 48 1,2
/8 ч 71 1,5
2 мМ/1 ч 82 n.p. 2 мМ/2 ч 78 1,6 2 мМ/2 ч 73 1,6
/4 ч 97 0,9 /4 ч 89 1,8 /8 ч 81 2,1
/8 ч 93 1,1
4 мМ/1 ч 85 0,7 4 мМ/1 ч 74 1,5 4 мМ/2 ч 54 2,0
/4ч 102 2.0 /4 ч 100 2,1 /4 ч 73 2,1
8 мМ/1 ч 68 1,7
/4 ч 81 2.1

Таблица 2: Активность и свободные SH образцов после реакции при заданных условиях.

°: 2-Меркаптоэтанол (2-ME),

*:% по отношению к стандарту.

В результате данных исследований меркаптоэтанол и цистеин в диапазоне pH 7-9 с концентрацией, составляющей от 1 до 20 мМ, и температурах, составляющих 20-40°C, как было обнаружено, являются наиболее подходящими.

В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что во время воздействия восстанавливающих агентов антитело может чрезмерно восстанавливаться с образованием антитела, имеющего частично восстановленные межцепочечные дисульфидные мостики. Данное чрезмерное восстановление является обратимым при атмосферных условиях, когда антитело выделяют из реакционной смеси, напр., посредством диафильтрации, как описано выше, или посредством хроматографии, поскольку растворенный кислород, присутствующий в буферах, приводит к спонтанному повторному окислению с повторным образованием интактного антитела.

L-SS-HH-SS-L (интактное антитело) → L-SH+HS-HH-SS-L (восстановленный межцепочечный дисульфидный мостик) → L-SS-HH-SS-L (интактное антитело)

Пример 1.2 (анаэробные условия)

Во втором наборе экспериментов обработку антитела секукинумаба, полученного после стадии захвата Белка A, выполняли в анаэробных условиях посредством применения деаэрированных растворов и атмосферы аргона или азота для исключения действия растворенного кислорода на результат восстановления. Кратко, раствор секукинумаба из стадии захвата Белка A отрегулировали до pH 8,0 посредством добавления базового раствора трис-основания. Затем раствор доводили до концентрации, составляющей 8 мМ цистеина и 1 мМ ЭДТА, посредством добавления базового раствора цистеин/ЭДТА (напр., 200 мМ/12,5 мМ ЭДТА при рН 8). Концентрация секукинумаба в восстанавливающем растворе составила 4 мг/мл (молярное соотношение цистеин:антитело приблизительно 296:1). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение периода, составляющего 24 часа. В различные моменты времени брали образцы и наполняли избытком иодацетамида, который останавливает реакцию путем гашения сульгидрильных групп восстанавливающего агента и антитела.

Такая же установка использовалась для экспериментов с 2-меркаптоэтанолом, 2-меркаптоуксусной кислотой, цистеином, цистеамином и глутатионом. Для DTT использовали концентрацию 1 мМ.

Гашеные образцы анализировали посредством капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в невосстанавливающих условиях (CE-SDS). Данный аналитический способ отделяет различные продукты восстановления антитела (HHL, HH, HL, H и L видов) от интактного антитела (LHHL) и подсчитывает их посредством УФ-детектирования on-line и объединения областей полученных сигналов.

На фигуре 1 данные для интактного антитела (LHHL) из восстанавливающей обработки 0, 3, 15 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч и 20-24 ч демонстрируют, что DTT и β-меркаптоацетоуксусная кислота восстанавливают антитело полностью без повторного уравновешивания до интактного антитела. Глутатион и β-меркаптоэтанол также демонстрируют оговоренное восстановление, но не были способны индуцировать повторное уравновешивание до интактного антитела (LHHL). Цистеин восстанавливает антитело приблизительно до 50%, за которым следует прямолинейное повторное уравновешивание до интактного антитела. Данные для цистеамина демонстрируют, что данный реагент либо вызывает малое восстановление, либо очень быстро (в пределах времени, составляющего менее чем 3 мин) приводит к повторному уравновешиванию.

Обнаруженный порядок восстановления (т.е. DTT > β-меркаптоацетоуксусная кислота > β-меркаптоэтанол > глутатион) коррелирует с опубликованными данными для окислительно-восстановительных потенциалов или дисульфидного обмена. См. T. Liu in «The Proteins, 3rd Edition, Volume 3 (1977) p. 239, который приводит следующие комментарии и данные:

Редокс потенциал E=E0+0,059 x log [R-SS-R]/[R-SH]

Стандартный редокс-потенциал (E0 в Вольтах) не измеряют непосредственно, поскольку электрод уравновешивают серой. Вследствие этого, редокс-потенциал должен был быть установлен из косвенных измерений:

Дитиотреитол DTT/DTTox: E0 ~ -0,33 В (pH 7, 25°C)

Глутатион GSH/GSSG: E0 ~ -0,24 В (pH 7, 25°C)

Цистеин CSH/CSSC: E0 ~ -0,22 В (pH 7, 25°C)

Пример 2: Цистеин селективно восстанавливает секукинумаб в аэробных и анаэробных условиях.

Дополнительные эксперименты были проведены при комнатной температуре (RT) (приблизительно 25°C) или 37°C с применением 8 мМ цистеина, 4 мг/мл секукинумаба, pH 8 (молярное соотношение цистеин:антитело приблизительно 295,88:1). Реакции проводили либо в аэробных (т.е. приготовление растворов и обработка выполнялись в воздухе нормального состава), либо в анаэробных (т.е. приготовление растворов и обработка выполнялись при исключении или восстановлении кислорода путем деаэрации и последующей обработки в атмосфере аргона или азота) условиях.

В анаэробных условиях (напр., атмосфера аргона или азота с 0% растворенного кислорода) на ранней фазе обработки происходит значительная деградация антитела с образованием фрагментов антитела - признак избыточного восстановления. Максимальное уменьшение интактного антитела (LHHL) до приблизительно 40% происходит приблизительно через 15 минут для экспериментов, проводимых либо при RT (Фигура 2A), либо при 37°C (Фигура 2C). Повторное уравновешиваниу до интактного антитела через 20 часов демонстрирует приблизительно 17,1% избыточно восстановленных вариантов, остающихся в образцах RT, и 12,1% избыточно восстановленных вариантов, остающихся в образцах 37°C.

В аэробных условиях, т.е. в присутствии растворенного кислорода, наблюдается более умеренная реакция. Максимальное уменьшение интактного антитела (LHHL) до приблизительно 80% остаточного уровня возникает приблизительно через 15 минут для экспериментов, проведенных при RT (Фигура 2B), и до приблизительно 73% для экспериментов, проведенных при 37°C (Фигура 2D). Повторное уравновешивание до интактного антитела демонстрируют только 5,8% избыточно восстановленных вариантов, остающихся в образцах RT после 20 часов, и только 9,3% избыточно восстановленных вариантов, остающихся в образцах 37°C после 8 часов.

Таким образом, в анаэробных условиях изначальное восстановление является более высоким, и повторное уравновешивание до интактного антитела не является таким же полным, как в аэробных условиях.

Пример 3: Воздействие растворенного кислорода и цистина на селективное восстановление

Поскольку цистеин (Cys-SH) окисляется в присутствии воздуха до цистина (Cys-SS-Cys), различие, наблюдаемое в аэробных и анаэробных условиях, может быть вызвано малыми количествами цистина, образующегося во время приготовления растворов цистеина в аэробных условиях, а также во время фактической обработки секукинумаба цистеином. С целью оценки воздействия уровня dO2 и цистина (или цистамина) на селективное восстановление секукинумаба, авторы изобретения провели несколько дополнительных подготовительных экспериментов с выделением антитела.

Для некоторых образцов селективное восстановление 4 мг/мл секукинумаба проводили с 8 мМ цистеина (молярное соотношение цистеин:антитело 295,88:1) в растворе, имеющем pH 8,0, при 37°C в аэробных условиях при 100% dO2 (отсутствие фумигации азотом), 50% и 20% dO2 (перемешивание в окружающей атмосфере с фумигацией азотом таким образом, чтобы растворенный кислород оставался на целевом уровне в течение всего эксперимента) и анаэробных (0% dO2) условиях (дегазированные растворы, полная азотная атмосфера) без цистина, а также при 100% dO2 в присутствии приблизительно 0,1 мМ цистина (отношение цистеин:цистин=80:1). В одном эксперименте добавляли 0,3 мМ цистина после начальной 30-минутной инкубации с 8 мМ цистеина в анаэробных условиях. В другом эксперименте селективное восстановление проводили в анаэробных условиях с применением 7,7 мМ цистеина и 0,3 мМ цистина [соотношение цистеин:цистин=25,66:1]. В другом образце вместо цистина добавляли 0,1 мМ цистамина.

Во всех этих примерах образцы отбирали в различные моменты времени. В конце обработки (240 мин при 37°C) антитело выделяли посредством регулирования рН основного объема раствора до 5,0 и загрузки в катионообменную колонну, которая связывает антитело. После промывания для удаления восстанавливающего агента антитело элюировали посредством солевого и/или pH-градиента и анализировали согласно CE-SDS, SE-HPLC и катионообменной хроматографии.

Фигура 3 демонстрирует анализ CE-SDS гашенных иодацетамидом образцов, отбираемых в различное время обработки. Меньший dO2 приводит к большему восстановлению на ранней фазе и более медленному уравновешиванию на более поздней фазе селективного восстановления. Уровень интактного антитела был по существу более низким (70%) в конце обработки при общих анаэробных условиях (0% dO2). Уровень интактного антитела был улучшен до уровня выше 90%, когда реакцию проводили в условиях 50% или более растворенного кислорода. Добавление небольшого количество цистина (или цистеамина) снижало начальное восстановления антитела.

Таблица 3 демонстрирует активность и чистоту антител, полученных после того, как образцы из различных реактивирующих обработок (анаэробные и аэробные условия) были очищены с применением последующей хроматографии на SP Сефарозе FF.

Условия обработки После стадии SP
(37°C/pH 8,0/4ч) CE-SDS чистота SEC чистота CEX активность биоактивность
% % % %
Исходный материал 96,4 98,4 61,2 45
8 мМ цистеин/ 0% кислород (анаэроб) 82,3 98,1 92,8 92
8 мМ цистеин/0% кислород /30 мин:+0,3 мМ цистина 92,6 98,4 92,3 95
8 мМ цистеин/ 20% кислород 96,9 98,0 88,6 99
8 мМ цистеин/ 50% кислород 96,1 98,2 87,0 90
8 мМ цистеин/100% кислород (аэроб) 95,8 98,1 90,6 96
7,7 мМ цистеин/0,3 мМ цистин/анаэроб 97,1 98,9 91,8 104
8 мМ цистеин/0,1 мМ цистин 100% кислород (аэроб) 94,5 98,0 82,4 108
8 мМ цистеин/0,1 мМ цистамина 100% кислород (аэроб) 94,8 98,6 86,1 86

Таблица 3: Активность и чистота антитела после различных реактивирующих обработок.

В отношении биоактивности, во всех случаях был получен полностью активный материал (86-108% теоретического максимума) в противовес исходному материалу неселективно восстановленного секукинумаба, который имел только 45% активность. В отношении чистоты CE-SDS, была обнаружена нарушенная чистота (82,3%) в антителе, полученном при полностью анаэробной обработке в отсутствие цистина, что, вероятно, связано с избыточным восстановлением в данных условиях (примечание: добавление цистина в анаэробные реакции повышает чистоту образцов, которую измеряют согласно CE-SDS, поскольку восстановительный потенциал является меньшим и посредством него избыточное восстановления менее вероятно). Однако все другие селективно восстановливающие обработки приводили к сходному и высокому качеству и активности антител. Авторы изобретения также заметили, что некоторые значения чистоты CE-SDS перед стадией хроматографии на SP сефарозе были немного более низкими, чем значения, полученные после стадии хроматографии (напр., 65% перед по сравнению с 82% после) (данные не показаны), что предполагает, что во время стадии хроматографии может произойти дополнительное повторное окисление. Активность CEX была в целом более низкой в различных аэробных условиях, поскольку для смягчения восстановительной силы цистеина имелось больше кислорода. Добавление окислительных агентов цистина и цистамина в аэробных условиях дополнительно снижало активность CEX.

Резюме и выводы, выведенные из Примеров 1-3

Авторы изобретения определили, что CysL97 секукинумаба способен к восстановлению в растворе без необходимости частичного раскрытия полной структуры антитела, например, с использованием гуанидина HCl. Более того, секукинумаб в целом поддается селективному восстановлению, которое в регулируемых условиях может сделать возможным активацию антитела без существенной деградации.

Как было обнаружено, цистеин являлся особенно оптимальным для селективного восстановления секукинумаба, поскольку он проявляет только умеренное избыточное восстановление в сочетании с быстрым уравновешиванием. Антитело преимущественно восстанавливается в первый час селективного восстановления с применением цистеина, напр., вплоть до 60% в анаэробных условиях и вплоть до приблизительно 30% в полностью аэробных условиях. В последующем секукинумаб медленно повторно окисляется до интактного антитела. Повторное окисление образцов, подвергаемых селективному восстановлению цистеином, протекает гораздо медленнее при комнатной температуре, чем реакции, проводимые при 37°C (в отличие от 21 часа для повторного равновесия при комнатной температуре по сравнению с 8 ч для уравновешивания при 37°C). Образцы комнатной температуры также в целом демонстрировали меньшее максимальное снижение в интактном антителе по сравнению с реакциями селективного восстановления, проведенными при 37°C.

Авторы изобретения заметили, что в анаэробных условиях изначальное восстановление антитела является более высоким, а повторное уравновешивание до интактного секукинумаба не является таким же полным, как в аэробных условиях. Однако добавление небольшого количества цистина в анаэробные реакции приводило к улучшенным чистоте и активности по отношению к анаэробным реакциям, проведенным в отсутствие цистина. Таким образом, ход аэробных реакций можно моделировать в анаэробных условиях, когда присутствует небольшое молярное соотношение окисленного восстановительного реагента (например, цистина в случае цистеина в качестве восстановителя). Более того, авторы изобретения заметили, что добавление цистина ускоряло равновесие интактного антитела - даже когда цистин не присутствовал в течение первых 30 минут инкубации. Таким образом, селективное восстановление может быть проведено в присутствии воздуха, а также в отсутствие растворенного кислорода посредством применения атмосферы инертного газа (напр., азота или аргона). При проведении в полностью анаэробных условиях полезным является добавление небольшого молярного соотношения окисленной формы восстанавливающего реагента.

Пример 4: Исследование с целью разработки стадии селективного восстановления цистеина: доказательство концепции (DoE1)

Пример 4.1 - Дизайн и способы исследования

Основной целью стадии обработки цистеином является восстановление полной биологической активности антитела секукинумаб путем маскирования -SH-группы цистеина в положении 97 легкой цепи, которое может иметь место во время инкубации клеток, сбора и/или хроматографии белка A. В следующем примере чистоту антитела анализировали посредством способа CE-SDS в невосстанавливающих условиях, который контролирует целостность антитела (называемого «чистота согласно CE-SDS»), а биологическую активность антитела анализировали посредством способа хроматографии CEX с цистамином (называемого «активность посредством CEX»). При хроматографии CEX с цистамином цистамин добавляют в образец антитела и позволяют дериватизировать любой свободный цистеин в секукинумабе. Затем образец подвергают аналитическому разделению посредством катионообменной хроматографии, в результате чего виды антитела, дериватизированные цистамином, элюируют после видов недериватизированного антитела, поскольку они несут дополнительный положительный заряд. Затем хроматограмму сравнивают с хроматограммой необработанного образца. Часть видов на хроматограмме обработанного образца, имеющих сдвинутое положение элюции, является прямым мерилом распространенности свободного CysL97-SH в исходном образце и может использоваться в качестве суррогатного маркера активности.

Основная цель доказательства концепции исследования (DoE1) заключалась в проверке применимости дизайна экспериментов исследований для улучшения стадии обработки цистеином для тестирования первого набора диапазонов параметров для определения основных влияющих факторов и поддержки определения рабочих диапазонов. Дополнительно, DoE1 провели для оценки, является ли экспериментальная настройка применимой для определения влияния входных параметров на выходные параметры. Концептуальное исследование было проанализировано с использованием программного обеспечения Modde 9.0 (Umetrics).

Входные параметры показаны в Таблице 4. Добавление цистина (окисленной формы) тестировали в качестве дополнительного входного параметра, поскольку на редокс-потенциал влияет соотношение восстановленная форма/окисленная форма, в данном случае соотношение цистеин:цистин. Соотношение цистеин:цистин и концентрацию цистеина исследовали на каждом из 3 уровней, а концентрацию антител («содержание согласно ALC») на 2 уровнях. Для выходных параметров качества продукта, активность определяли посредством CEC, а чистоту согласно CE-SDS.

Наименование Единица низкий уровень Средний уровень Верхний уровень
соотношение цистеин:цистин [-] 2,00 6,00 10,0
концентрация цистеина [мМ] 0,50 5,25 10,0
содержание согласно ALC [мг/мл] 3,25 не определено 6,5

Таблица 4: Входные параметры.

Дизайн представляет собой многоуровневый факториальный дизайн 32×2 без опытов с центральными точками. Дизайн был выбран для получения данных и понимания способа для улучшения стадии обработки цистеином. Данный тип дизайна поддерживает расчет математических моделей с линейными, взаимодействующими и квадратичными членами для входных параметров соотношения цистеин:цистин и концентрации цистеина. План дизайна эксперимента приведен в таблице 5.

Опыт Соотношение цистеина и цистина
[M/M]
Концентрация цистеина
[мМ]
Содержание белка согласно ALC
[мг/мл]
Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка
[M/M]
React007_1 2 0,50 6,50 11,38
React007_2 6 10,00 6,50 227,61
React007_3 2 10,00 6,50 227,61
React007_4 10 10,00 6,50 227,61
React007_6 6 0,50 6,50 11,38
React007_7 10 10,00 3,25 455,21
React007_8 10 5,25 6,50 119,49
React007_9 6 10,00 3,25 455,21
React007_10 6 5,25 6,50 119,49
React007_11 2 10,00 3,25 455,21
React007_12 10 0,50 3,25 22,76
React007_13 6 5,25 3,25 238,99
React007_14 6 0,50 3,25 22,76
React007_15 10 5,25 3,25 238,99
React007_16 2 5,25 3,25 238,99
React007_17 2 0,50 3,25 22,76
React007_18 10 0,50 6,50 11,38

Таблица 5: План дизайна эксперимента. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Реакции селективного восстановления проводили в 15 мл закрытых полипропиленовых пробирках, которые помещали на водяную баню и нагревали до 37°C. Белковый раствор разводили WFI до намеченной концентрации, а pH доводили до pH 8,0 с помощью 1 M Триса. После добавления раствора цистеина и цистина пробирки термически обрабатывали и инкубировали на водяной бане в течение 4 ч. Затем образцы убирали для определения содержания ALC. CE-SDS проводили с образцами, которые отбирали непосредственно после культивирования, и реакцию останавливали посредством добавления 10-кратного избытка (по отношению к концентрации цистеина) иодоацетамида. Оставшийся раствор охлаждали до температуры окружающей среды, доводили рН до 5,0-5,5, и отбирали образцы для анализа CEX и SEC.

Дизайн был выполнен в соответствии с фактическим дизайном эксперимента в Таблице 6.

Опыт Молярное соотношение цистеина к цистину
[M/M]
Концентрация цистеина
[мМ]
Содержание белка согласно ALC
[мг/мл]
Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка
[M/M]
React007_1 2 0,50 6,9 10,72
React007_2 6 10,00 6,3 234,83
React007_3 2 10,00 6,3 234,83
React007_4 10 10,00 6,3 234,83
React007_5 2 5,25 6,5 119,49
React007_6 6 0,50 6,8 10,88
React007_7 10 10,00 3,2 462,33
React007_8 10 5,25 6,5 119,49
React007_9 6 10,00 3,2 462,33
React007_10 6 5,25 6,6 117,68
React007_11 2 10,00 3,2 462,33
React007_12 10 0,50 3,5 21,13
React007_13 6 5,25 3,4 228,44
React007_14 6 0,50 3,5 21,13
React007_15 10 5,25 3,3 235,37
React007_16 2 5,25 3,4 228,44
React007_17 2 0,50 3,5 21,13
React007_18 10 0,50 6,6 11,21

Таблица 6: Фактический дизайн эксперимента. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, что используют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Пример 4.2 - Результаты доказательства концепции исследования

Значения для выходных параметров перечислены в таблице 7 вместе с входными параметрами. Опыты перечислены с повышающимися значениями активности согласно CEX. Можно видеть, что все опыты с концентрацией цистеина, составляющей 0,5 мМ, имеют более низкую активность - вероятно, потому, что данная концентрация цистеина является слишком низкой для достижения полной демаскировки Cys97. В данном наборе отмечалось небольшое улучшение активности согласно CEX, когда соотношение цистеин:антитело увеличивалось с приблизительно 11:1 до 21:1 (REACT00_17, _14 и _12). Из этих трех опытов опыты с немного более высоким соотношением цистеин:цистин (REACT007_14 и _12) (вероятно, представляющие незначительное ослабление восстановительной силы цистеина) также имели хорошую чистоту по параметру CE-SDS. Затем имеется серия опытов, где разница в выходном параметре активности является небольшой (от 92,4 до 93,1%) и, вероятно, в пределах аналитической точности, что затрудняет интерпретацию данной группы. Наконец, есть набор из 4 опытов, где активность была наиболее высокой (от 93,7 до 95,1%). Примечательно, что данные опыты не содержали наиболее высокого соотношения цистеин/белок (462,33).

Опыт Молярное соотношение цистеина к цистину
[M/M]
Концентрация цистеина [мМ] Содержания белка согласно ALC
[мг/мл]
Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка
[M/M]
активность согласно CEX [%] чистота согласно CE-SDS [%]
React007_1 2 0,50 6,9 10,72 87,2 97,0
React007_6 6 0,50 6,8 10,88 88,8 95,0
React007_18 10 0,50 6,6 11,21 88,8 94,0
React007_17 2 0,50 3,5 21,13 89,3 78,0
React007_14 6 0,50 3,5 21,13 90,4 93,0
React007_12 10 0,50 3,5 21,13 90,9 95,0
React007_16 2 5,25 3,4 228,44 92,4 85,0
React007_3 2 10,00 6,3 234,83 92,8 83,0
React007_13 6 5,25 3,4 228,44 92,8 85,0
React007_9 6 10,00 3,2 462,33 92,9 68,0
React007_7 10 10,00 3,2 462,33 93,0 56,0
React007_8 10 5,25 6,5 119,49 93,0 88,0
React007_11 2 10,00 3,2 462,33 93,0 70,0
React007_4 10 10,00 6,3 234,83 93,1 77,0
React007_2 6 10,00 6,3 234,83 93,7 76,0
React007_15 10 5,25 3,3 235,37 94,0 78,0
React007_10 6 5,25 6,6 117,68 94,2 84,0
React007_5 2 5,25 6,5 119,49 95,2 87,0

Таблица 7: Значения входных и выходных параметров, перечисленные с восходящими значениями активности согласно CEX.

Из-за хорошей подгонки модели возможно было применение контурных диаграмм, чтобы понять основные влияющие параметры системы. Качество моделей представлено 4 инструментами, а именно R2, Q2, пригодностью модели и стандартным отклонением (SD) параллельных анализов. Модель, которая находится в удовлетворительном совпадении с данными, будет иметь R2 и Q2, близкие к 1,0 и пригодность модели выше 0,25. Модели с более низкой статистической значимостью имеют более низкие значения R2 и Q2. Диагностика модели на выходные параметры качества указывает, что модели активности согласно CEX и чистоты согласно CE-SDS имеют высокую статистическую значимость (R2=0,88 и Q2=0,73 для активности согласно CEX, и R2=0,84 и Q2=0,63 для чистоты согласно CE-SDS). Контурная диаграмма активности согласно CEX (Фигура 4A) описала, что достигнуты значения активности согласно CEX, равные или более высокие, чем 93,0%, если входной параметр концентрация цистеина составлял между 4,0 мМ и 9,0 мМ. Более того, входной фактор содержание согласно ALC может варьировать от низкого уровня (3,25 мг/мл) до высокого уровня (6,5 мг/мл), когда входной фактор соотношение цистеин:цистин установлено в его центральной точке 6. Для улучшения активности согласно CEX модель показывает, что входной параметр содержание согласно ALC должно быть более высоким, чем изучаемый верхний уровень, составляющий 6,5 мг/мл.

В таблице 8 опыты перечислены в соответствии с повышением чистоты согласно CE-SDS. Можно наблюдать три группы: опыты с более низкой чистотой (</=70%), к которым относятся опыты с высоким молярным соотношением, составившим 462 моль/моль; опыты со средней чистотой (70-83%); и опыты с более высокой чистотой (>83%). Из-за хорошей подгонки модели также возможно применение контурных диаграмм, чтобы понять, как входной параметр влияет на значения чистоты согласно CE-SDS, показанные в таблице 8. В соответствии с контурной диаграммой для CE-SDS на фигуре 4B, область, которая наиболее близко подходит к теоретическому оптимуму, лежит в правой нижней стороне. Это означает, что соотношение цистеин:цистин должно быть установлено на более высоком уровне, а концентрация цистеина должна быть установлена на более низком уровне. Дополнительно, для увеличения чистоты согласно CE-SDS следует применять более высокое содержание согласно ALC.

Опыт Молярное соотношение цистеина к цистину Концентрация цистеина Содержание белка согласно ALC Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка Активность согласно CEX Чистота согласно CE-SDS
[M/M] [мМ] [мг/мл] [M/M] [%] [%]
React007_7 10 10,00 3,2 462,33 93,0 56
React007_9 6 10,00 3,2 462,33 92,9 68
React007_11 2 10,00 3,2 462,33 93,0 70
React007_2 6 10,00 6,3 234,83 93,7 76
React007_4 10 10,00 6,3 234,83 93,1 77
React007_15 10 5,25 3,3 235,37 94,0 78
React007_3 2 10,00 6,3 234,83 92,8 83
React007_10 6 5,25 6,6 117,68 94,2 84
React007_16 2 5,25 3,4 228,44 92,4 85
React007_13 6 5,25 3,4 228,44 92,8 85
React007_5 2 5,25 6,5 119,49 95,2 87
React007_8 10 5,25 6,5 119,49 93,0 88
React007_14 6 0,50 3,5 21,13 90,4 93
React007_18 10 0,50 6,6 11,21 88,8 94
React007_6 6 0,50 6,8 10,88 88,8 95
React007_12 10 0,50 3,5 21,13 90,9 95
React007_1 2 0,50 6,9 10,72 87,2 97

Таблица 8: Входные и выходные параметры, перечисленные в соответствии с увеличением чистоты согласно CE-SDS.

Пример 4.3 - Резюме доказательства концептуального исследования

Доказательство концептуального исследования подтвердило применимость экспериментальной настройки для оценки и уточнения входных параметров стадии обработки цистеином. Авторы изобретения отметили, что высокое молярное отношение цистеина к белку может привести к низким значениям чистоты согласно CE-SDS. Модели также предположили, что увеличение концентрации белка и цистеина может улучшить чистоту согласно CE-SDS и активность согласно CEX. Таким образом, концентрация цистеина и влияние увеличенного диапазона параметров для содержания согласно ALC на атрибуты качества продукции активность согласно CEX и чистоту согласно CE-SDS было оценено более подробно в следующем исследовании (План на поверхности отклика 1).

Пример 5: Исследование с целью разработки стадии селективного восстановления цистеином: План на поверхности отклика 1

Пример 5.1 - Дизайн и способы исследования

Исходя из данных примера 4, были отрегулированы входные параметры стадии селективного восстановления. Исследование с целью разработки проанализировано с использованием программного обеспечения Modde 9.0 (Umetrics). Входные параметры перечислены в таблице 9. Факторы изучали на каждом из трех уровней. Дизайн представлял собой скорректированную версию доказательства концептуального исследования с откорректированными уровнями входных параметров содержания согласно ALC и концентрации цистеина. Для упрощения экспериментальной настройки и дополнительной оценки данных входной параметр «соотношение цистеин:цистин» был заменен на параметр «концентрация цистина».

Наименование Единица Низкий уровень Средний уровень Верхний уровень
Концентрация цистина [мМ] 0,0 0,5 1,0
концентрация цистеина [мМ] 4,0 9,0 14,0
содержание согласно ALC [мг/мл] 3,8 11,6 19,5

Таблица 9: Входные параметры.

Дизайн представляет собой 23 центральный композиционный гранецентрированный (CCF) план с 4 центральными опытами в условиях центральной точки. Данный тип дизайна поддерживает расчет математических моделей с линейными, взаимодействующими и квадратичными членами. План дизайна эксперимента приведен в таблице 10.

Опыт Содержание белка согласно ALC (мг/мл) Концентрация цистеина (мМ) Концентрация цистина (мМ) Молярное соотношение цистеина к цистину (M/M) Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка (M/M)
React016_1 19,5 14 0,0 Не определено 106,22
React016_21 11,6 9 0,5 18 114,78
React016_3 3,8 9 0,5 18 350,39
React016_4 11,6 9 1,0 9 114,78
React016_5 19,5 9 0,5 18 68,28
React016_6 19,5 4 0,0 Не определено 30,35
React016_7 3,8 4 1,0 4 155,73
React016_81 11,6 9 0,5 18 114,78
React016_9 11,6 14 0,5 28 178,55
React016_10 3,8 4 0,0 Не определено 155,73
React016_11 11,6 4 0,5 8 51,02
React016_12 3,8 14 0,0 Не определено 545,06
React016_13 19,5 4 1,0 4 30,35
React016_141 11,6 9 0,5 18 114,78
React016_151 11,6 9 0,5 18 114,78
React016_16 19,5 14 1,0 14 106,22
React016_17 11,6 9 0,0 Не определено 114,78
React016_18 3,8 14 1,0 14 545,06

Таблица 10: План дизайна эксперимента. 1) Центральные точки. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Реакции селективного восстановления проводили в 15 мл закрытых полипропиленовых пробирках, которые помещали на водяную баню и нагревали до 37°C. Дизайн был выполнен в соответствии с фактическим экспериментальным дизайном в таблице 11.

Опыт Содержание белка согласно ALC (мг/мл) Концентрация цистеина (мМ) Концентрация цистина (мМ) Молярное соотношение цистеина к цистину (M/M) Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка (M/M)
React016_1 19,5 14 0,0 Не определено 106,22
React016_21 11,9 9 0,5 18 111,89
React016_3 4,0 9 0,5 18 332,87
React016_4 11,5 9 1,0 9 115,78
React016_5 19,4 9 0,5 18 68,63
React016_6 19,4 4 0,0 Не определено 30,50
React016_7 3,8 4 1,0 4 155,73
React016_81 11,6 9 0,5 18 114,78
React016_9 11,5 14 0,5 28 180,11
React016_10 3,7 4 0,0 Не определено 159,94
React016_11 11,6 4 0,5 8 51,02
React016_12 3,8 14 0,0 Не определено 545,06
React016_13 19,3 4 1,0 4 30,66
React016_141 11,7 9 0,5 18 113,80
React016_151, 2 11,1 9 0,5 18 119,95
React016_16 17,8 14 1,0 14 116,36
React016_17 10,9 9 0,0 Не определено 122,16
React016_18 3,8 14 1,0 14 545,06

Таблица 11: Фактический дизайн эксперимента. 1) Центральная точка; 2) Данный эксперимент не рассматривается в качестве центральной точки используемого программного обеспечения DoE из-за отклонения более чем на 10% концентрации белка от первоначально запланированной центральной точки. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Пример 5.2 - Результаты плана на поверхности отклика 1

Входные параметры и значения для выходных параметров перечислены в таблице 12. Опыты перечислены в соответствии с повышением активности согласно CEX. Можно наблюдать, что в опытах с высокой активностью согласно CEX применяли более высокую концентрацию цистеина. Единственный опыт с более низкой активностью (React016_13) имел высокую концентрацию белка, низкую концентрацию цистеина и высокую концентрацию цистина.

Диагностика модели на выходной параметр качество продукта составила R2=0,95, Q2=0,76, SD=0,20, и пригодность модели=0,78 для активности согласно CEX, и R2 =0,79, Q2 =0,53, SD= 2,91, и пригодность модели=0,83 для чистоты согласно CE-SDS, что указывает на значимые модели для обоих выходных параметров. Контурные диаграммы были рассчитаны (Фигура 5), чтобы лучше понять влияние установок входных параметров и влияние на активность согласно CEX.

Опыт Содержания белка согласно ALC (мг/мл) Цистеин концентрация (мМ) Концентрация цистина (мМ) Молярное соотношение цистеина к цистину (M/M) Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка (M/M) Активность согласно CEX [%] Чистота согласно CE-SDS [%]
React016_13 19,3 4 1 4 30,66 91,6 93
React016_7 3,8 4 1,0 4 155,73 93,3 92
React016_6 19,4 4 0,0 Не определено 30,50 93,5 94
React016_11 11,6 4 0,5 8 51,02 93,5 93
React016_5 19,4 9 0,5 18 68,63 94,1 85
React016_10 3,7 4 0,0 Не определено 159,94 94,2 79
React016_21 11,9 9 0,5 18 111,89 94,3 86
React016_3 4,0 9 0,5 18 332,87 94,3 85
React016_4 11,5 9 1,0 9 115,78 94,5 87
React016_81 11,6 9 0,5 18 114,78 94,5 91
React016_151, 2 11,1 9 0,5 18 119,95 94,5 86
React016_141 11,7 9 0,5 18 113,80 94,7 86
React016_17 10,9 9 0,0 Не определено 122,16 94,7 85
React016_1 19,5 14 0,0 Не определено 106,22 94,9 76
React016_9 11,5 14 0,5 28 180,11 95,1 85
React016_12 3,8 14 0,0 Не определено 545,06 95,1 74
React016_16 17,8 14 1,0 14 116,36 95,1 78
React016_18 3,8 14 1,0 14 545,06 95,1 77

Таблица 12: Входные и выходные параметры, перечисленные в соответствии с повышением активности согласно CEX. 1) Центральные точки; 2) Данный эксперимент не рассматривается в качестве центральной точки используемого программного обеспечения DoE из-за отклонения более чем на 10% концентрации белка от первоначально запланированной центральной точки.

Как показано на контурном графике на фигуре 5, чтобы достичь высокой активности согласно CEX, наиболее важным входным параметром является концентрация цистеина, которая должна быть установлена на ее высокий уровень. Но даже при низком уровне концентрации цистеина достигается высокая активность согласно CEX (> 93%), если содержание цистина согласно ALC и его концентрация не находятся на верхнем пределе. Входные параметры содержание согласно ALC и концентрация цистина также влияют на выходной параметр активность согласно CEX, но в меньшей степени.

В таблице 13 опыты перечислены в соответствии с восходящей чистотой согласно CE-SDS. Опыты можно разделить на три группы. Проходила серия из шести опытов (главным образом опыты 14 мМ с низкой чистотой (<80%), серия опытов со средней чистотой (85-91%), и серия опытов с более высокой чистотой (>91%), вся последняя представляет собой опыты с 4 мМ цистеина.

Опыт Содержания белка согласно ALC (мг/мл) Концентрация цистеина (мМ) Цистина концентрация (мМ) Молярное соотношение цистеина к цистину (M/M) Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка (M/M) Активность согласно CEX [%] Чистота согласно CE-SDS [%]
React016_12 3,8 14 0,0 Не определено 545,06 95,1 74
React016_1 19,5 14 0,0 Не определено 106,22 94,9 76
React016_18 3,8 14 1,0 14 545,06 95,1 77
React016_16 17,8 14 1,0 14 116,36 95,1 78
React016_10 3,7 4 0,0 Не определено 159,94 94,2 79
React016_5 19,4 9 0,5 18 68,63 94,1 85
React016_3 4,0 9 0,5 18 332,87 94,3 85
React016_17 10,9 9 0,0 Не определено 122,16 94,7 85
React016_9 11,5 14 0,5 28 180,11 95,1 85
React016_21 11,9 9 0,5 18 111,89 94,3 86
React016_151, 2 11,1 9 0,5 18 119,95 94,5 86
React016_141 11,7 9 0,5 18 113,80 94,7 86
React016_4 11,5 9 1,0 9 115,78 94,5 87
React016_81 11,6 9 0,5 18 114,78 94,5 91
React016_7 3,8 4 1,0 4 155,73 93,3 92
React016_13 19,3 4 1,0 4 30,66 91,6 93
React016_11 11,6 4 0,5 8 51,02 93,5 93
React016_6 19,4 4 0,0 Не определено 30,50 93,5 94

Таблица 13: Входные и выходные параметры, перечисленные в соответствии с восходящей чистотой согласно CE-SDS. 1) Центральные точки; 2) Данный эксперимент не рассматривается в качестве центральной точки используемого программного обеспечения DoE из-за отклонения более чем на 10% концентрации белка от первоначально запланированной центральной точки.

Исходя из результатов, концентрация цистеина должна быть низкой, а содержание согласно ALC и концентрация цистина должна быть высокой, чтобы достичь более высоких значений чистоты согласно CE-SDS.

Эксперименты React016_6, React016_7, React016_8 и React016_11 имеют высокие значения для обоих двух качественных выходных параметров. Для оценки риска безуспешности стадии обработки цистеином на основании модели, установленной данным DoE, была проведена оценка пространства конструкционных параметров с применением моделирования методом Монте-Карло. Оценка пространства конструкционных параметров предоставляет диапазон, в пределах которого могут изменяться факторы, при том, что выходные параметры не превышают целевой диапазон для выходного параметра качества продукции и производительности способа. Предполагается, что содержание согласно ALC должно быть установлено на 12 мг/мл, как идеальное. В данном конкретном эксперименте концентрация цистеина является идеальной при 4,0 мМ. Для концентрации цистина идеальной является 0,32 мМ.

В соответствии с результатами данного исследования, на стадию обработки цистеином главным образом влияет концентрация цистеина. Высокая концентрация цистеина способствует высокой активности согласно CEX, но одновременно приводит к низкой чистоте согласно CE-SDS. В соответствии с оценкой пространства конструкционных параметров, концентрация цистеина должна сохраняться при 4 мМ, а содержание согласно ALC должно быть установлено на 12 мг/мл (соотношение цистеина и белка составляет приблизительно 49).

Для проверки результатов статистических расчетов целевые опыты проводили в перемешиваемых 2 л биореакторах с воздушной накладкой и открытым свободным пространством над продуктом. Во время инкубации перемешивание не использовали. Технологические параметры перечислены в таблице 14, а аналитические данные показаны в таблице 15.

Технологический параметр Единица Целевой опыт 1 (REACT019) Целевой опыт 2 (REACT020) Целевой опыт 3 (REACT021)
Концентрация белка [мг/мл] 12,90 13,00 12,60
Концентрация цистеина [мМ] 4,00 8,00 4,00
Концентрация цистина [мМ] 0,15 0,15 0,00
Температура [°C] 37,00 37,00 37,00
pH [-] 8,00 8,00 8,00
Время инкубации [ч] 4,00 4,00 4,00
Молярное соотношение цистеин:цистин M/M 26,67 53,33 Не определялось
Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка M/M 45,87 91,04 46,97

Таблица 14: Технологические параметры целевых опытов. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Технологический параметр Единица Целевой опыт 1 (REACT019) Целевой опыт 2 (REACT020) Целевой опыт 3 (REACT021)
Активность согласно CEX [%] 94,8 94,3 95,4
Чистота согласно CE-SDS [%] 94,0 89,0 95,0

Таблица 15: Аналитические данные целевых опытов.

Все три опыта приводят к аналогичным результатам в отношении активности согласно CEX. Это соответствует результатам предыдущего исследования DoE, показавшего, что 4,0 мМ цистеина является достаточно для восстановления активности антитела. В 3-ем целевом опыте (REACT021) цистин не был включен, что привело к сопоставимым результатам по чистоте согласно CE-SDS с опытом 1 (REACT019) и продемонстрировало, что в условиях испытаний цистин оказывает лишь незначительное влияние на производительность стадии обработки цистеином. Повышение концентрации цистеина до 8,0 мМ (соотношение цистеина и белка составляет приблизительно 91) привело не к более высоким значениям активности согласно CEX, но к более низкой чистоте согласно CE-SDS в пуле, опускаясь ниже целевого показателя разработки, составляющего 90%. Хотя цистин продемонстрировал значимость в статистическом плане, положительный эффект в целевых опытах не был обнаружен. Дополнительно, влияние в статистическом плане на активность согласно CEX является незначительным (см. фигуру 5), а приготовление содержащего цистин буфера затруднено из-за низкой растворимости цистина в неосновных буферах. Следовательно, цистин можно не включать в буфер для обработки цистеином.

Пример 6: Исследование с целью разработки стадии селективного восстановления цистеином: План на поверхности отклика 2

Пример 6.1 - Дизайн и Способы Исследования

Главной целью плана на поверхности отклика 2 (DoE3) было исследование технологических параметров температуры, времени и pH на этапе обработки цистеином в дополнение к концентрации цистеина. Данные также используются для определения рабочих диапазонов и определения основных влияющих факторов. Исследование с целью разработки анализировали с использованием программного обеспечения Modde 9.0 (Umetrics). Входные параметры находятся в таблице 16.

Наименование Единица Низкий уровень Средний уровень Верхний уровень
температура [°C] 32,0 37,0 42,0
время [ч] 1,0 4,0 7,0
pH [-] 7,5 8,0 8,5
концентрация цистеина [мМ] 2,0 5,0 8,0

Таблица 16: Входные параметры.

Дизайн представляет собой центральный композиционный гранецентрированный (CCF) план с 3 опытами центральных точек. План дизайна эксперимента приведен в таблице 17. Дизайн был выбран для оценки влияния дополнительных технологических параметров, поскольку раствор для обработки цистеином был улучшен в прошлых экспериментах. Концентрацию цистеина анализировали вновь, поскольку она являлась наиболее влияющим входным параметром на стадии обработки цистеином, и ожидалось взаимодействие с входными параметрами. Данный тип дизайна поддерживает расчет математических моделей с линейными, взаимодействующими и квадратичными членами.

Опыт Температура Время pH Концентрация цистеина Содержания белка согласно ALC Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка
[°C] (ч) [-] [мМ] [мг/мл] (M/M)
React027_1 42 7 8,5 8 13 91,04
React027_2 37 4 8,0 8 13 91,04
React027_3 32 1 7,5 8 13 91,04
React027_4 32 1 8,5 2 13 22,76
React027_51 37 4 8,0 5 13 56,90
React027_6 42 1 8,5 8 13 91,04
React027_7 32 1 8,5 8 13 91,04
React027_8 32 1 7,5 2 13 22,76
React027_91 37 4 8,0 5 13 56,90
React027_10 37 7 8,0 5 13 56,90
React027_11 42 7 7,5 2 13 22,76
React027_12 42 4 8,0 5 13 56,90
React027_13 32 7 7,5 8 13 91,04
React027_14 37 4 8,0 2 13 22,76
React027_15 37 4 7,5 5 13 56,90
React027_16 32 4 8,0 5 13 56,90
React027_17 42 1 8,5 2 13 22,76
React027_18 32 7 7,5 2 13 22,76
React027_19 37 1 8,0 5 13 56,90
React027_20 42 7 7,5 8 13 91,04
React027_21 42 1 7,5 8 13 91,04
React027_221 37 4 8,0 5 13 56,90
React027_23 42 7 8,5 2 13 22,76
React027_24 32 7 8,5 2 13 22,76
React027_25 37 4 8,5 5 13 56,90
React027_26 32 7 8,5 8 13 91,04
React027_27 42 1 7,5 2 13 22,76

Таблица 17: План дизайна эксперимента. 1) Центральные точки. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Реакции селективного восстановления проводили в 15 мл закрытых полипропиленовых пробирках, которые помещали на водяную баню и нагревали до 37°C.

Пример 6.2 - Результаты плана на поверхности отклика 2

Исследование было выполнено в соответствии с фактическим дизайном эксперимента в таблице 18.

Опыт Температура Время pH Концентрация цистеина Содержания белка согласно ALC Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка
[°C] (ч) [-] [мМ] [мг/мл] [M/M]
React027_1 42 7 8,5 8 13 91,04
React027_2 37 4 8,0 8 13 91,04
React027_3 32 1 7,5 8 13 91,04
React027_4 32 1 8,4 2 13 22,76
React027_51,2 37 4 7,9 5 13 56,90
React027_6 42 1 8,5 8 13 91,04
React027_7 32 1 8,5 8 13 91,04
React027_8 32 1 7,3 2 13 22,76
React027_91 37 4 8,0 5 13 56,90
React027_10 37 7 8,0 5 13 56,90
React027_11 42 7 7,4 2 13 22,76
React027_12 42 4 8,0 5 13 56,90
React027_13 32 7 7,6 8 13 91,04
React027_14 37 4 7,9 2 13 22,76
React027_15 37 4 7,5 5 13 56,90
React027_16 32 4 8,0 5 13 56,90
React027_17 42 1 8,5 2 13 22,76
React027_18 32 7 7,4 2 13 22,76
React027_19 37 1 8,0 5 13 56,90
React027_20 42 7 7,6 8 13 91,04
React027_21 42 1 7,6 8 13 91,04
React027_221 37 4 8,0 5 13 56,90
React027_23 42 7 8,5 2 13 22,76
React027_24 32 7 8,5 2 13 22,76
React027_25 37 4 8,5 5 13 56,90
React027_26 32 7 8,5 8 13 91,04
React027_27 42 1 7,5 2 13 22,76

Таблица 18: Фактический план дизайна эксперимента. 1) Центральные точки. 2) Не считается центральной точкой используемого программного обеспечения. Относительная молекулярная масса секукинумаба, исходя из аминокислотной последовательности, составляет 147944 Дальтон, которую применяют для подсчета молярного соотношения цистеина и белка.

Значения для выходных параметров качества продукта перечислены в таблице 19 в возрастающем порядке в отношении результатов активности согласно CEX. Диагностика модели на выходной параметр качество продукта представляет собой R2=0,93, Q2=0,80, пригодность модели=0,79 и SD=0,42 для активности согласно CEX; R2=0,96, Q2=0,89, пригодность модели=0,67 и SD=0,00 для чистоты согласно CE-SDS.

Опыт Температура Время pH Концентрация цистеина Содержание белка согласно ALC Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка Активность согласно CEX Чистота согласно CE-SDS
[°C] (ч) [-] [мМ] (мг/мл) (M/M) [%] [%]
React027_8 32 1 7,3 2 13 22,76 89,1 91
React027_27 42 1 7,5 2 13 22,76 90,1 91
React027_3 32 1 7,5 8 13 91,04 90,3 61
React027_4 32 1 8,4 2 13 22,76 91,1 92
React027_7 32 1 8,5 8 13 91,04 91,7 65
React027_17 42 1 8,5 2 13 22,76 91,8 89
React027_18 32 7 7,4 2 13 22,76 92,5 93
React027_14 37 4 7,9 2 13 22,76 93,3 94
React027_21 42 1 7,6 8 13 91,04 93,3 77
React027_19 37 1 8,0 5 13 56,90 93,4 79
React027_23 42 7 8,5 2 13 22,76 93,6 93
React027_24 32 7 8,5 2 13 22,76 94,1 93
React027_11 42 7 7,4 2 13 22,76 94,2 95
React027_6 42 1 8,5 8 13 91,04 94,3 74
React027_16 32 4 8,0 5 13 56,90 94,4 86
React027_13 32 7 7,6 8 13 91,04 94,5 82
React027_91 37 4 8,0 5 13 56,90 95,0 89
React027_51,2 37 4 7,9 5 13 56,90 95,2 89
React027_10 37 7 8,0 5 13 56,90 95,3 90
React027_221 37 4 8,0 5 13 56,90 95,6 88
React027_25 37 4 8,5 5 13 56,90 95,7 87
React027_20 42 7 7,6 8 13 91,04 95,8 85
React027_12 42 4 8,0 5 13 56,90 95,9 90
React027_1 42 7 8,5 8 13 91,04 96,0 85
React027_15 37 4 7,5 5 13 56,90 96,1 88
React027_2 37 4 8,0 8 13 91,04 97,1 82
React027_26 32 7 8,5 8 13 91,04 97,1 82

Таблица 19: Значения входных и выходных параметров, перечисленные в соответствии с возрастающей активностью согласно CEX. 1) Центральная точка. 2) Не считается центральной точкой используемого программного обеспечения.

Таблица 19 демонстрирует, что опыты можно разделить главным образом на три группы: с низкой активностью (<93%), со средней активностью (93-95%) и с высокой активностью (>95%). Из-за хорошей подгонки модели также возможно применение контурной диаграммы (фигура 6), чтобы идентифицировать основные влияющие параметры системы. Фигура 6 демонстрирует, что время инкубации от среднего до высокого (напр., от 4 до 7 часов) и высокая концентрация цистеина являются предпочтительными для повышения активности согласно CEX. Температура инкубации и pH способа имеют меньшее влияние на выходной параметр активность согласно CEX. Тем не менее, области чистоты, составляющие 95% и выше, являются самыми большими в графиках для pH 8,0 и 8,5 при 37°C, предполагая, что это является оптимальным рабочим диапазоном.

В таблице 20 опыты перечислены по повышению чистоты согласно CE-SDS. Опыты можно разделить на три группы: опыты с низкой чистотой (<82%), опыты со средней чистотой и опыты с высокой чистотой (>90%). Во всех опытах с высокой чистотой согласно CD-SDS используют 2 мМ цистеина.

Опыт Температура Время pH Концентрация цистеина Содержания белка согласно ALC Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка активность согласно CEX чистоты согласно CE-SDS
[°C] (ч) [-] [мМ] (мг/мл) (M/M) [%] [%]
React027_3 32 1 7,5 8 13 91,04 90,3 61
React027_7 32 1 8,5 8 13 91,04 91,7 65
React027_6 42 1 8,5 8 13 91,04 94,3 74
React027_21 42 1 7,6 8 13 91,04 93,3 77
React027_19 37 1 8,0 5 13 56,90 93,4 79
React027_13 32 7 7,6 8 13 91,04 94,5 82
React027_2 37 4 8,0 8 13 91,04 97,1 82
React027_26 32 7 8,5 8 13 91,04 97,1 82
React027_20 42 7 7,6 8 13 91,04 95,8 85
React027_1 42 7 8,5 8 13 91,04 96,0 85
React027_16 32 4 8,0 5 13 56,90 94,4 86
React027_25 37 4 8,5 5 13 56,90 95,7 87
React027_221 37 4 8,0 5 13 56,90 95,6 88
React027_15 37 4 7,5 5 13 56,90 96,1 88
React027_17 42 1 8,5 2 13 22,76 91,8 89
React027_91 37 4 8,0 5 13 56,90 95,0 89
React027_51,2 37 4 7,9 5 13 56,90 95,2 89
React027_10 37 7 8,0 5 13 56,90 95,3 90
React027_12 42 4 8,0 5 13 56,90 95,9 90
React027_8 32 1 7,3 2 13 22,76 89,1 91
React027_27 42 1 7,5 2 13 22,76 90,1 91
React027_4 32 1 8,4 2 13 22,76 91,1 92
React027_18 32 7 7,4 2 13 22,76 92,5 93
React027_23 42 7 8,5 2 13 22,76 93,6 93
React027_24 32 7 8,5 2 13 22,76 94,1 93
React027_14 37 4 7,9 2 13 22,76 93,3 94
React027_11 42 7 7,4 2 13 22,76 94,2 95

Таблица 20: Входные и выходные параметры, перечисленные с повышением чистоты согласно CE-SDS. 1) Центральная точка. 2) Не считается центральной точкой используемого программного обеспечения.

Из-за хорошей подгонки модели можно применить контурный график (фигура 7) для понимания способа и основных влияющих входных параметров. Фигура 7 демонстрирует, что время инкубации от среднего до высокого и низкая концентрация цистеина увеличивает чистоту согласно CE-SDS. Входные параметры температура инкубации и рН способа имеют небольшое влияние на чистоту согласно CE-SDS.

Резюме и выводы, сделанные из примера 6

Цели разработки достигаются, когда концентрация цистеина удерживается на низком уровне, в то время как температура может варьировать от средней к высокой, рН может варьировать от среднего к высокому, а время может варьировать от среднего до высокого. Чтобы помочь оценить диапазоны входных параметров, которые приводят к высокому качеству продукта, задействовали алгоритм оценки пространства конструкционных параметров с применением имитационного моделирования методом Монте-Карло. Для данного имитационного моделирования устанавливали цель, составляющую >93% для активности согласно CEX и >90% для чистоты согласно CE-SDS. Имитационное моделирование методом Монте-Карло спрогнозировало, что данные целевые показатели качества достигаются, когда температура в идеале равна 39,1°C, но температура может варьировать между 38,6°C и 39,7°C. Время инкубации имеет оптимум, составляющий 5,0 ч, но может варьировать между 4,0 ч и 6,0 ч. Для pH оптимум составляет 8,2 и он может варьировать от 8,15 до 8,25. Для последнего входного параметра, концентрации цистеина, спрогнозирован оптимум 2,4 мМ и может варьировать между 2,2 мМ и 2,5 мМ. В пределах данных диапазонов алгоритм оценки пространства конструкционных параметров обнаружил, что для выходного параметра качество продукта активность согласно CEX оцененное значение DPMO (число дефектов на миллион операций) будет составлять 110, значение чистоты согласно CE-SDS DPMO будет составлять 20. Это означает, что в 110 случаях из одного миллиона целевое ограничение для активности согласно CEX не будет соответствовать, и в 20 случаях из миллиона целевое ограничение для чистоты согласно CE-SDS.

В соответствии с результатами контурных графиков и принимая в расчет результаты предыдущих исследований разработки (DoE1 и DoE2), целевая температура для инкубации была установлена на 37°C. Целевое время инкубации было установлено на 4 часа (240 минут), поскольку в настоящей экспериментальной установке не было включено время нагревания и охлаждения, которое будет рассматриваться для применения в промышленном масштабе. В комбинации с временем нагревания и охлаждения общее время способа будет составлять приблизительно 6 часов. Влияние pH на чистоту согласно CE-SDS не определяется, а влияние на активность согласно CEX минимальное. Вследствие этого, был установлен целевой рН 8,0, так как он находится в пределах тестируемого диапазона, разрабатываемая цель для активности согласно CEX может надежно достигаться, а риск образования кислотных вариантов согласно CEX (усиленных основными условиями) будет уменьшен. Результаты для входного параметра концентрация цистеина указывает на низкий оптимальный уровень, составляющий 2,4 мМ; однако, большинство экспериментов, использующих 2 мМ цистеин, приводило к более низкой активности согласно CEX, чем желаемая. Это, в комбинации с результатами целевых опытов, предполагает, что целевая концентрация цистеина должна быть более высокой, т.е., 4 мМ, во время подтверждающих опытов.

Пример 7: Сравнение способа и анализ непрерывного перемешивания

Пример 7.1 - Сравнение способа B2 и способа C

Обсуждения, описанные в примере 6, предполагают, что селективное восстановление предпочтительно может быть проведено при более высокой концентрации белка и более низкой концентрации цистеина (4-6 мМ), чем до настоящего времени в промышленном масштабе (в данной заявке способ B2). Таблица 21 сравнивает входные параметры для более раннего способа B2 и предложенного способа C. Сравнительные опыты были проведены в двух повторах в полипропиленовых пробирках 50 мл масштаба, которые помещали на водяную баню и нагревали до 37°C. Результаты показаны в таблице 22.

Единица Способ B2 Предложенный способ C
Концентрация цистеина [мМ] 8,00 4,00
Концентрация белка1) [мг/мл] 4,30 13,50
Приблизительное молярное соотношение цистеина и белка [M/M] 275,24 43,84
pH [-] 8,00 8,00
Время инкубации [ч] 4,00