Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения каллусной культуры змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, содержащего ценные биологически активные соединения (флавоноиды, фенольные соединения), а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за высокого содержания в своем составе летучих эфирных соединений.

Змееголовник дланевидный Dracocephalum palmatum Steph.– растение семейства Lamiaceae, многолетнее вечнозеленое растение с ползучими побегами, образует очень плотную дернину. Листья и побеги опушены. Цветоносы приподнимаются над дерниной на 10-15 см. Цветки фиолетовые в мутовках. Семена созревают в июле. Зимует с зелеными листьями. Встречается в северо-восточных районах Якутии. Растет на сухих каменисто-щебнистых склонах, скалах, в каменистых тундрах, гонных степях (см. Данилова Н.С., Борисова С.З., Иванова Н.С. Декоративные растения Якутии: Атлас-определитель. – М.: ЗАО «Фитон+», 2012. – 248 с).

Известно, что на основе химических и спектральных работ из частей змееголовника дланевидного было выделено 23 соединения (фенилпропаноиды, кумарины, флавоноиды и тритерпены), среди которых впервые в роду Dracocephalum было обнаружено восемь соединений: сальвианоловая кислота B, кафтаровая кислота, цихоровая кислота, умбеллиферон, эскулетин, апигенин-7-O-β-D-глюкуронопиранозид, изорхоифолин и лютеолин-4'-O-β-D-глюкопиранозид (см. Olennikov DN, Chirikova NK, Okhlopkova ZM, Zulfugarov IS. Chemical composition and antioxidant activity of Tánara Ótó (Dracocephalum palmatum Stephan), a medicinal plant used by the North-Yakutian nomads. Molecules.2013 Nov 14;18(11):14105-21.). 

Змееголовник дланевидный используют в тибетской медицине, якутской народной медицине, настой из надземной части и цветков применяют при язвенной болезни желудка, а в Средней Азии - при сердечной недостаточности, астении, болезнях желудка и как потогонное средство.

Известен способ получения каллусной культуры представителя семейства Lamiaceaе шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides) (см. ЕА №020503, кл. C12N 5/04, A01H 4/00, опубл. 28.11.2014), включающий получение штамма культуры корня растения шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides), интенсивно растущего в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющего способность к синтезу фенольных соединений, характерных для корней целого растения, и обладающего генетической и биохимической стабильностью.

Авторами в открытых источниках технические решения по получению каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного не выявлено.

Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры клеток змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro.

Для решения поставленной задачи способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro включает стерилизацию семян змееголовника раствором перекиси водорода (3% раствор) в течение 5 минут, этиловым спиртом (80% раствор) в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, в мг/л: NH₄NO₃ - 33000, KNO₃ - 38000, CaCl₂×2H₂O - 8800, MgSO₄×7H₂O - 7400, KH₂PO₄ - 3400, KI - 166, Н₃ВО₃ - 1240, MnSO₄×4H₂O - 4460, ZnSO₄×7H₂O - 1720, Na₂MoO₄×2H₂O - 50, CuSO₄×5H₂O - 5, CoCl₂×6H₂O - 5, FeSO₄×7H₂O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», каллусная культура змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) впервые получена в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры змееголовника дланевидного(Dracocephalum palmatum Steph.).

Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, культивируемые в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, фитомасса которого собрана во время стационарно-маршрутных работ на территории Оймяконского нагорья в Республике Саха (Якутия), известного как «Полюс холода – Оймякон», в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».

При этом отобранные семена стерилизовали раствором 3 % перекиси водорода в течение 5 минут, после чего, вторично 80 % спиртом в течение 1 мин. После стерилизации материал трехкратно ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Стерилизованные семена помещали на твердую питательную среду без гормонов. Культивирование проростков проводили до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования свежих проростков растения содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.

Из полученного проростка получали листовые экспланты, которые помещали в питательную среду с дополнительным добавлением гидролизата казеина, кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. При этом выявлено, что наиболее интенсивное каллусообразование получается при концентрации фитогормонов кинетин 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 1 мг/л.

После образования каллусной ткани проводили его отделение и рассадку в культуральные сосуды (чашки Петри, конически колбы на 100 и 250 мл) со свежей питательной средой, того же состава.

Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусной ткани содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 2.

Культивирование проводили в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. При этом цикл субкультивирования составлял 4 недели. При пересеве использовали ¼ каллусной культуры.

Пересадку проводили каждые 30 дней, таким образом, сохраняя полученную каллусную культуру. В процессе культивирования определяли морфологические, цитологические характеристики, также отбирали для молекулярных исследований и химических анализов.

Описание способа получения каллусной культуры Dracocephalum palmatum Steph. в настоящее время нигде не зарегистрировано.

Полученная каллусная культура характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки: каллусные культуры рыхлые и зернистые, имеют желтовато-серую окраску.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы каллусных культур отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах и взвешивают. Сухую биомассу каллусных культур получают после лиофильной сушки.

При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 20 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сырому весу биомассы. Результаты представлены в таблице 3 и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.

Таким образом, выявлен способ получения каллусных культур змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) из эксплантов проростков, полученных в лабораторных условиях.

Таблица 1

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культивирования проростков к получению стерильных эксплантов, в мг/л

Таблица 2

Состав питательной среды Мурасиге-Скуга для получения каллусной культуры клеток

Таблица 3

Ростовые параметры каллусных культур змееголовника дланевидного