Результат интеллектуальной деятельности: Штамм каллусной культуры клеток растения полынь якутская (Artemisia jacutica Drobow) под обозначением NEFU-Ajac-1 в условиях in vitro для получения биомассы клеток

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности, культивированию штамма каллусных культур клеток растения полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow), и может быть использовано для пищевой и фармацевтической промышленности как источник сырья для пищевой добавки и биологически активных веществ.

Штамм NEFU-Ajac-1 каллусной культуры полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow), полученный в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, регистрационный номер 100.

Культура клеток высших растений представляет ценный природный растительный материал для получения целевых вторичных метаболитов, лежащих в основе разработки новых лекарственных средств.

Полынь якутская широко используется в народной медицине коренного населения Якутии. Эфирное масло характеризуется противовоспалительными свойствами, стимулирует рост соединительной ткани при регенерации ран, имеет высокую антибактериальную, фунгистатическую и фунгицидную активность, что, вероятно, обусловлено с высоким содержанием хамазулена. Экстракты полыни якутской характеризуются повышенным уровнем безопасности и низкой токсичностью, что было выявлено сотрудниками Института биологических проблем криолитозоны СО РАН в результате проверки на токсичность различных водно-спиртовых экстрактов растений Центральной Якутии на различных микроорганизмах (см. Кан М.У., Шашурин М.М., Журавская А.Н. Оценка биологической активности и токсичности экстрактов дикорастущих растений Центральной Якутии // Природные ресурсы Арктики и Субарктики. - 2019. - Т. 24. - №1. - С. 109-115; Поскачина Е.Р., Шашурин М.М., Журавская А.Н. Влияние различных способов биотехнологической переработки тканей ряда видов растений Центральной Якутии на токсикологические свойства получаемых экстрактов // Природные ресурсы Арктики и Субарктики. - 2018. - Т. 24. - №2. - С. 87-93; Сивцева С.В., Охлопкова Ж.М. Фунгистатическая активность экстрактов из некоторых дикорастущих растений Якутии // Ученые записки Петрозаводского государственного университета. - 2016. - №6 (159). - С. 106-113).

Из надземной части полыни якутской выделяют такие флавоноиды, как хризоспленетин, 5,7,4'-тригидрокси-3,3'-диметоксифлавон, кактицин и астрагалин (см. Сальникова Е.Н., Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е. Химическое исследование флавоноидов полыни горькой (Artemisia absinthium L.), п. сиверса (A. sieversiana Willd.) и п. якутской (A. jacutica Drob.) // Химия растительного сырья. - 2001. - №3. - С. 71-78.)

В исследованиях, проведенных Е.П. Дыленовой, С.В. Жигжитжаповой, Э. Рандаловой и др. совместно с сотрудниками Международного научно-производственного холдинга «Фитохимия» было показано, что в полыни якутской был обнаружен сесквитерпеновый γ-лактон - арглабин. Одноименный противоопухолевый препарат «Арглабин» был разработан именно на основе данного лактона, выделенного из полыни гладкой (Artemisia glabella Kar.et Kir), эндемика Казахтанской флоры (см. Дыленова Е.П., Жигжитжапова С.В., Рандалова Т.Э., Раднаева Л.Д. Микроэлементы-биофилы и тяжелые металлы в Artemisia frigida Willd. и Artemisia jacutica Drob. // Химия растительного сырья. - 2019. - №4. - С. 199-205; Randalova T.E., Atazhanova G.A., Adekenov S.M., Zhigzhitzhapova S.V., Radnaeva L.D. A the chemical composition of plants of the genus Artemisia containing arglabin of Russian (Buryatia) and Kazakhstan’s floras // Czech Chem. Soc. Symp. Ser. - 2015. - N13. - P. 163-173). Следовательно, A. jacutica является перспективным источником сесквитерпеновых лактонов, общая сумма которых составляет около 1,05-1,13%, включая арглабин (см. Dylenova E.P., Randalova T.E., Tykheev Z.A., Zhigzhitzhapova S.V., Radnaeva L.D. Artemisia jacutica Drob. as the source of terpenoids. Paper presented at the IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. - 2019. - 320(1). doi: 10.1088/1755-1315/320/1/012054).

Полынь якутская является эфироносным растением и содержит высокое количество эфирного масла (1,7-3,45%). Сумма дубильных веществ в пересчете на галловую кислоту составляет - 2,41±0,02%, а сумма флавоноидов в пересчете на цинарозид - 0,37±0,01% (см. Дыленова Е.П., Рандалова Т.Э., Жигжитжапова С.В., Раднаева Л.Д. Количественное определение суммы дубильных веществ и флавоноидов Artemisiae frigidae Herba. и Artemisiae jacuticae Herba. // Молодые ученые и фармация XXI века. - Москва: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений", 2018. - С. 155-160). В состав эфирного масла Artemisia jacutica Drob. входят: хамазулен (45,8-53,6%), γ-эвдесмол (23,9%) α-бисаболол (15,2%), нерил-2-метилбутаноат (2,8-3,4%), нерил-3-метилбутаноат (6,4-6,7%), 1,8-цинеол (2,1-2,7%), борнилацетат, α- и β-гумулен, селинановый спирт, α-пинен (0,1%), сабинен (1,8%), мирцен (18,6%), п-цимол (следы), Δ3-карен (следы), лимонен (18,5%), α-терпинен (следы), терпинолен (следы), α-терпинеол (0,7%), камфора (следы), β-фарнезен (1,2%), элемен (0,1%), муролен (0,1%), гермакрен D (0,4%), γ-гумулен (0,1%), Δ-кадинен (4,8%), γ-кадинен (2,4%), бизаболол (5,0%), Δ-кадинол (0,8%), селинановый спирт (11,8%), интермедеол (0,8%) (см. Денисов Г.В., Стрельцова В.С., Хайми В.П. Кормовые и лекарственные растения Якутии. - Якутск: Якутский филиал СО АН СССР, 1979. - С. 83-95; Ханина М.А., Серых Е.А., Амельченко В.П., Покровский Л.М., Ткачев А.В. Результаты интродукционного исследования полыни якутской Artemisia jacutica Drob. // Химия растительного сырья. - 1999. - №3. - С. 63-78; Dylenova E.P., Randalova T.E., Tykheev Z.A., Zhigzhitzhapova S.V., Radnaeva L.D. Artemisia jacutica Drob. as the source of terpenoids. Paper presented at the IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. - 2019. - 320(1). doi: 10.1088/1755-1315/320/1/012054). В ранних исследованиях в полыни якутской также были выявлены сесквитерпеновые γ-лактоны: гвайянолид - арборезеин (сиверсинин) и гермакранолид - оксопеленолид Б. (см. Benesheva V., Nazarenko M.V., Sleptsova L.V. Sesquiterpene y-lactones from Artemisia jacutica // Khimiya Prirodnykh Soedinenii. - 1969. - V. 5. - N. 3. - P. 186) и фенолокислоты, в число которых входят: кофейная, хлорогеновая, феруловая, п-гидроксибензойная, ванилиновая и неохлорогеновая кислоты (см. Salnikova E.N., Komissarenko N.F., Derkach A.I., Dmitrik S.E., Kalinkina G.I. Phenolic acids of wormwoods of the order Frigidae // Chemistry of Natural Compounds. - 1993. - V. 29. - N. 5. - P. 678).

Также известен способ культивирования каллусной культуры полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.) (см. RU №2718254, кл. C12N 5/04, опубл. 31.03.2020)).

При этом из открытых источников технические решения в области культивирования клеток растений рода Artemisia jacutica Drobow не выявлено.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма каллусных культур клеток полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) с характерными морфологическими, ростовыми, биосинтетическими параметрами и отсутствием зависимости от сезонных и климатических условий.

Поставленная задача решена тем, что получен штамм каллусной культура клеток полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) в условиях in vitro.

Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм каллусных культур клеток полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) впервые получен в условиях in vitro.

Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, включая оптимизацию питательной среды, стабилизацию ростовых параметров и морфологических характеристик.

Штамм NEFU-Ajac-1 каллусной культуры полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) получен в условиях in vitro, идентифицирован и депонирован во Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений (ВККК ВР) при Учреждении РАН Институт физиологии растений РАН, 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35, регистрационный номер 100.

Предлагаемое изобретение состоит в том, что за основу были взяты 30-дневные первичные каллусы листового происхождения, индуцированные из листовых проростков, выращенных в асептических условиях in vitro, полученных из семян популяции Центральной Якутии (Амгинский район) дикорастущих представителей полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow).

Заявленное решение иллюстрируется чертежом, где на фигуре показана графическая схема динамики роста каллусной культуры клеток Artemisia jacutica Drobow при выращивании в стеклянных чашках Петри диаметром 90 мм.

Для получения первичных каллусов в качестве эксплантов были использованы листья из проростков растений, выращенных в асептических условиях in vitro. Экспланты, полученные из листьев стерильных проростков, помещались в стеклянные чашки Петри с питательной средой Мурасиге-Скуга (МС) с 2,4-Д в концентрации 1 мг/л, 6-БАП в концентрации 1 мг/л, НУК в концентрации 1 мг/л. Культивирование эксплантов проводили в темноте, при температуре 26±1°С и влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет около 30 суток. На 30-ые сутки культивирования первичные каллусные культуры пересаживали на свежую питательную среду. Состав питательной среды представлен в таблице 1.

Таким образом, был получен штамм NEFU-Ajac-1 каллусных культур клеток полыни якутской Artemisia jacutica Drobow из первичных каллусов листового происхождения от культивированных проростков на основе семян дикорастущего растения, произрастающего в условиях Центральной Якутии. Результаты, полученные во время исследований, позволяют отнести данный штамм к хорошо растущим каллусным культурам клеток высших растений (см. кривую роста на фигуре и параметры роста - в таблице 2).

Культивирование проводят в темноте, при температуре 26±1°С и влажности помещения 70±5%, в стеклянных чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет около 30 суток. При пересеве используют каллусной биомассы.

Штамм NEFU-Ajac-1 каллусной культуры клеток полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) обладает следующими признаками: неморфогенный, однородный, рыхлый, оводненный каллус, имеющий зеленовато-бежевый оттенок. Имеет две морфологические группы клеток: паренхимные клетки округлой и вытянутой и/или червеобразно-удлиненной формы.

Таким образом, заявленное изобретение позволяет получить штамм каллусной культуры клеток из первичных каллусов, образованных из листьев. При этом полученный штамм каллусной культуры клеток полыни якутской (Artemisia jacutica Drobow) обладает стабильными ростовыми параметрами и может быть использован в фармацевтической промышленности в качестве сырья для получения ценных биологически активных соединений (флавоноиды, фенольные соединения и т.д.). Кроме того, культивирование штамма каллусной культуры не зависит от сезонных и климатических условий, при этом использование изобретения обеспечивает высокую скорость получения растительной биомассы, не используя пестициды, гербициды, радиоактивные соединения и другие поллютанты при культивировании, возможность использования масштабируемых стандартных биореакторов и ферментеров.