СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА В КОЛЛОИДНОЙ ФОРМЕ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и медицине и может быть использовано при производстве биологически активных добавок и пищевых продуктов.

Известно, что селен - биологически активный микроэлемент, незаменимый для жизнедеятельности человека и животных, входящий в состав большинства гормонов и ферментов. Дефицит селена ведет к развитию различных процессов поражения клетки, лежащих в основе возникновения многих патологических состояний. Учитывая достижения науки в последние десятилетия, а особенно развитие нанонауки, стоит отметить, что получение селена в наноразмерном состоянии приведет к получению материалов с новым уровнем физико-химических характеристик. Именно с этим связано разнообразие новых методов получения наноразмерного селена.

В настоящее время с целью создания новых высокоэффективных селенсодержащих лекарственных средств получены селенсодержащие биологически активные наносистемы на основе полимерных частиц различной природы в широком диапазоне варьирования массового соотношения селен : полимер.

Известен способ получения нанокомпозита путем восстановления селенистой кислоты в водной среде, который приводит к образованию золя нуль-валентного Se⁰ в виде красно-оранжевого раствора и дегидроаскорбиновой кислоты (см. Валуева С.В., Суханова Т.Е., Боровикова Л.Н., Вылегжанина М.Э., Матвеева Н.А., Гельфонд М.Л. Самоорганизация и структура селенсодержащих биологически активных наносистем // Электронный журнал «Структура и динамика молекулярных систем». - 2011. - №10. - С. 3-11).

Недостатком данного способа является неустойчивость золя в растворе, который выпадает в осадок через 24 часа, а через 7-10 суток селен из аморфной красной формы переходит в другую модификацию - серый металлический селен.

Известен жидкофазный метод синтеза наноразмерного селена с использованием в качестве прекурсоров селенсодержащих соединений H₂SeO₃, Na₂SeO₃. Соли селена или селенистая кислота восстанавливаются такими агентами, как N₂H₄, глюкоза, NaBH₄, SnCl₂, тиосульфатом натрия (см. Копейкин В.В., Валуева С.В., Киппер А.И., Боровикова Л.Н., Филиппов А.П. Синтез наночастиц селена в водных растворах поливинилпирролидона и морфологические характеристики образующихся нанокомпозитов // Высокомолекулярные соединения. - 2003. - Т. 45 А. - №4. - С. 615-622).

Следует отметить, что в настоящее время для синтеза наночастиц необходимой формы разработано множество физико-химических методов, однако они остаются дорогостоящими и требуют использования опасных химических соединений. Поэтому существует потребность в развитии безопасных для окружающей среды человека эффективных методов получения различных наночастиц с применением в частности микробных биотехнологий. Необходимо подчеркнуть, что в литературных источниках отсутствуют данные о получении наночастиц селена с использованием пробиотических микроорганизмов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения селенсодержащей биологически активной добавки (БАД), предусматривающий приготовление питательной среды, внесение селенита натрия и инокулята, культивирование, наращивание биомассы, охлаждение, розлив, укупорку. В качестве инокулята используют активизированные культуры Bifidobacterium longum В 379М или Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii KM 186 (см. RU 2333655, A23C 9/12, A23L 1/304, C12N 1/18, опубл. 20.09.2008).

Однако, недостатками данного способа являются большие размеры частиц селена, что снижают его усвояемость.

Техническим результатом изобретения является биологический синтез наноразмерных частиц селена методом культивирования пробиотических микроорганизмов при высоких концентрациях селена в питательной среде и получение Se⁰ в нуль-валентной форме, что повышает качество и его усвояемость.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе получения наночастиц селена в коллоидной форме при производстве биологически активных добавок, предусматривающем приготовление питательной среды, внесение селенита натрия и инокулята, наращивание биомассы, охлаждение, розлив, согласно изобретению в качестве инокулята используют активизированные культуры бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 или пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш85, при этом количество вносимого селенита натрия составляет 1-2 мг/мл питательной среды, после наращивания биомассы проводят дезинтеграцию клеток пробиотических микроорганизмов.

Отличительным признаком заявляемого изобретения является принципиально новый биотехнологический подход к получению наноразмерных частиц селена путем оптимизации питательной среды высокой концентрацией селена и перевода Se в нуль-валентную форму Se⁰. Для осуществления заявляемого способа получения наночастиц селена были проведены экспериментальные исследования по изучению устойчивости пробиотических микроорганизмов к высоким концентрациям селена с целью получения Se⁰ в нуль-валентной форме.

Ранее нами был разработан способ получения селенсодержащей БАД (см. RU №2333655). Однако, при внесении в питательную среду селенита натрия при низких концентрациях не наблюдалось образования Se⁰ в нуль-валентной форме. В этой связи нами были проведены дальнейшие исследования.

Культуры бифидобактерий и пропионовокислых бактерий активизировали разработанным ранее способом (по прототипу).

В первой серии опытов изучали влияние высоких доз селена от 1 до 5 мг/мл на биохимическую активность пробиотических микроорганизмов. Результаты исследований представлены на фиг. 1, 2.

Из данных на фиг. 1 видно, что с увеличением дозы селенита натрия от 1 до 5 мг/мл наблюдается незначительное снижение роста пропионовокислых бактерий.

Полученные результаты свидетельствуют, что пробиотические микроорганизмы пропионовокислых бактерий обладают высокой устойчивостью к селену и при высоких концентрациях селен восстанавливается и переходит в нуль-валентную форму Se⁰ в виде красно-оранжевого раствора, что подтверждается данными количественного учета пропионовокислых бактерий. С увеличением дозы селена от 1 до 2 мг/мл количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий составляет 10¹⁰ КОЕ/мл, дальнейшее повышение дозы до 5 мл приводит к снижению количества клеток до 10⁹ КОЕ/мл (фиг. 2).

Следует отметить, что при концентрации селенита натрия 1 мг/мл цвет биомассы пробиотических микроорганизмов в конце культивирования становится красно-оранжевого цвета, что свидетельствует о переходе селена Se⁰ в нуль-валентную форму.

Установлено, что с повышением концентрации селена до 2 мг/мл в питательной среде цвет становится интенсивнее, а дальнейшее увеличение концентрации селена до 5 мг/мл в питательной среде не приводит к значительному повышению интенсивности цвета. Подобная динамика наблюдается и при культивировании бифидобактерий.

В дальнейших исследованиях методом лазерной дифракции изучали формирование наночастиц селена пробиотическими микроорганизмами. Результаты исследований представлены в табл. 1 (пропионовокислые бактерии) и табл. 2 (бифидобактерий).

Из данных таблицы 1 видно, что при концентрации селена в 1 мг/мл размер наночастиц варьируется от 136 до 286, а выход составляет 63,6%.

С увеличением дозы до 2 мг/мл диапазон размеров наночастиц селена увеличивается. Наибольший выход наночастиц селена установлен в диапазоне от 7 до 36 нанометров - 24%. Затем с увеличением размера наночастиц от 230 до 585 нм наблюдается уменьшение выхода наночастиц. С повышением дозы селенита натрия до 2 мг/мл выход увеличивается на 18,6% и составляет 72,22.

В следующей серии опытов изучали влияние дезинтеграции клеток пропионовокислых бактерий на размер и выход наночастиц селена. Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что при оптимальной концентрации селенита натрия 2 мг/мл выход наноселена после дезинтеграции повышается на 4,27%. В наибольшей степени отмечен выход наночастиц в диапазоне от 7 до 36 нм и составляет 26,71%. При концентрации селенита натрия 1 мг/мл выход наноселена после дезинтеграции повышается на 5,3%.

Подобная динамика наблюдается при культивировании бифидобактерий (табл. 2). При концентрации селена 1 мг/мл отмечено две фракции наночастиц селена в диапазоне от 70 до 321 нм.

Наибольший выход наночастиц селена составляет 71,05% при концентрации 2 мг/мл. При снижении концентрации селена до 1 мг/мл выход наноразмерных частиц снижается на 6%. Дезинтеграция клеток повышает выход наночастиц на 3,4 и 4,1% соответственно.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод, что доза селенита натрия в пределах 1-2 мг/мл обеспечивает наибольший выход наночастиц. При этом отмечено, что дезинтеграция клеток способствует повышению выхода наночастиц.

В результате исследований подобраны оптимальные условия для формирования наночастиц: концентрация селенита натрия 1-2 мг/мл, доза инокулята 3-5%, продолжительность культивирования 20-24 ч, температура 30-37°С.

Отмечен наибольший выход наночастиц в диапазоне от 5 до 36 нм, что очень важно при применении в медицинских целях.

В дальнейших исследованиях методом электронного микроскопирования изучали форму и размеры наночастиц селена. Результаты исследований представлены на фиг. 3.

При химическом синтезе наноселена (фиг. 3) на поверхности хорошо видны изолированные наноструктуры, имеющие четкую сферическую форму с размером 70-40 нм. В качестве полимерного стабилизатора использован политриметилметакриолоксиэтиламммоний сульфат. Следует отметить, что природа полимерной матрицы оказывает существенное влияние на процесс самоорганизации наноструктур и их размеры.

На фиг. 4 представлены наноструктуры, полученные методом биотрансформации селенита натрия бифидобактериями с выделением селена в элементной нуль-валентной форме. Из фиг. 4 видно, что большое количество наносфер не совсем правильной формы. Их размеры находятся в диапазоне 130-400 нм. Они хорошо изолированы и не агрегированы между собой, что свидетельствует о стабильности системы.

Обобщая полученные результаты можно сделать вывод, что использование пробиотических микроорганизмов позволяет разработать принципиально новый биотехнологический метод получения наноразмерного селена. Получение наночастиц селена приведет к получению материалов с абсолютно новым уровнем физико-химических характеристик.

Основные преимущества предлагаемого способа в сравнении с физико-химическими методами получения наночастиц селена:

1. Безопасность;

2. Экономичность;

3. Коммерческая доступность;

4. Стабильность коллоидного раствора;

5. Не требует создания специфических дорогостоящих установок;

6. Не используются токсичные соединения;

7. Возможность применения в крупномасштабном производстве;

8. Значительное снижение токсичности селена в наноразмерной форме.

Поскольку накопление элементного селена коррелирует с повышением концентрации селенита натрия в среде культивирования, можно предположить, что разрушение этого соединения с образованием Se° необходимо для снижения токсического действия, что характерно для многих микроорганизмов.

Это подтверждается данными на фиг. 5, 6, 7, 8 полученными при исследовании влияния селенита натрия на морфологию бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 20083.

Необходимо отметить, что морфология клеток В. adolescentis DSM 20083 зависит от среды культивирования. На питательной среде на основе осветленной творожной сыворотки (фиг. 5) без добавления селенита натрия преобладают палочковидные и коккоидные клетки. При концентрации селена 15 мкг/мл (фиг. 6) наблюдаются древовидно-ветвящиеся и булавовидные клетки, которые агрегируются между собой.

В литературе полиморфизм бифидобактерий трактуется, в основном, как следствие адаптационных изменений, развивающихся клеточных ассоциаций в конкретных условиях обитания. Ветвящиеся и глобулярные атипичные формы являются вероятно устойчивыми к высокой концентрации селена.

Дальнейшее повышение концентрации селена приводит к дезагрегации клеток и их палочковидной форме. При наиболее высокой концентрации селена 1 мг/мл морфология клеток приобретает первоначальную форму, которая характерна для бифидобактерий, культивируемых в питательной среде без селена, видим это на фиг. 7, 8. Такая динамика изменения морфологии клеток свидетельствует о том, что с повышением концентрации селена и образованием наноселена снижается его токсичность.

Таким образом, выявленные отличительные признаки заявляемого изобретения, а именно внесение селенита натрия в питательную в количестве 1-2 мг/мл и использование в качестве инокулята активизированных культур бифидобактерий и пропионовокислых бактерий обеспечивают достижение технического результата, заключающегося в получении селена Se⁰ в нуль-валентной форме, что повышает качество и его усвояемость.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявляемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условиям «новизна» и «изобретательный уровень».

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве питательной среды для культивирования пробиотических микроорганизмов используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Устанавливают рН среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при t=121°C, охлаждают до температуры культивирования, вносят селенит натрия из расчета 1-2 мг/мл, 3-5% активизированных культур бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 или пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш85. Наращивание клеток проводят при t=30-37°C в течение 20-24 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов для поддержания рН на оптимальном уровне насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток пробиотических микроорганизмов подвергают дезинтеграции, затем охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10 см³. Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры (4±2)°С и хранят при этой температуре не более 1 года.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1. В качестве питательной среды используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Устанавливают рН=7. Затем стерилизуют при t=121°C, охлаждают до t=37°C, вносят селенит натрия из расчета 1,0 мг/мл, 5% активизированных культур бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 20083. Наращивание клеток бифидобактерий проводят при t=37°C в течение 20 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток пробиотических микроорганизмов подвергают дезинтеграции, затем охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10 см³. Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры (4±2)°С и хранят при этой температуре не более 1 года.

Пример 2. В качестве питательной среды используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Устанавливают рН=7. Затем стерилизуют при t=121°C, охлаждают до t=37°C, вносят селенит натрия из расчета 2,0 мг/мл, 3% активизированных культур бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 20083. Наращивание клеток бифидобактерий проводят при t=37°C в течение 24 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток пробиотических микроорганизмов подвергают дезинтеграции, затем охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10 см³. Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры (4±2)°С и хранят при этой температуре не более 1 года.

Пример 3. В качестве питательной среды используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Устанавливают рН=7. Затем стерилизуют при t=121°C, охлаждают до t=30°C, вносят селенит натрия из расчета 1,0 мг/мл, 5% активизированных культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш85. Наращивание клеток пропионовокислых бактерий проводят при t=30°C в течение 20 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток пробиотических микроорганизмов подвергают дезинтеграции, затем охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10 см. Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры (4±2)°С и хранят при этой температуре не более 1 года.

Пример 4. В качестве питательной среды используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар. Устанавливают рН=7. Затем стерилизуют при t=121°C, охлаждают до t=30°C, вносят селенит натрия из расчета 2,0 мг/мл, 3% активизированных культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш85. Наращивание клеток пропионовокислых бактерий проводят при t=30°C в течение 24 часов в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток пробиотических микроорганизмов подвергают дезинтеграции, затем охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10 см³. Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры (4±2)°С и хранят при этой температуре не более 1 года.