Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БОТАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЁДА

Изобретение относится к пищевой промышленности, пчеловодству, а именно к способам установления ботанического происхождения меда для подтверждения его натуральности. Проблема фальсификации меда в настоящее время является актуальной для всех потребителей. Применение фальсификата в лучшем случае не окажет никакого положительного влияния на здоровье человека, а в худшем - может ему навредить.

Известен органолептический способ оценки качества меда (по профилям: вкус, аромат, цвет), который не гарантирует достоверность натуральности происхождения меда, так как является, во-первых, субъективным (сколько людей столько и мнений). Кроме того, на сегодняшний день используют массу ароматических веществ высокого качества для фальсификации меда.

Существуют способы определения ботанического происхождения медов, основанные на известном факте, что в нектарах собранных с цветков растений медоносными пчелами присутствуют пыльцевые зерна [1]

Предложен способ определения ботанического происхождения меда с помощью анализа ДНК (заявка RU 2015148090 от 09.11.2015) [2]. Для выделения ДНК используется специальный лизирующий буфер, содержащий детергент цетилтриметиламмония бромид, антиоксидантдитиотреитол, связывающий фенольные соединения поливинилтирролидон, высокую концентрацию хлорида натрия, комплексообразователь N, N, N¹, N¹ -этилендиаминтетраусусную кислоту, буферную соль трис-гидрохлорид, процесс разрушения (лизиса) совмещается с ультразвуковой обработкой препарата, а непосредственное определение индивидуального медоноса-источника нектара при сборе меда осуществляется с помощью полимеразной цепной реакции методом гель-электрофореза.

Недостатками данного способа является использование дорогостоящих реактивов, его трудоемкость для установления всех индивидуальных медоносов - источников нектара.

Известен ГОСТ 31769-2012 [3], в котором предложен метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен. Он предусматривает использование 10 г меда растворенного в 20 мл дистиллированной воды, при температуре 40°С, центрифугирование раствора в течение 10 мин при ускорении 1000g, слив надосадочной жидкости добавление к осадку 20 мл дистиллированной воды, повторное центрифугирование в течение 5 мин при ускорении 1000g. Затем надосадочную жидкость декантируют, центрифужную пробирку помещают на фильтровальную бумагу под углом 45° для удаления остатков жидкости, осадок перемешивают микробиологической петлей и переносят на предварительно прогретое 40°С предметное стекло и равномерно распределяют по площади 22×22 мм микрошпателем. Каплю глицеринового желатина, разогретого до 40°С, распределяют крестообразно (по диагонали) на покровном стекле и медленно опускают на высушенный осадок, который для оптимального набухания пыльцы добавочно подогревают в течение 5 мин при 40°С. Микроскопирование препарата проводят после застывания глицеринового желатина. Вычисляют среднеарифметическое значение каждого выявленного морфологического типа пыльцы, сумму среднеарифметических значений и частоту их встречаемости.

Недостатками данного способа в результате центрифугирования раствора меда происходит деформирование пыльцевых зерен, что в значительной мере затрудняет их последующую идентификацию, а также образование сгустков слипшихся зерен пыльцы, которые невозможно разъединить и равномерно распределить по предметному стеклу петлей. (Фиг. 1, 2).

Наиболее близкой к предлагаемому способу является методика определения пыльцы в меде [4], принятая нами в качестве прототипа. Исследуемую пробу 9 не менее 200 г) отбирают по ГОСТ 31766-20-12, ГОСТ 19792-2001. Закристаллизовавшийся мед декристаллизуют на водяной бане. Сотовый незакристаллизовавшийся мед отделяют от сотов фильтрацией без нагрева. Сотовый закристаллизовавшийся мед декристаллизуют в термостате, затем отделяют от сотов фильтрацией. Пробу тщательно перемешивают. В мерную колбу объемом 150 мл наливают 100 мл пробы меда, нагретой до температуры 50…60°С.

Суть методики заключается в том, что из пробы микропипеткой берут каплю меда, объем которой составляет около 100 мкл) и готовят препарат для световой микроскопии. Пыльцевые зерна идентифицируют, затем высчитывают количественное и процентное отношение отдельных их видов из числа учтенных. Дозаторной пипеткой отбирают 100 мкл меда из мерной колбы (глубина 40 мл), переносят его на предметное стекло и равномерно распределяют гранью покровного стекла по площади 18×18 мм. Далее покровное стекло медленно во избежание воздушных пузырьков опускают на мед.

Для проведения анализа используют лабораторные весы с пределом абсолютной погрешности не более 0,01 г, пипеточный одноканальный дозатор переменного объема по ТУ 9452-002-33189998-2002, световой биологический микроскоп с увеличением 100-600, фотокамеру, адаптированную к микроскопу и компьютер, конусный матерчатый фильтр, термостат и водяную баню.

Просмотр и подсчет пыльцевых зерен под микроскопом проводят при увеличении 100. идентифицируют пыльцевые зерна под микроскопом при увеличении 400 и 600. За результат испытаний принимается среднеарифметическое значение трех проб, взятых с различной глубины образца.

Недостатками рассматриваемой методики являются: невозможность обнаружения пыльцевых зерен в предложенном объеме, в частности, в акациевом и липовых медах, в которых количество пыльцевых зерен в 1 г не превышает 15 единиц, а в кипрейном - 1-2 единиц. В этом случае во взятом объеме 100 мкл (0,1 мл), их можно вообще не обнаружить, что ставит под сомнение достоверность полученных результатов; далее по методике, нанесение на предметное стекло путем физического вытеснения из капиллярной трубки объемом 100 мкл сомнительно, так как в любом случае часть меда, включая и пыльцевые зерна, останется на стенках трубки; нагревание образца меда до температуры 50-60°С неизбежно приведет к деформации пыльцевых зерен (тепловая денатурация белков) [5], что затруднит их идентификацию.

В силу вышеизложенных недостатков достоверность получаемых результатов по данной методике вызывает сомнение, и она не приемлема для определения истинного соотношения пыльцевых зерен, которое определяет ботаническое происхождение меда.

Задачей изобретения является разработка объективного, простого в исполнении и воспроизводстве способа определения ботанического происхождения меда, основанного на сохранении морфологических особенностей пыльцевых зерен и их пространственного расположения, что позволит определить истинное содержание их и одновременно значительно снизить трудоемкость исследований и материальные затраты.

Сущность метода заключается в том, что центробежный образец меда объемом не менее 200 мл свежий или разогретый на водяной бане, в случае, если мед закристаллизован, до температуры, не превышающей 30°С во избежание деформации пыльцевых зерен, размешивается и наносится стеклянной палочкой на предметное стекло в количестве одной естественной капли, которую закрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом при увеличении 400 для изучения морфологических особенностей (борозд, ор, пор, характер апертур, текстура, скульптура, замер полярной оси и экваториального диаметра пыльцевого зерна), идентифицируют для дальнейшего подсчета пыльцевых зерен. Естественная капля - это относительно небольшой объем жидкого вещества, ограниченный поверхностью, обусловленной преимущественно действием сил поверхностного натяжения. Капля образуется при медленном истечении жидкости из небольшого отверстия или стекании ее с края поверхности [7].

На следующем этапе подсчитывают количественное присутствие каждого типа пыльцевых зерен при увеличении 100 в 10 полях зрения (Фиг. 3) в 5 каплях исследуемого образца. Многократная повторность (50) позволяет статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Экспериментальные данные обрабатывают с использованием пакета прикладных программ Snedecor V4 [8]. За результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов пяти параллельных определений (5 капель), полученных в условиях повторяемости согласно ГОСТ ISO 5724-6 [6], где ∑_(1+2+…i) - сумма среднеарифметических значений общего количества подсчитанных пыльцевых зерен каждого идентифицированного типа и вычисляют частоту встречаемости рассчитывают по формуле: К=i/∑_(1+2+…i), где i - выявленные типы пыльцевых зерен.

Ботаническое происхождение меда определяют исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен: в случае присутствия пыльцевых зерен одного морфологического типа превышающего 45%, исследуемый образец меда считается монофлерным, от 16 до 45% -составной частью смешанного меда (полифлерный), от 0 до 16% не принимается в расчет.

Пример

Образец объемом 200 мл свежего центробежного меда тщательно перемешивается стеклянной палочкой и наносится в размере одной естественной капли на предметное стекло, закрывается покровным стеклом и далее исследуется под микроскопом при увеличении 400 морфологическое строение пыльцевых зерен.

Экспериментальные данные обработаны с использованием пакета прикладных программ Snedecor V4 [8]. Результат вычислений представляли в виде значения, округленного до сотых долей в диапазоне частоты встречаемости от 0,1 до 1,0; десятых долей от 1,0 до 10,0; целых чисел от 10,0 до 100,0.

Подсчитывается общее количество пыльцевых зерен каждого морфологического типа, встреченных в 10 счетных полях при увеличении 100, в одной капле меда:

пыльцевые зерна дягиля в первой капле 251,2±11,91, во второй капле 283,0±22,22, в третьей капле 288,5±11,02, в четвертой капле 240,8±14,01, в пятой капле 241,5±1,68;

пыльцевые зерна борщевика сибирского - 24,5±6,21, 29,3±5,21, 24,9±4,20, 28,7±4,27, 28,9±3,14 соответственно;

пыльцевые зерна купыря лесного: 16,2±0,70, 9,1±0,67, 10,7±0,70,10,1±0,89, 10,1±0,71, т.д. в соответствии с таблицей.

Затем определяется среднеарифметическое значение каждого морфологического типа пыльцы 10 счетных полей в 5 каплях меда, где среднеарифметическое значение пыльцевых зерен дягиля составило 261,0±10,31, борщевика сибирского - 27,1±1,12, купыря лесного -11,2±1,27 и т.д. (табл.). Многократная повторность (50) позволила статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Подсчитывается сумма среднеарифметических значений общего количества пыльцевых зерен во всех счетных полях, всех встреченных морфологических типов, которая составила 341,5 и определяется частота встречаемости, т.е. процентное соотношение пыльцевых зерен, где частота встречаемости пыльцевых зерен дягиля составила К=(261,0/341,5) ×100=76,42%, частота встречаемости пыльцевых зерен борщевика сибирского К=(27,1/341,5)×100=7,93%, частота встречаемости пыльцевых зерен купыря лесного К=(11,2/341,5)×100=3,27% и т.д. (табл.).

Ботаническое происхождение меда определили исходя из процентного присутствия пыльцевых зерен дягиля, частота встречаемости которых составила 76,42%. Результаты анализа показали, что исследуемый мед является монофлерным, собранным в основном с дягиля.

Многократная повторность (50) позволила статистически точно определить средневзвешенное число идентифицированных типов пыльцевых зерен с минимальной ошибкой.

Предлагаемый нами способ определения ботанического происхождения меда является объективным, простым в исполнении и воспроизводстве способом, основанным на сохранении морфологических особенностей пыльцевых зерен, что позволяет определить истинное содержание их и одновременно значительно снизить трудоемкость исследований и материальные затраты.

Список используемой литературы

1. Демианович, З. Вклад польских ученых в исследование в развитие пчелоботаники // Докл. XXIV Междунар. конгр. по пчеловодству. - Буэнос-Айрес (Аргентина), 1973. - С. 469-471.

2. Заявка на изобретение РФ 2015148090 Опубликовано 11.05.2015, Бюл. 14. Способ определения ботанического происхождения меда с помощью анализа ДНК

3. ГОСТ 31769-2012. Мед. Метод определения частоты встречаемости пыльцевых зерен. Москва: Стандартинформ, 2014 - 15 с. Введен 2013-07-01

4. Халько А.Н. Методика определения пыльцы в меде. Пчеловодство. 2014. №5.

5. Поттхаст К, Ферментативная реакция в пищевых продуктах с низким содержанием влаги / К Поттхаст, Р. Хамм, Л. Аккер Вода в пищевых продуктах 1980, Москва: Пищевая промышленность. - С. 222-231

6. ГОСТ ISO 5725-6. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 6. Использование значений точности на практике. Госстандарт России. 2002.

7. Многоликая планета: Вода. Бук Хаус.2005, 296 с., ISBN 5-98641-008-4

8. Сорокин, О.Д. Прикладная статистика на компьютере. - Краснообск, ГУП РПО СО РАСХН, 2004. - 162 с.