Результат интеллектуальной деятельности: Способ контроля специфичности лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл по содержанию антител методом иммуноферментного анализа

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии.

Аналогом предлагаемого способа может считаться «НАБОР ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АВЕРМЕКТИНОВ МЕТОДОМ ОДНОСТАДИЙНОГО КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА», описанный в патенте РФ №2416094. Набор реагентов для количественного определения авермектинов содержит конъюгат авермектина с бычьим сывороточным альбумином, иммобилизованный на полистироловом планшете, пероксидазный конъюгат высокоспецифических мышиных моноклональных антител к ивермектину, калибровочные пробы авермектина (с концентрациями от 0 до 100 нг/мл). Моноклональные антитела (МКАТ), входящие в набор, продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus. Musculus L., депонированным в Коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского под №05/09. Из неспецифических компонентов набор содержит буфер для разведения конъюгата МКАТ с пероксидазой хрена, буфер для разведения анализируемых проб и промывки планшетов, реагенты для выявления пероксидазной активности, субстратный раствор, перекись водорода и тетраметилбензидин, стоп-раствор (1 М серная кислота). Набор по изобретению предназначен для выявления остаточных количеств авермектинов в тканях и биологических жидкостях для контроля химической контаминации продуктов животноводства. (см. патент России №2416094, кл. МПК G01N 33/02; опубл. 10.04.2011.)

Данный способ имеет ряд существенных недостатков. Тестируемое, вещество является антигеном и фиксируется на планшете. В то время как при нашем способе на планшете фиксируются известные антигены - бактерии, антитела к которым планируется обнаружить в лактоглобулине, что позволяет контролировать в промежуточных стадиях производства и в готовой продукции. В обоих случаях использован конъюгат белка А с пероксидазой хрена. Однако в аналоге конъюгатом метят антиген, которым сенсибилизируют лунки планшета, в нашем способе оценки специфичности лактоглобулина конъюгат используют на стадии учета реакции антигена и антитела. Таким образом, в аналоге использован метод одностадийного конкурентного иммуноферментного анализа. В то время как для определения специфичности лактоглобулина у нас использован прямой неконкурентный 2-х этапный метод.

Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл (ЛГ-УПБС) - уникальный отечественный иммунобиологический препарат - представляет собой очищенную фракцию глобулинов иммунного молозива коров и содержит антитела к S. thyphimurium, S. enteritidis, S. dublin, P. mirabilis, P. vulgaris, K. pneumoniae, P. aeraginosa. ЛГ-УПБС предназначен для лечения острых кишечных инфекций (ОКИ) и коррекции нарушений микробиоты кишечника после антибиотикотерапии. Производителем ЛГ-УПБС является ФБУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии, (см. прил.) В 2010 г. выпуск ЛГ был временно приостановлен из-за физического и морального старения производства. Возобновление выпуска ЛГ актуально в связи с ростом антибиотикорезистентных УПБ в качестве альтернативного средства, не вызывающего привыкания. Одним из важных моментов в модернизации получения ЛГ-УПБС является контроль специфичности препарата. В соответствии с производственным регламентом контроль наличия антител в ЛГ-УПБС проводится на нескольких этапах производства: в исходном сырье (иммунное молозиво); в лактосыворотке (промежуточный продукт) и в готовом препарате.

Прототипом предлагаемого способа является реакция пассивной гемагтлютинации агглютинации (РПГА) с оригинальными эритроцитарными диагностикумами, получаемыми в свое время на производстве лактоглобулинов на базе липополисахаридов S. thyphimurium, S. enteritidis, S. dublin, P. mirabilis, P. vulgaris, K. pneumoniae, P. aeruginosa, выделенных методом водно-фенольной экстракции по Westphal, сорбированных на эритроцитах барана. В последнее время РПГА давала ложноположительные результаты из-за нестабильности работы контролей - в основном, связанные с эритроцитами барана. Кроме того, оценка реакции проводилась субъективно по 4-х крестной системе с визуальным распознаванием осадка в лунках в виде «зонтика» (рыхлый осадок на дне лунки) и «пуговки» (осадок в лунке сконцентрирован по центру), (см. приложение)

В связи с этим, целью работы является подбор объективного способа контроля специфичности лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл на основе метода ИФА, дающего результаты, сопоставимые с ранее используемой РПГА.

Преимущество предлагаемого изобретения заключается в том, что ИФА-метод объективный (т.е. определение проводится с помощью прибора мультискана, а при РПГА субъективно по наличию характерного осадка). По условиям производства мы можем поменять метод контроля специфичности на новый, при его сопоставимости с предыдущим.

СОП (стандартный образец производства) представляет собой лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл коровий с активностью в ИФА не более 62,5 мкг препарата в объеме 10 мкл ФСБР.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

1. Подготовительный этап

1) Подготовка проб лактоглобулина.

500 мг сухого ЛГ-УПБС растворяли в 10 мл очищенной воды, получали исходную концентрацию препарата 50 мг/мл. В пробирках готовили двукратные серийные разведения в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР), начиная с 1:2 до 1:128, получая соответственно от 500 мг до 3,9 мг в 1 мл.

2) Сенсибилизация планшета.

Культуры бактерий (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonitta enteritidis, Salmonella dublin) пересевали на скошенный микробиологический агар. Культивировали при 37 град С 18-24 часа. Затем смывали культуру ФСБР. Стандартизировали микробную взвесь до 1 млрд м.т./мл. Полученную взвесь кипятили на водяной бане 15 минут. Охлаждали до 20 град С., прибавляли раствор мертиолата 1:10000. Полученные антигены хранятся в холодильнике при 8±2 град. С в течение 3 мес.

3) Подготовка контролей.

Для контролей ИФА приготавливали поликомпонентный антиген. Полученные антигены с помощью дозатора отбирают по 1 мл каждого наименования и переносят в пробирку. Тщательно перемешивали (Смесь храниться 1 мес.в холодильнике в укупоренном состоянии при 8±2 град. С).

4) Приготовление компонентов ИФА.

Приготовление конъюгата осуществляют в соответствии с инструкцией. В качестве конъюгата используют белок А золотистого стафилококка, конъюгированный с пероксидазой хрена. В качестве растворителя используют ФСБР. Конъюгат приготавливают ex temporae. Субстратная смесь состоит из тетраметилбензидина (ТМБ) и перекиси водорода. Раствор субстрата приготавливают ex temporae.

Изобретение проиллюстрировано рисунком, где отображена схема внесения компонентов для выполнения ИФА. (см. фиг. 1)

2. Постановка ИФА (рис. на фиг. 1).

1) Сенсибилизация полистеролового планшета

Сенсибилизацию проводили с помощью дозатора по 100 мкл антигенов в каждую лунку столбцами от А до Н. Каждая цифра от 1 до 7 соответствуют разным антигенам УПБ и сальмонелл. В лунку 12-G и 12-Н вносят по 100 мкл поликомпанентного антигена (контроль антител положительный и отрицательный). После внесения антигенов планшет перекрывается крышкой и оставляется при 8±2 град. С на 18-24 часа.

2) Внесение лактоглобулина.

Приготовленный в разведениях лактоглобулин вносят в каждую лунку планшета по 100 мкл. Распределяют соответственно: А - 500 мг; В - 250 мг; С - 125 мг; D - 62,5 мг; Е - 31,25 мг; F - 15,6 мг; G - 7,8 мг; Н - 3,9 мг. Концентрация препарата понижается сверху вниз (от А к Н). После внесения лактоглобулина планшет инкубируют при 37 град. С в течение часа.

3) Внесение контролей

Положительный контроль (антитела - СОП) и отрицательный контроль антител - не иммунная сыворотка вносится в количествве по 100 мкл в лунки планшета G-12 и Н-12). Инкубация контролей проходит в том же режиме, что и лактоглобулин.

4) Внесение конъюгата.

Конъюгат вносят из расчета 100 мкл в каждую рабочую лунку и в лунку F-12 (контроль конъюгата). Планшет после этой манипуляции инкубируют при 37 град. С в течение часа. Субстратную смесь вносят во все рабочие лунки по 100 мкл. Планшет выдерживают 20 минут при 20 град. С в защищенном от света месте. Затем вносят по 20 мкл стоп-реагента.

5) Учет реакции.

Считывание результатов проводили на мультискане при длине волны 450 нм. Полученная оптическая плотность в отрицательном контроле должна быть в два раза и более ниже показателей положительного контроля. Референсные значения уровня оптической плотности должны находиться в пределах не менее 0,500-0,600. Контроль конъюгата должен быть положительным (давать цветность не менее 0,500-0,600).

При подборе оптимальных количеств антигенов и лактоглобулина были использованы 3 варианта 200 мкл, 100 мкл и 50 мкл, предложенные в примерах 1, 2, 3.

Пример 1. Определение наличия антител в лактоглобулине при сенсибилизации планшета антигенами в количестве 200 мкл в одной лунке.

Способ осуществляли по схеме, предложенной на фиг, 1. Сенсибилизацию планшета антигенами Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonilla осуществляли микродозатором в дозе по 200 мкл в 1 лунку. Далее опытный образец лактоглобулина вносили в количестве 200 мкл в 1 лунку. Конъюгат и субстратную смесь также вносили по схеме в количестве 200 мкл в 1 лунку. Оценку ИФА реакции осуществляли мультисканом при длине волны 450 нм. Показатели оптической плотности в соответствии количества 62,5 мг/мл белка находились в пределах 522-600 ед. При этом контроль конъюгата давал показатели 650 ед. оптической плотности, положительный контроль антител 600 ед. оптической плотности.

Пример 2. Определение наличия антител в лактоглобулине при сенсибилизации планшета антигенами в количестве 50 мкл в одной лунке.

Способ осуществляли по схеме, предложенной на фиг. 1. Сенсибилизацию планшета антигенами Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonilla осуществляли микродозатором в дозе по 50 мкл в 1 лунку. Далее опытный образец лактоглобулина вносили в количестве 50 мкл в 1 лунку. Конъюгат и субстратную смесь также вносили по схеме в количестве 50 мкл в 1 лунку. Оценку ИФА реакции осуществляли мультисканом при длине волны 450 нм. Показатели оптической плотности в соответствии количества 62,5 мг/мл белка находились в пределах 450-520 ед. При этом контроль конъюгата давал показатели 400 ед. оптической плотности, положительный контроль антител 300 ед. оптической плотности.

Пример 3. Определение наличия антител в лактоглобулине при сенсибилизации планшета антигенами в количестве 100 мкл в одной лунке.

Способ осуществляли по схеме предложенной на фиг. 1. Сенсибилизацию планшета антигенами Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium, Salmonilla осуществляли микродозатором в дозе по 100 мкл в 1 лунку. Далее опытный образец лактоглобулина вносили в количестве 100 мкл в 1 лунку. Конъюгат и субстратную смесь также вносили по схеме в количестве 100 мкл в 1 лунку. Оценку ИФА реакции осуществляли мультисканом при длине волны 450 нм. Показатели оптической плотности в соответствии количества 62,5 мг/мл белка находились в пределах 500-600 ед. При этом контроль конъюгата давал показатели 500 ед. оптической плотности, положительный контроль антител 600 ед. оптической плотности.

Сопоставление оптической плотности, полученной в результате оценки постановок ИФА с разным количеством вносимых антигенов и образцов препарата выявили близкие показатели при 200 мкл и 100 мкл веществ в лунках. Оптимальным количеством вносимых веществ признано 100 мкл веществ в лунку (пример 3).