Результат интеллектуальной деятельности: Питательная среда для выделения и идентификации неферментирующих бактерий

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения и идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий (НФБ) из клинического материала: отделяемого ран, мокроты, мочи, кала, с подозрением на загрязнение нормальной микрофлорой.

Неферментирующие грамотрицательные бактерии являются одними из основных возбудителей внутрибольничных инфекций (ВБИ). Частота возникновения обусловленных НФБ внутрибольничных инфекций достигает 15% от всех ВБИ, связанных с аэробными и факультативно-аэробными грамотрицательными бактериями. При этом их видовой состав в последние годы существенно расширился.

Выделение штаммов НФБ на простых питательных средах типа мясо-пептонного агара или кровяного осложнено, поскольку в этих средах сильнее разрастаются культуры Staphylococcus и других сопутствующих бактерий, маскирующих присутствие НФБ, при этом идентификация НФБ на указанных средах также затруднена в связи с малой ферментативной активностью данных штаммов и относительной близостью их морфологических и культуральных признаков.

Для выделения штаммов НФБ, таких, как Pseudomonas aeruginosa, из клинических образцов и для дифференцирования их от других псевдомонад на основании формирования пигмента пиоцианина используют BD Pseudomonas Isolation Agar (агар для выделения псевдомонад. Агар содержит пептон Bacto (источник углерода и азота), противомикробный агент иргазан (Irgasan), избирательно ингибирующий сопутствующие грамположительные и грамотрицательные бактерии, в качестве источника энергии глицерин, способствующий выработке пигмента пиоцианина, а также хлорид магния и сульфат калия, способствующие формированию синего или сине-зеленого пигмента пиоцианина от P. aeruginosa. Данный пигмент диффундирует в среду, окружающую зону роста (Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-257002.04 Ред.: April 2013 http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=25359)

Для выделения и идентификации НФБ используют также дифференциально-диагностические среды нового поколения - флюорогенные и хромогенные, позволяющие идентифицировать различные микроорганизмы непосредственно в процессе культивирования на питательных средах на этапе первичного посева. Принцип действия указанных сред основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микроорганизмов. В состав этих сред входит хромогенный субстрат - вещество, при расщеплении которого ферментами, специфичными для определенного вида микроорганизмов, образуются окрашенные и/или флюоресцирующие продукты. В результате колонии искомых микроорганизмов и/или среда окрашиваются в определенный цвет, или приобретают способность к флюоресценции при ультрафиолетовом облучении.

Известна основа ХайФлюоро агара для Pseudomonas aeruginosa - HiFluoro Pseudomonas Agar Base (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия), предназначенная для селективного выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из клинического материала флюоресцентным методом, в состав которой входит цетримид для подавления роста сопутствующих микроорганизмов и флюорогенная смесь. P. aeruginosa при росте на среде разрушает флюорогенный субстрат, освобождая флюороген, который дает видимую флюоресценцию при ультрафиолетовом облучении (Инструкция по применению: http://art-medika.com/catalog/mikrobiologia/chromo/product-487.html (http://www.himedialabs.ru/m1469).

Известны хромогенные питательные среды, предназначенные для выделения неферментирующих бактерий Burkholderia cepacia из клинических образцов:

- BD Cepacia Medium (Becton Dickinson GmbH Heidelberg/Germany), содержащая источники азота (пептоны, сульфат аммония), фосфаты для поддержания стабильного рН, источник углерода (пируват натрия), факторы роста НФБ (магний, железо), а также ингибиторы для подавления сопутствующей микрофлоры (соли желчных кислот, кристаллический фиолетовый, тикарциллин и полимиксин В), и, в качестве индикатора рН -феноловый красный. В процессе метаболизма пирувата натрия происходит накопление ионов натрия, вызывающих повышение рН, что приводит к изменению цвета среды с желто-оранжевого на розовый или красный вокруг колоний В. cepacia и интенсивно-розовый в областях плотного роста (BD Cepacia Medium BD OFPBL Agar Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-254481.04 Ред.: Oct 2014: http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=25339):

- BD OFPBL Agar (Becton Dickinson GmbH Heidelberg/Germany), содержит ингибиторы сопутствующих бактерий (бацитрацин - ингибитор грамположительных микроорганизмов и Neisseria, полимиксин В - грамотрицательной микрофлоры), калия гидрофосфат для поддержания стабильного рН, и бромтимоловый синий в качестве индикатора рН. При ферментации лактозы в кислотные продукты, и, соответственно, понижении рН среды индикатор рН бромтимоловый синий изменяет цвет среды с синего на желтый, колонии В. cepacia также будут иметь желтый цвет. При этом в Инструкции по применению среды приведены ограничения применения среды, заключающиеся в том, что на агаре OFPBL возможен рост других микроорганизмов, например В. gladioli, которые внешне похожи на В. cepacia (желтые колонии), и подчеркнуто, что данная среда не должна использоваться в качестве единственной среды для идентификации В. cepacia. (BD Cepacia Medium BD OFPBL Agar Инструкции по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-254481.04 Ред.: Oct 2014: www.bd.com/resource.aspx?IDX=25919).

Таким образом, известные питательные среды зарубежного производства, предназначенные для выделения отдельных видов НФБ, не обеспечивают возможности одновременного выделения и идентификации нескольких видов НФБ, особенно при проведении широкомасштабного эпидемиологического мониторинга за ассоциациями штаммов НФБ, циркулирующими внутри стационаров, к тому же являются дорогостоящими.

Известна также отечественная дифференциально-диагностическая среда для выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий (SU 1351975), которая содержит селективный агент - 2,3,5-трифенил-тетразолий хлористый и, в качестве индикатора - бромтимоловый синий, и позволяет выделить НФБ из клинического материала и дифференцировать их от ферментирующих сахара энтеробактерий и протеев.

Указанная среда имеет следующий состав:

Данная среда, являясь хромогенной, обеспечивает окраску группы неферментирующих бактерий в бордовый цвет, ферментирующих - в желтый цвет, Proteus mirabilis формирует колонии черного цвета. Но указанная среда не обеспечивает дифференциацию между отдельными представителями неферментирующих бактерий.

Целью предлагаемого изобретения является дифференциально-диагностическая среда, позволяющая проводить дифференциацию неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичную дифференциацию разных представителей неферментирующих бактерий по изменению цвета среды и/или колоний бактерий, и содержащая отечественные ингредиенты.

Поставленная задача достигается введением в состав питательной среды двухкомпонентной индикаторной системы (феноловый красный + бромтимоловый синий), обеспечивающей дифференциацию неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичную дифференциацию разных представителей НФБ по изменению цвета колоний и характеру роста. Добавление карбоната кальция предотвращает чрезмерное закисление среды продуктами жизнедеятельности бактерий. Среда содержит отечественные ингредиенты.

Предлагаемая питательная среда (МодСИ - Модифицированная Среда с Индикатором) имеет следующий состав:

Способ приготовления питательной среды МодСИ. Для приготовления 1 литра среды навески ингредиентов (питательный бульон сухой, экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред, Д-глюкоза, Д-галактоза, натрия хлорид, натрий серноватистокислый, железо (III) лимоннокислое водное, натрий углекислый, натрий сернистокислый, феноловый красный, бромтимоловый синий, кальций углекислый, агар микробиологический) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, доводят объем до 1 литра, нагревают до кипения до полного растворения ингредиентов; рН среды доводят до 7,5±0,1. Среду МодСИ разливают по флаконам и стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 минут. Готовая среда сиренево-розового цвета, непрозрачная. Перед употреблением флакон со средой расплавляют на кипящей водяной бане и разливают в стерильные чашки Петри по 15-20 мл. Готовые чашки со средой МодСИ хранят при температуре +6 С° в течение недели.

Пример 1. Подбор концентраций индикаторов в составе среды МодСИ Предлагаемая питательная среда МодСИ приготовлена по вышеуказанному способу в 2-х вариантах, отличающихся концентрацией индикаторов: феноловый красный и бромтимоловый синий при добавлении в среду МодСИ использованы в двух концентрациях: по 0,025 г и по 0,05 г.

Вариант 1

Вариант 2

Для определения оптимальных концентраций индикаторов в составе среды использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia № B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520. Указанные тест-штаммы выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) 24 часа при +37°С, выросшие культуры смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (0,85%), готовят взвесь бактерий по оптическому стандарту мутности 10 ME и титруют до содержания 1000 мт/мл. 0,1 мл полученной взвеси культур высевают сплошным газоном шпателем Дригальского на 2 варианта предлагаемой среды МодСИ. Посевы инкубируют при +37°С в течение 24 час. Эффективность роста бактерий и дифференцирующие свойства 2 вариантов МодСИ определяют по количеству колониеобразующих клеток (КОЕ) и по изменению цвета колоний и характеру роста.

Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, установлены оптимальные концентрации в составе предлагаемой питательной среды МодСИ индикаторов феноловый красный - 0,05 г и бромтимоловый синий - 0,05 г (вариант 2), при которых эффективность роста неферментирующих бактерий составляет 91-97 КОЕ, а дифференцирующие свойства среды обеспечивают различие разных представителей неферментирующих бактерий между собой, в отличие от среды по варианту 1 с концентрацией индикаторов - 0,025 г.

Пример 2. Эффективность роста бактерий (НФБ, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков) на предлагаемой среде МодСИ (в сравнении с дифференциально-диагностической средой по SU 1351975, питательной средой Эндо и желточно-солевым агаром).

При изучении эффективности роста бактерий использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia №B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520; грамотрицательные энтеробактерий - Escherichia coli M-17, Proteus vulgaris №869, Proteus mirabilis №878, Klebsiella pneumoniae №63, Salmonella typhimurium №67, Salmonella enteritidis №2269, Salmonella dublin №1976; грамположительные кокки - Staphylococcus aureus №209-p, Staphylococcus epidermidis №136.

Указанные тест-штаммы выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре (МПА) 24 часа при +37°С, выросшие культуры смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (0,85%), готовят взвесь бактерий по оптическому стандарту мутности 10 ME, и титруют до содержания 1000 мт/мл. 0,1 мл полученной взвеси культур высевают сплошным газоном шпателем Дригальского: на предлагаемую среду МодСИ - все тест-штаммы (НФБ, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков); на дифференциально-диагностическую среду по SU 1351975 - тест-штаммы НФБ, грамотрицательных энтеробактерий; на питательную среду Эндо - тест-штаммы грамотрицательных энтеробактерий; на желточно-солевой агар - тест-штаммы стафилококков. Посевы инкубируют при +37°С в течение 24 час. Учитывают количество колониеобразующих клеток (КОЕ), и процент высеваемости на чашках со средой, исходя из количества микробных тел в 1 мл микробной взвеси.

Результаты представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, на предлагаемой питательной среде МодСИ эффективность роста неферментирующих бактерий составила 91-97 КОЕ (91-97%), что сопоставимо с результатами роста НФБ на дифференциально-диагностической среде по SU 1351975 (91-100 КОЕ).

При этом установлена также достаточно высокая эффективность роста на предлагаемой среде грамотрицательных энтеробактерий (КОЕ 91-98) и стафилококков (КОЕ 90-92), соответствующая показателям роста указанных бактерий на элективных, питательных средах (среда Эндо для грамотрицательных энтеробактерий, ЖСА - стафилококков), что позволит использовать МодСИ для выращивания широкого спектра микроорганизмов.

Пример 3 Изучение дифференцирующих свойств предлагаемой питательной среды МодСИ и контрольных сред для неферментирующих бактерий, грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков

При изучении дифференцирующих свойств МодСИ использовали следующие тест-штаммы: НФБ - Pseudomonas aeruginosa №453, Burkholderia cepacia № B-7518, Stenotrophomonas maltophilia № B-7520; грамотрицательные энтеробактерий - Escherichia coli M-17, Proteus vulgaris №869, Proteus mirabilis №878, Klebsiella pneumoniae №63, Salmonella typhimurium №67, Salmonella enteritidis №2269, Salmonella dublin №1976; грамположительные кокки - Staphylococcus aureus №209-p, Staphylococcus epidermidis №136. Указанные тест-штаммы выращивают, готовят взвесь, и высевают на чашки с испытуемыми средами, как указано в примере 2.

Данные по изучению дифференцирующих свойств представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 2, на предлагаемой питательной среде МодСИ тест-штаммы НФБ (P.aeruginosa, B.cepacia, S.maltophilia) отличались по цвету колоний и характеру роста как от тест-штаммов других бактерий (грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков), так и между собой.

Таким образом, из вышеприведенных таблиц следует, что на предлагаемой среде МодСИ эффективность роста всех микроорганизмов, взятых в качестве тест-штаммов, достаточно высока и сопоставима со средами, предназначенными для выделения и дифференциации соответствующих микроорганизмов (среда Эндо для грамотрицательных энтеробактерий, ЖСА - для стафилококков, дифференциально-диагностическая среда для выделения неферментирующих грамотрицательных бактерий по SU 1351975), что свидетельствует о возможности использования МодСИ для выращивания широкого спектра микроорганизмов.

При оценке дифференцирующих свойств среды МодСИ установлено, что предлагаемая среда позволяет по цвету колоний и характеру роста отличить тест-штаммы НФБ (P.aeruginosa, В.cepacia, S.maltophilia) как от тест-штаммов других бактерий (грамотрицательных энтеробактерий, стафилококков), так и между собой.

Таким образом, предлагаемая питательная среда МодСИ может быть использована для дифференциации неферментирующих бактерий от ферментирующих и, одновременно, первичной дифференциации разных представителей неферментирующих бактерий, по изменению цвета среды и различному цвету колоний, при первичном посеве образцов клинического материала, и, что особенно важно, при эпидемиологическом мониторинге за штаммами НФБ, циркулирующими в стационаре.