Результат интеллектуальной деятельности: Способ формирования тканевых матриц для гистологического исследования

Метод тканевых матриц (tissue microarray) используется в практике специальности патологическая анатомия и научных исследования для одномоментного проведения изучения множественных образцов ткани (гистологических срезов), представленных на одной поверхности предметного стекла. Тканевая матрица (тканевой мастер-блок, гистологический парафиновый мультиблок) представляет собой парафиновый блок-реципиент, в который встроены множественные тканевые столбики, извлеченные из стандартных парафиновых блоков-доноров и организованные в виде упорядоченной последовательности (матрицы) [Криволапов Ю.А., Храмцов А.И. Применение тканевых матриц в иммуногистохимии / Криволапов Ю.А., Храмцов А.И.// Архив патологии. - 2005. - Т. 67, №2. - С. 48-50.][Г.Ф. Храмцова. Тканевые матрицы - современный метод патологической анатомии / Г.Ф. Храмцова, А.И. Храмцов, Н.М. Хмельницкая // Библиотека патологоанатома. - 2013. №138 - 23 С.]. Тканевая матрица позволяют упорядочено сохранять и использовать большое количество образцов тканей и более эффективно и экономично проводить традиционные гистологические, иммуногистохимические и молекулярные исследования.

Необходимость создания тканевых матриц определяется высокой значимостью соблюдения стандартов и одинаковых условий при проведении разнообразных исследований большого количества образцов. Использование тканевых матриц так же позволяет экономить дорогостоящие расходные материалы (например, моноклональные антитела при иммуногистохимических исследованиях) и значительно снизить затраты времени, в связи с одномоментным проведением исследования сразу для нескольких десятков образцов тканей. При этом появляется возможность проводить забор и подвергать исследованию только интересующие столбики ткани из первичного образца, тем самым сокращается расход реактивов и времени оценки результатов специалистом.

Традиционный метод формирования тканевых матриц, включает в себя использование для фиксации и ориентировки фрагментов блока-реципиента - специальной решетки из гистологического парафина с множественными ячейками, которые заполняются столбиками исследуемых образцов тканей. Впервые этот способ был предложен Petrosyan K. и Press M.F [K. Petrosyan. Multispecimen tissue blocks in pathology: an improved technique of preparation. Laboratory Investigation. / K. Petrosyan, M.F. Press //; A Journal of Technical Methods and Pathology. - 1997. - Vol. 77, №5. - P. 541-542.]. Выделение столбиков ткани и установление их в блок реципиент может выполняться вручную при помощи специального инструмента - панчера, либо при помощи разработанных позднее автоматизированных систем создания тканевых матриц [J. Kononen. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens / J. Kononen, L. Bubendorf, A. Kallioniemi et al.// Nature Medicine. - 1998. - Vol. 4, №7. - P. 844-847]. В общих чертах, с незначительными модификациями данную методику применяют и в настоящее время [С.В. Fowler. Tissue microarrays: construction and uses. / C.B. Fowler, Y.G. Man, S. Zhang et. al.//. Methods Mol Biol. - 2011. - №724. - P. 23-35] [J.P. Brown. Science made simple: tissue microarrays (TMAs) / John P. Brown, A. Chandra. // BJU International. - 2014. Vol. 114, №2. - P. 294-305]. В качестве прототипа рассматривается модификация, предложенная Wan и соавт. [VOGEL U. Overview on Techniques to Construct Tissue Arrays with Special Emphasis on Tissue Microarrays// Microarrays. - 2014. - Vol. 3. - P. 103-136], где исследуемые образцы устанавливались на подложку, основой которой являлась рентгеновская пленка. Недостатками вышеописанных технологий является:

1. неполная однородность блока-реципиента и столбиков тканей при которой необходимо использование специальных адгезивных лент, для предотвращения выпадения отдельных исследуемых фрагментов из гистологических срезов, что усложняет процесс;

2. необходимость затрат на приобретения блоков реципиентов или форм для их самостоятельного изготовления;

3. ограничение в выборе размеров и формы блока-реципиента, количества исследуемых фрагментов, связанные с имеющейся формой или приобретенным блоком, а также использование блока-реципиента является дополнительным этапом в проведении исследования, увеличивающим его длительность.

4. при использовании в качестве основы полимерной пленки (в т.ч. рентгеновской) возникает высокая вероятность искривления плоскости основы и риск частичного/полного всплытия тканевой матрицы в жидком парафине из-за недостаточной плотности и жесткости пленки.

Для преодоления недостатков традиционных методов в серии собственных наблюдений и экспериментов был разработан собственный способ формирования тканевых матриц. Он заключается в установке столбиков ткани, извлеченных с помощью панчера из реципиентных блоков на ровную 3-х компонентную стальную основу с последующим изготовлением мультиблока без использования парафиновой матрицы-реципиента путем прямой заливки парафином столбиков ткани, установленных на адгезивную поверхность с металлической основой. Отказ от приобретения или самостоятельного изготовления блока-реципиента позволяет снизить себестоимость и продолжительность проведения исследования, при этом неподвижность и сохранение заданной позиции столбиком ткани обеспечивается адгезивными свойствами поверхностного слоя основы. Адгезия столбиков исследуемых тканей к матричной основе также позволяет проводить переплавку тканевой матрицы без смещения позиции фрагментов, что упрощает изготовление гистологических срезов с мультиблока на микротоме и повышает их качество. Также существует возможность свободного выбора наиболее подходящего количества и конфигурации расположения столбиков исследуемых тканей в зависимости от конкретной ситуации и задачи исследования. Использование в качестве 1 слоя основы тонкой стальной пластинки толщиной 350 мкм обеспечивает расположение исследуемых фрагментов на одном уровне и предотвращает смещение и всплытие основы при заливке жидким парафином. Быстрое и простое отделение основы от готовой тканевой матрицы выполняется за счет промежуточного слоя вощеной бумаги с направляющими ярлычками толщиной 150 мкм. Поверхностный адгезивный слой основы представляет собой полипропиленовую пленку общей толщиной 45 мкм с равномерно нанесенным на нее акриловым клеем, что обеспечивает ориентировку и сохранение заданных позиций столбиками исследуемых материалов в ходе всех этапов изготовления тканевых матриц.

При проведении серии экспериментов с формированием 15 тканевых матриц (общее количество образцов составило 238) с использованием опытного образца разработанной адгезивной основы удалось добиться устойчивой высокой эффективности: при изготовлении тканевых матриц потери и смещения исследуемых столбиков ткани не наблюдалось, структура и взаиморасположение фрагментов тканей сохранялась на этапе изготовления гистологических срезов.