Результат интеллектуальной деятельности: Способ получения линий яровой мягкой пшеницы с укороченным сроком колошения

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в генетике и селекции зерновых культур.

Сроки наступления колошения у пшеницы являются важным фактором, определяющим адаптацию растений к условиям окружающей среды. У яровой мягкой пшеницы сроки колошения контролируются генами реакции на яровизацию (Vrn), основными из которых являются Vrn-A1, Vrn-B1, Vrn-D1, Vrn-В3, а также генами Ppd, определяющими чувствительность к фотопериоду (1, 2). Различное сочетание аллелей этих генов приводит к различным срокам колошения (3). При создании новых сортов яровой пшеницы необходимо учитывать сроки колошения для конкретной климатической зоны. Это позволит уменьшить влияние абиотических (засуха, холод) и биотических факторов (болезни, вредители) и тем самым предотвратить потери урожая, вызванные этими факторами. Проблемы классической селекции на сроки колошения связаны с трудностью подбора родительских пар для скрещивания, а также с длительностью самого селекционного процесса.

Известен, например, способ отбора форм пшеницы различной скороспелости и фотопериодической чувствительности, который осуществляют посредством выращивания растений пшеницы в условиях короткого дня до появления колоса из влагалища флагового листа и последующего отбора из гибридной популяции ранне- и поздне выколосившихся растений, которые дифференцируют, соответственно, как скороспелые слабочувствительные и позднеспелые сильночувствительные к фото периоду формы (4).

Известен способ определения у длиннодневных злаковых растений форм различной скороспелости и фотопериодической чувствительности (5), заключающийся в том, что из гибридных популяций, выращиваемых в условиях короткого светового дня (12 часов) в фазе выхода в трубку у полностью сформировавшихся листьев 4-6 ярусов 10-15-дневного возраста измеряют оптический коэффициент поглощения падающего монохроматического излучения в диапазоне длин волн 730-740 нм и дифференцируют растения по величине этого коэффициента при длине волны 730 нм. Растения с наиболее высоким коэффициентом поглощения относят к скороспелым слабочувствительным к фотопериоду формам, а с наиболее низким - к более позднеспелым сильночувствительным к фотопериоду формам.

Однако известные способы являются трудоемкими, так как требуют регулярного проведения фенотипической оценки индивидуальных растений и необходимости регуляции продолжительности светового дня.

Применение молекулярных маркеров позволяет сократить время и снизить трудозатраты по созданию форм яровой мягкой пшеницы, отличающихся сроками колошения.

Молекулярные или ДНК-маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции (ПЦР-маркеры) оказались широко востребованными в генетических исследованиях и селекции пшеницы для решения практических задач. Применение молекулярных маркеров в практической селекции обозначается термином МОС (маркер-ориентированная селекция). Основной принцип МОС заключается в идентификации тесного сцепления между маркером и геном, контролирующим признак, и использовании ассоциаций маркер-признак в практических целях для создания новых сортов и селекционных линий. В сочетании с методами классической селекции, МОС существенно сокращает время, необходимое для создания новых генотипов.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ создания линий яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням, заключающийся в том, что гибридную линию яровой мягкой пшеницы, содержащую фрагмент хромосомы с двумя генами от Aegilops speltoides: ген, определяющий удлинение срока колошения (VRN-Asp1), и ген устойчивости к бурой ржавчине (LrAsp5), скрещивают с линией, содержащей ген устойчивости к мучнистой росе (Pm) из генома ржи Secale cereale, и растения поколения F₁ самоопыляют до поколения F₂. Из поколения F₂ с помощью молекулярного ПЦР-маркера Pr1/Pr5 отбирают растения, содержащие гены VRN-Asp1 и LrAsp5 в гомозиготном состоянии. Отобранные с помощью ПЦР-маркера Pr1/Pr5 растения F₂ с генами VRN-Asp1 и LrAsp5 проверяют ПЦР-маркером SCM009 для выявления растений с геном Pm устойчивости к мучнистой росе (6). Использование заявленного способа позволяет создать линии яровой мягкой пшеницы с удлиненным сроком колошения и с комплексной устойчивостью к грибным болезням. Недостатками данного способа являются:

1. Отсутствие возможности получать линии яровой мягкой пшеницы с укороченным сроком колошения.

2. Ограниченные функциональные возможности способа, поскольку отбор на сроки колошения производится только по одному гену VRN-Asp1 и не учитывается влияние других аллелей генов Vrn и генов фотопериодической чувствительности Ppd.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего быстро отбирать растения яровой мягкой пшеницы, способные выколашиваться независимо от длины светового дня и содержащие комплекс генов для укороченного срока колошения.

Технический результат заключается в расширении функциональных возможностей известного способа.

Поставленная задача решается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Коммерческий раннеспелый сорт яровой мягкой пшеницы «Тулун 15», несущий аллель нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1a, а также аллели генов Vrn - Vrn-A1a, Vrn-B1c и Vrn-В3а, определяющие ранние сроки колошения, скрещивают с коммерческим сортом яровой мягкой пшеницы «Обская 2» и растения поколения F₁ самоопыляют до поколения F₂. Из поколения F₂ с помощью молекулярных ПЦР-маркеров 1а и 1б (Ppd1_F / Ppd1_R1 / Ppd1_R2) отбирают растения, содержащие аллель Ppd-D1a в гомозиготном состоянии. Отобранные с помощью ПЦР-маркеров 1а и 1б растения F₂ с аллелем Ppd-D1a проверяют аллель-специфичным маркером 2а (Vrn1AF/VRN1-INTIR) для выявления аллеля Vrn-A1a; маркерами 3а (Intr1/B/Fflntr1/B/R3) и 3б (Intr1/B/F/Intr1/B/R4) для выявления аллеля Vrn-B1c, маркерами 4а (FT-B-INS) и 4б (FT-B-NOINS) для выявления аллеля Vrn-В3а. Растения поколения F2, отобранные с помощью ПЦР-маркеров 1а, 1Б, 2а, 3а, 3б, 4а, 4б, самоопыляют до поколения F3 и в полевых условиях проводят оценку сроков колошения.

Основными определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

- в качестве исходного сорта для гибридизации используют коммерческий сорт яровой мягкой пшеницы «Тулун 15», содержащий аллель нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1a, а также аллели Vrn-A1a, Vrn-B1c и Vrn-В3а, определяющие ранние сроки колошения;

- из поколения F₂ с помощью молекулярных ПЦР-маркеров 1а и 1б отбирают растения, содержащие в гомозиготном состоянии аллель Ppd-D1a, определяющий нечувствительность к фотопериоду, что позволяет на ранних стадиях создания линий мягкой пшеницы быстро отбирать растения способные выколашиваться независимо от длины светового дня;

- растения F₂, отобранные с помощью молекулярных маркеров 1а и 1б, анализируют с помощью аллель-специфичных маркеров 2а, 3а, 3б, 4а, 4б, для отбора растений, содержащих в гомозиготном состоянии аллели Vrn-A1a, Vrn-B1c и Vrn-В3а, определяющие ранние сроки колошения, что позволяет получить растения с комплексом генов для укороченного срока колошения.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Коммерческий раннеспелый сорт яровой мягкой пшеницы «Тулун 15» был проанализирован с помощью молекулярных маркеров на аллельный состав генов Ppd и Vrn.

Сорт «Тулун 15» скрещивали со среднеспелым сортом яровой мягкой пшеницы «Обская 2». Полученные от скрещивания гибридные растения поколения F₁ самоопыляли до поколения F₂ и в поколении F₂ с помощью ПЦР-маркеров 1а и 1б отбирали растения, содержащие в гомозиготном состоянии аллель Ppd-D1a. Структура использованных праймеров представлена в таблице 1.

Результаты анализа для ПЦР-маркеров 1а и 1б с геномной ДНК родительских сортов «Тулун 15», «Обская 2» и растений поколения F₂, содержащих (сорт «Тулун 15» и растения 3, 5, 6, 8) и не содержащих (сорт «Обская» 2 и растения 1, 2, 4, 7) аллель Ppd-D1a, приведены на фиг. 1. Фрагмент ДНК длиной 288 п.н., свидетельствующий о наличии аллеля Ppd-D1a, указан стрелкой.

Отобранные с помощью ПЦР-маркеров 1а и 16 растения поколения F₂, содержащие аллель Ppd-D1a в гомозиготном состоянии, проверяли с помощью аллель-специфичных праймеров (таблица 1) к генам Vrn, определяющим сроки колошения. ПЦР-маркер 2а использовался для выявления растений, содержащих аллель Vrn-A1a. Результаты анализа ПЦР-маркером 2а представлены на фиг. 2, из которой видно, что сорта «Тулун 15», «Обская 2» и все растения F₂ амплифицируют фрагменты длиной 965 и 876 пар нуклеотидов, что соответствует аллелю Vrn-A1a.

Для отбора растений, несущих в гомозиготном состоянии аллель Vrn-B1c, использовали два ПЦР-маркера 3а и 3б. Результаты амплификации фрагментов ПЦР у сортов «Тулун 15», «Обская 2» и растений F₂ приведены на фиг. 3, из которой видно, что сорта Тулун 15, Обская 2 и все растения F₂амплифицируют фрагмент длиной 737 пар нуклеотидов, соответствующий аллелю Vrn-B1c.

Анализ сортов «Тулун 15», «Обская 2» и растений F₂ на наличие доминантного аллеля Vrn-В3а в гомозиготном состоянии, проводили с помощью двух ПЦР-маркеров 4а и 4б. На фиг. 4 представлены результаты анализа ПЦР-маркерами 4а и 4б сортов «Тулун 15», «Обская 2» и растений популяции F₂, содержащих (сорт «Тулун 15» и растения 3, 5, 6, 8) и не содержащих (сорт «Обская 2» и растения 1, 2, 4, 7) аллель Vrn-В3а. Фрагмент ДНК длиной 1200 п.н., свидетельствующий о наличии аллеля Vrn-В3а, указан стрелкой.

Растения поколения F₂, отобранные с помощью ПЦР-маркеров 1а, 1б, 2а, 3а, 3б, 4а, 4б самоопыляли до поколения F₃ и в полевых условиях проводили оценку сроков колошения. Результаты представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что у коммерческого сорта мягкой пшеницы «Тулун 15» период от всходов до колошения составил 38 дней. Коммерческий сорт «Обская 2» выколосился на 5 дней позже сорта Тулун 15, и, соответственно, продолжительность периода от всходов до колошения у него составила 43 дня. Растения популяции F₃, содержащие комплекс аллелей Ppd-D1a, Vrn-A1a, Vrn-B1c и Vrn-В3а (растения 3, 5, 6, 8), показали самые ранние сроки колошения - 35 дней.

Таким образом, показано, что сорт Тулун 15 несет доминантный аллель нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1a, а также аллели генов Vrn - Vrn-A1a, Vrn-B1c и Vrn-В3а, определяющие ранние сроки колошения (3).

Предлагаемый способ позволяет создавать линии яровой мягкой пшеницы с укороченным сроком колошения, которые могут быть использованы для расширения генетического разнообразия яровой пшеницы, а также в селекции на скороспелость. Использование молекулярных маркеров 1а, 1б, 2а, 3а, 3б, 4а, 4б позволит отбирать линии с ранним сроком колошения без проведения полевых испытаний и, соответственно, сократить срок создания новых форм мягкой пшеницы.

Источники информации

1. Worland A.J. The influence of flowering time genes on environmental adaptability in European wheats // Euphytica. 1996. V. 89. P. 49-57.

2. Yan L., Fu D., Li C. et al. The wheat and barley vernalization gene VRN3 is an orthologue of FT // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 19581-19586.

3. Лихенко И.Е., Стасюк А.И., Щербань А.Б., Зырянова А.Ф., Лихенко Н.И., Салина Е.А. Изучение аллельного состава генов Vrn-1 и Ppd-1 у раннеспелых и среднеранних сортов яровой мягкой пшеницы Сибири // Вавилов, журн. генет. и селекции. 2014. Т. 18. №4/1. С. 691-703.

4. Патент РФ №2065697 С1, опубл. 27.08.1996.

5. Патент РФ №2300193 С1, опубл. 10.06.2007.

6. Патент РФ №2535985 С1 С1, опубл. 20.12.2014.

7. Beales J., Turner A., Griffiths S., Snape J.W., Laurie D.A. A pseudo-response regulator is misexpressed in the photoperiod insensitive Ppd-Dla mutant of wheat (Triticum aestivum L.) // Theor. Appl. Genet. 2007. V. 115. N. 5. P. 721-733.

8. Yan L.D., Helguera M., Kato K., Fukuyama S., Sherman J., Dubcovsky J. Allelic variation at the VRN1 promoter region in poliploid weat // Theor. Appl. Genet. 2004. V. 109. P. 1677-1686.

9. Fu D., Szucs P., Yan L., Helguera M., Skinner S., Zitzewits J.V., Hayes P.M., Dubcovsky J. Large deletions within the first intron in VRN-1 are associated with spring growth habit in barley and wheat // Mol. Genet. Genomics. 2005. V. 273. P. 54-65.