Тест-система для визуального полуколичественного иммунохроматографического анализа

Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического определения белковых веществ с использованием в качестве маркера золотых наночастиц и может быть использовано в биотехнологии и медицинской диагностике для полуколичественного визуального определения белков с чувствительностью, достигаемой известными методами твердофазного иммуноферментного анализа.

В течение последнего десятилетия получили развитие так называемые «быстрые методы» проведения анализа различных соединений с визуальной регистрацией результатов, которые уже нашли широкое использование в медицинской диагностике, фармацевтической и пищевой промышленности, охране окружающей среды, ветеринарии и других областях. Методы основаны на использовании специальных носителей с заранее импрегнированными в них реакционными компонентами, позволяющими определять анализируемое соединение по окрашиванию линии в тестовой зоне устройства. Наиболее распространенным вариантом является иммунохроматографический метод, основанный на связывании определяемого антигена специфическими антителами в тестовой области аналитической мембраны с использованием в качестве визуальной метки образующегося иммунокомплекса наночастиц коллоидного золота, углеродных нанотрубок, квантовых точек, латексных частиц и др. (Nanoparticle-based lateral flow biosensors. Biosensors and Bioelectronics, 2015, vol. 73, pp. 47-63). Наиболее широкое использование в такого рода аналитических устройствах для проведения так называемого латерального проточного иммуноанализа или иммунохроматографического анализа получили метки на основе наночастиц золота, обладающие интенсивным окрашиванием [Geertruida A. Posthuma-Trumpie & Jakob Korf & Aart van Amerongen //Anal. Bioanal. Chem. 2009. V. 393. Р. 569-582].

Наиболее близким по технической сути является устройство (тест-система) для иммунохроматографического определения белковых антигенов по сэндвич-схеме иммуноанализа (патент США №5712172, МПК G01N /533, опубл. 27.12.1997 - прототип). Основой устройства является узкая тест-полоска, состоящая из нескольких ламинированных на пластиковой подложке примыкающих друг к другу мембран, по которым движется поток жидкости, содержащей анализируемый образец. На стекловолоконной мембране, примыкающей к мембране для нанесения образца содержится конъюгат наночастиц золота со специфическими первыми поли- или моноклональными антителами к определяемому антигену. На следующей, аналитической мембране в виде поперечной линии в тестовой зоне нанесены вторые специфические поли- или моноклональные антитела к определяемому антигену и в рядом расположенной контрольной линии - вторичные (антивидовые) антитела против специфических антител. При нанесении образца на мембрану для образца, расположенную у начала тест-полоски, начинается его движение по полоске под действием капиллярных сил. При наличии в образце определяемого антигена, по мере продвижения образца по порам мембраны происходит его взаимодействие с конъюгатом меченных золотом первых моноклональных антител и образование комплекса антигена с конъюгатом. В тестовой зоне окрашенный иммунокомплекс связывается с иммобилизованными в виде линии специфическими вторыми моноклональными антителами и наблюдается появление окрашенной линии, интенсивность окраски которой пропорциональна содержанию анализируемого вещества в образце. Избыток несвязавшихся меченых антител проходит далее к контрольной зоне, где образуется вторая окрашенная линия. При отсутствии в исследуемом образце определяемого антигена, меченные золотом антитела (конъюгат) задерживаются лишь вторичными антивидовыми антителами в области контрольной линии. Таким образом, наличие видимой окраски в контрольной зоне в обоих случаях свидетельствует о работоспособности теста. Расположение дополнительной впитывающей мембраны на конце тест-полоски позволяет осуществлять более равномерное и продолжительное движение образца вдоль полоски.

Появление окрашенной линии в тестовой зоне свидетельствует о превышении некоторого порогового уровня концентрации антигена в анализируемом растворе. Наилучшие достоверные результаты получают для тех антигенов, для которых наблюдается значительное превышение некоторой пороговой концентрации (например, в медицинской практике, при определении хорионического гонадотропина человека для ранней диагностики беременности). В этой связи рассмотренное устройство и метод визуального анализа является качественным, позволяющим на основании появления или отсутствия тестовой полосы по принципу «да-нет» говорить о наличии или отсутствии определяемого соединения в анализируемом растворе, что несмотря на простоту и малое время, является его существенным недостатком.

Интенсивность окраски тестовой линии пропорциональна концентрации определяемого в образце антигена, однако определение интенсивности окраски тестовой линии визуальным методом для получения полуколичественных результатов сопряжено с большими ошибками ввиду трудности визуальной сравнительной оценки интенсивности окраски линии со стандартными шаблонами. Количественная оценка может быть достигнута только с использованием специальных отражательных фотометров (например, патент РФ №22177556 МПК G01N 21/01, опубликовано 27.11.2003), что значительно усложняет и удорожает стоимость проводимого анализа.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание тест-системы (устройства) для экспресс-проведения полуколичественного визуального иммунохроматографического анализа и бесприборной полуколичественной оценки результатов анализа, позволяющей устанавливать содержание вещества в заранее заданном числе диапазонов (областей) концентраций измеряемого вещества в образце.

Технический результат достигается тем, что используют тест-систему для иммунохроматографического анализа, общая схема строения которой представлена на Фигуре 1.

Устройство включает в качестве основы единую плоскую пластиковую подложку с ламинированными на ее поверхности мембраной для нанесения образца 1 и соприкасающимися с ней по начальным концам несколькими рядом расположенными узкими индивидуальными тест-полосками 2, которые могут располагаться рядом параллельно в ряд (Фигура 1а), по кругу (Фигура 1б,в) и др. образом, необходимым условием расположения является плотный контакт мембранных компонентов каждой из полосок с общей мембраной для нанесения образца. Каждая узкая тест-полоска содержит представленные на Фигуре 2 компоненты мембран, ламинированные на общей пластиковой подложке 3: одну общую для всех полосок мембрану для нанесения образца 4, а также в каждой из тест-полосок свою индивидуальную мембрану 5 для конъюгата золотых наночастиц 6 с первыми специфическими антителами, свою аналитическую мембрану 7 с тестовой 8 и контрольной 9 зонами и отсасывающую мембрану 10, причем на каждой из аналитических мембран в поперечном направлении сформировано по одной тестовой линии путем предварительного нанесения на мембрану растворов вторых специфических антител 11 против определяемого соединения с последовательно уменьшающейся на каждой из рядом расположенных тест-полосок концентрацией антител, а также одна контрольная линия с иммобилизованными антивидовыми антителами 12. Отличительными особенностями является то, что мембрана для нанесения образца 4 является общей для различных тест-полосок, а количество специфических антител 11 в тестовой линии на аналитической области в каждой из рядом расположенных узких тест-полосок последовательно уменьшается от полоски к полоске. Результатом анализа определяемого вещества 13, наносимого на общую для всех полосок мембрану для образца является окрашивание тестовых линий 8 различного числа тест-полосок, что позволяет визуально оценивать содержание анализируемого вещества в различных диапазонах концентраций.

В качестве иллюстрации и более детального описания устройства приведем схему предлагаемого тест-устройства и принцип его работы для оценки концентраций "с" определяемого вещества в четырех областях концентраций определяемого антигена: с<Аг₁ Aг₁<c<Аг₂; Аг₂<с<Аг₃ и с>Аг₃. Схема такого устройства представлена на Фигуре 3.

Поставленная задача полуколичественного визуального определения в четырех диапазонах исследуемых концентраций решается тем, что используют тест-систему для иммунохроматографического анализа, включающую общую плоскую пластиковую подложку с ламинированными на ее поверхности соприкасающимися по одному из концов с мембраной для образца 14 тремя узкими тест-полосками 15, 16 и 17, каждая из которых по своему строению аналогична общему строению полоски на Фигуре 2. Каждая узкая тест-полоска содержит одну общую для полосок мембрану для нанесения образца, а также для каждой из тест-полосок свою индивидуальную мембрану для конъюгата золотых наночастиц с первыми специфическими моноклональными антителами, свою аналитическую мембрану с тестовой и контрольной зонами и отсасывающую мембрану), отличающуюся тем, что пластиковая подложка имеет центральную круговую или прямоугольную область с продолжением в виде нескольких (в данном случае трех) отдельных узких тест-полосок, на поверхности каждой тест-полоски по длине и внахлестку путем ламинирования расположены общая для центральной области и узких полосок пористая мембрана для нанесения исследуемого образца, а также далее на каждой из узких полосок своя мембрана для конъюгата наночастиц золота со специфическими первыми моноклональными антителами против определяемого соединения, свои аналитическая и отсасывающая мембраны, причем на каждой из аналитических мембран в поперечном направлении сформировано по одной тестовой линии путем предварительного нанесения на мембрану растворов вторых специфических моноклональных антител против определяемого соединения с последовательно уменьшающейся на каждой из аналитических мембран концентрацией антител, а также одна контрольная линия с иммобилизованными антивидовыми антителами, которые связывают избыток конъюгата золотых частиц в ходе проведения анализа с образованием окрашенной линии, (для унификации всегда будем считать, что концентрация антител уменьшается для рядом расположенных полосок слева - направо, начиная с крайней левой при их расположении в один ряд, а в случае расположения полосок по окружности, нумерация полосок будет производиться по часовой стрелке, начиная с крайней левой).

Принцип работы заявляемой тест-системы заключается в следующем. При нанесении образца, содержащего определяемый антиген, на общую для всех полосок мембрану для образца 14, раствор анализируемого соединения под действием капиллярных сил распространяется независимо и равномерно вдоль каждой из отдельных узких тест-полосок 15, 16 и 17, при этом на каждой из узких тест-полосок антиген взаимодействует с конъюгатом специфических антител с золотыми наночастицами, иммобилизованным в мембране для конъюгата, и образующийся иммунокомплекс далее распространяется вдоль аналитической мембраны, на которой иммобилизованы вторые специфические антитела в тестовой зоне в виде линий 18, 19 и 20 с уменьшающейся на каждой из рядом расположенных тест-полосок концентрацией специфических антител (концентрация антител на линии 19 меньше концентрации антител на линии 18, концентрация антител на линии 20 меньше концентрации антител на линии 19). При этом скорость образования тройного специфического комплекса "меченные золотом антитела" - "антиген" - "иммобилизованное антитело" в тестовой линии на мембране (а следовательно и проявление окраски в тестовой линии) будет прямо пропорционально зависеть от концентрации как антигена в растворе (Аг), так и иммобилизованных на мембране антител (Ат), поэтому всегда можно подобрать такую по величине концентрацию иммобилизованных антител в тестовой линии каждой из узких тест-полосок (Ат₁ Ат₂ и Ат₃), чтобы окраска в тестовой линии проявлялась при превышении определенной пороговой концентрации антигена в растворе (Аг₁ Аг₂ и Аг₃). Другими словами, предел обнаружения, определяемый как концентрация антигена при которой появляется окрашивание тестовой линии, зависит от величины концентрации иммобилизованных на мембране антител. Избыток конъюгата удерживается контрольными линиями 21 с антивидовыми антителами с появлением окрашивания. Таким образом результатом проведения анализа в различных четырех диапазонах исследуемых концентраций антигена будет всегда окрашивание контрольных линий 21 и окрашивание разного числа тестовых линий отдельных узких тест-полосок, зависящего от концентрации определяемого антигена. При малой концентрации вещества в растворе c<Aг₁ тестовая линия не проявляется ни в одной из узких тест-полосок, при повышении концентрации вещества в области Аг₁<с<Аг₂ окрашивается тестовая линия 18 с наибольшей концентрацией антител на первой полоске, при концентрации вещества в области Аг₂<с<Аг₃ окрашиваются тестовые линии 18 и 19 на первой и второй полоске с большим и средним содержанием антител, при наибольшей концентрации вещества с>Аг₃ тестовые линии 18, 19 и 20 проявляются на всех трех узких тест-полосках с большим, средним и малым содержанием антител.

Таким образом диапазон определяемых концентраций анализируемого вещества визуально оценивается по количеству узких тест-полосок, в которых проявляется тестовая линия. В зависимости от концентрации анализируемого антигена, образующийся иммунокомплекс будет по-разному проявляться различными тест-полосками: при относительно небольших концентрациях антигена, визуально проявляемое количество иммунокомплекса будет наблюдаться только на полосках с достаточно высокой концентрацией сорбированных антител, наоборот при больших концентрациях антигена количество тест-полосок с проявляемыми линиями будет увеличиваться и включать тест-полоски с относительно малым содержанием сорбированных на мембране антител. Ввиду того, что золотые наночастицы имеют ярко выраженную окраску, количество окрашенных тест-полосок будет пропорционально концентрации определяемого соединения в анализируемом растворе. При достижении на каждой из тест-полосок контрольных линий 21 избыток золотого конъюгата задерживается на них, проявляя окраску контрольной линии, свидетельствующую о работоспособности теста.

Количество узких тест-полосок с иммобилизованными антителами можно варьировать от 2 до 6, тем самым изменяя количество и диапазоны определяемых концентраций антигена. Количество узких тест-полосок с уменьшающейся от полоски к полоске концентрацией сорбированных в виде поперечной линии антител может зависеть от требуемого (заданного) числа диапазонов определения анализируемого соединения. При использовании двух тест-полосок устанавливается три области исследуемых концентраций (низкая, в случае отсутствия окрашивания на каждой из двух тест-полосок, средняя - при наличии окрашивания линии только на первой тест-полоске и высокая - в случае одновременного окрашивания линии на первой и второй тест-полосках). В общем случае при использовании n узких тест-полосок количество определяемых диапазонов концентраций составляет (n+1).

Таким образом, основным отличительными существенными признаками изобретения является одновременное использование в одном устройстве нескольких узких тест-полосок с общей зоной нанесения образца и тестовыми линиями с сорбированными антителами с градиентным уменьшением количества сорбированных антител на линиях разных тест-полосок. Градиентное распределение концентрации сорбированных моноклональных антител на поверхности мембраны или, другими словами, число тест-полосок с изменяющейся концентрацией антител на тестовых линиях можно устанавливать в зависимости от природы анализируемого объекта и необходимого диапазона измеряемых концентраций, а также нижней границы определяемого содержания вещества. В частности, если необходимо получить ответ по принципу «да-нет» с определенной отсекаемой границей концентраций можно в каждом конкретном случае задать такую величину изменения концентрации антител на носителе, согласно которой при окрашивании более определенного числа тест-полосок ответ является положительным.

Возможность варьирования концентрации сорбированных антител в тестовой линии, а также числа тест-полосок с градиентно уменьшаемой концентрацией наносимых в виде тестовых линий антител в тестовой зоне позволяет установить взаимозависимость между диапазонами определяемых концентраций и числом окрашенных линий в тестовой зоне.

Совокупность перечисленных отличительных признаков ранее для решения задачи визуального иммунохроматографического анализа не использовалась, и поэтому отвечает критерию существенные отличия.

Пример 1

Получение компонентов и иммунохроматографического композита

Получение наночастиц коллоидного золота.

В колбу с магнитной мешалкой добавляют 99 мл бидистиллированной воды и 1 мл 1%-ного раствора золотохлористоводородной кислоты. Раствор нагревают до кипения, после чего быстро при перемешивании добавляют 1,6 мл 1%-ного водного раствора цитрата натрия. Раствор кипятят еще 15 минут при перемешивании, затем охлаждают в темноте до комнатной температуры.

Получение конъюгата частиц золота с антителами

К 2 мл раствора коллоидного золота добавляют при перемешивании необходимое количество 0,1 М раствора Nа₂СО₃ до достижения значения рН=7,0-7,5 (около 20 мкл). Затем по каплям при перемешивании добавляют 200 мкл раствора антител с выбранной концентрацией, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 40 минут. Далее добавляют 20%-ный раствор БСА до конечной концентрации 0,2%, инкубируют 20 минут и добавляют сахарозу до конечной концентрации 10% и азида натрия до конечной концентрации 0,01%.

Для удаления несвязавшихся антител конъюгат центрифугируют 30 минут при 10000 об/мин и температуре +4°С. Супернатант удаляют, осадок перерастворяют в требуемом объеме ФБ, содержащего 0,1% БСА, 10% сахарозы. Полученный раствор конъюгата с оптической плотностью 2.0 опт.ед. наносят на полоску стекловолоконной мембраны для конъюгата и высушивают.

Получение иммунохроматографического композита

На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану наносят раствор специфических антител в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсера BioDot XYZ 3050 для формирования аналитической зоны. Данный тип диспенсера позволяет наносить образцы бесконтактным способом в отличие от «перьевых», контактных диспенсеров, что в свою очередь, обеспечивает высокую точность позиционирования и воспроизводимость (+/- 10 мкм по одному направлению, 1%), также позволяет варьировать объем наносимой капли (20 нл - 2 мкл) и скорость нанесения (0,5 - 30,0 мкл/сек). Для нанесения растворов специфических антител на каждую из мембран для дальнейшего формирования рядом расположенных тест-полосок наносят раствор специфических антител с концентрацией от 0,05 мг/мл до 1 мг/мл. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической зоны наносили раствор аффинно-очищенных антивидовых антител овцы против мыши с концентрацией 1 мг/мл. Использовали следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000 для нанесения образцов: размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Высушивание полосок проводили в течение 24 ч при +37°С.

Собирали устройство в виде расположенных рядом индивидуальных тест-полосок (75×4 мм) путем ламинирования на пластиковую подложку в соответствии с общей схемой на Фигуре 2.

Пример 2

Полуколичественное определение концентрации простат специфического антигена (ПСА) в трех диапазонах концентраций

На каждую из двух аналитических нитроцеллюлозных мембран размером 25×260 мм на расстоянии 10 мм от края и на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью автоматического устройства BioJet Quanti 3000 с использованием насоса наносят тестовую линию с концентрациями специфических антител в 0,01М фосфатно-солевом буферном растворе 0,5 мг/мл и 0,1 мг/мл, соответственно. Затем на расстоянии 5 мм от первой линии наносят контрольную линию с раствором антивидовых антител (1 мг/мл в ФСБР).

При нанесении линий используют следующие параметры насоса BioJet Quanti 3000: размер капли - 30 нл, шаг - 0,3 мм, скорость - 50 мм/сек. Количество иммобилизуемых антител 1 мкл раствора на 1 см линии.

Мембрану высушивают в течение 24 ч в суховоздушном термостате при температуре 37°С и относительной влажности 25-30%.

На полоску мембраны для конъюгата размером 5×260 мм с помощью автоматического устройства AirJet Quanti наносят раствор конъюгата коллоидного золота с антителами. При нанесении линий используют следующие параметры насоса AirJet Quanti: скорость - 50 мм/сек. Мембрану с нанесенным конъюгатом высушивают в течение 2 ч в суховоздушном термостате при температуре 50-60°С и относительной влажности 25-30%.

Аналитическую мембрану и мембрану для конъюгата разрезают на полоски шириной 4 мм полоски, которые затем компонуют на общей пластиковой подложке с клеящим слоем, совмещая с начальной мембраной для образца каждую из мембран для конъюгата, нитроцеллюлозную аналитическую мембрану и отсасывающую мембрану таким образом, чтобы край последующей мембраны перекрывался с краем предыдущей мембраны на 2 мм.

Собранные тест-устройства упаковывают по 10 штук в пакет из алюминиевой фольги или полиэтилена с застежкой типа "зип-лок", в пакет вкладывают мешочек с силикагелем, пакет запечатывают.

Проведение анализа ПСА в сыворотке крови

Вскрыть упаковку с тест-устройствами, извлечь необходимое для анализа количество тест-полосок из упаковки.

Аккуратно пипеткой нанести 100 мкл сыворотки крови на мембрану для образца тест-устройства. Через 15 мин визуально оценить результат (появление окрашенных в розовый цвет линий).

Интерпретация результатов анализа

Если в тестовой зоне обеих тест-полосок наблюдается ярко выраженное окрашивание только одной контрольной тест-полоски - концентрация ПСА составляет менее 3 нг/мл (Фигура 4а).

Если помимо окрашивания контрольной линии наблюдается заметное окрашивание тестовой линии только в первой тест-полоске - концентрация ПСА находится в диапазоне от 3 до 10 нг/мл (Фигура 4б).

Если помимо контрольной линии наблюдается окрашивание линии в тестовой зоне каждой из двух тест-полосок - концентрация ПСА равна или превышает 10 нг/мл (Фигура 4в).

Интенсивность окраски розовых линий в тестовой зоне может быть различной в зависимости от концентрации ПСА в образце, а также от внешних условий. Следовательно, любой оттенок розового цвета в тестовой области должен рассматриваться положительным результатом.

Пример 3

Полуколичественное определение концентрации прокальцитонина человека в четырех диапазонах концентраций

Собирают устройство для проведения полуколичественного анализа согласно Примеру 1 с использованием трех рядом расположенных по окружности отдельных узких полосок (Фигура 5). При нанесении тестовых линий в аналитической зоне каждой из узких тест-полосок используют концентрации антител против прокальцитонина 1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,1 мг/ мл, соответственно.

Проведение иммунохроматографического анализа прокальцитонина человека

Вскрыть упаковку с тест-устройствами, извлечь необходимое для анализа количество тест-полосок из упаковки. Аккуратно пипеткой нанести 150 мкл сыворотки крови на мембрану для образца тест-устройства. Через 15 мин визуально оценить результат (появление окрашенных в розовый цвет линий).

Интерпретация результатов анализа

Если в тестовой зоне всех трех тест-полосок наблюдается ярко выраженное окрашивание только одной контрольной тест-полоски - концентрация прокальцитонина составляет менее 0,5 нг/мл (Фигура 5а).

Если помимо окрашивания контрольной линии наблюдается заметное окрашивание тестовой линии только в первой тест-полоске - концентрация прокальцитонина находится в диапазоне от 0,5 до 2 нг/мл (Фигура 5б).

Если помимо окрашивания контрольной линии наблюдается заметное окрашивание тестовой линии только в первых двух тест-полосках, а на третьей тест полоске окрашивание тестовой линии отсутствует - концентрация прокальцитонина находится в диапазоне от 2 до 10 нг/мл (Фигура 5в).

Если помимо контрольной линии наблюдается окрашивание линии в тестовой зоне каждой из всех трех тест-полосок - концентрация прокальцитонина превышает 10 нг/мл (Фигура 5 г).