5,7-Ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитрохинолин-2-ил)-4-нитро-1,3-трополон, обладающий цитотоксической активностью

5,7-Ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитрохинолин-2-ил)-4-нитро-1,3-трополон, обладающий цитотоксической активностью.

Изобретение относится к новым соединениям в ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона, а именно, к неописанному ранее 5,7-ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитрохинолин-2-ил)-4-нитро-1,3-трополону формулы 1:

1

обладающему цитотоксической активностью (проявляющую торможение или угнетение процессов патологического клеточного деления и роста соединительных тканей) на клеточные линии рака яичника OVCAR8, OVCAR3, рака легкого H441, A549, рака толстой кишки HCT116, рака поджелудочной железы Panc1, и может быть использовано при производстве противоопухолевых лекарственных средств.

В ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона известен 2-(4h-1,3-бензоксазин-4-он-2-ил)-4,5,6-трихлор-1,3-трополон, обладающий антибактериальной активностью против госпитальных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий [1].

Известны также 2-гетарилзамещенные 1,3-трополона, обладающие антимикробным действием [2].

Наиболее близким по достигаемому результату является 2-[7-ацетил-9,11-ди(трет-бутил)-4-метил-5-хлорбензо[b][1,4]оксазепино[7,6,5-de]-хинолин-2-ил]-5,6,7-трихлор-1,3-трополон, ингибирующий рост раковых клеток молочной железы MCF-7 (Human breast carcinoma) в концентрации IC₅₀ 12.96 μг/мл, а также раковых эпителиальных клеток KB, раковых клеток легких Lu и раковых клеток печени Hep-G2 в концентрациях IC₅₀ > 128 μг/мл [3].

В ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона не известны соединения, ингибирующие рост раковых клеток яичника, толстой кишки, поджелудочной железы.

Техническим результатом является новые соединения в ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона, обладающих новой для данного ряда активностью ингибировать рост раковых клеток яичника, толстой кишки, поджелудочной железы, в концентрации IC₅₀ меньшей, чем используемые в данном ряду концентрации известных соединений, обладающих цитотоксической активностью.

Технический результат достигается соединением 1.

Синтез соединения 1 заключается в реакции расширения о-хинонового цикла, протекающей между 2,8-диметил-4,7-дихлор-5-нитрохинолином 2 и 4,6-ди(трет-бутил)-1,2-бензохиноном 3 в условиях уксуснокислого катализа:

Механизм образования трополоновой системы 1 включает стадию альдольной конденсации с образованием интермедиата А, циклизацию А в норкарадиеновое производное B и перегруппировку B в дигидротрополон С. Окисление C избытком исходного 1,2-бензохинона 3 ведет к соединению 1.

Строение соединения 1 установлено данными ЯМР ¹Н и ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии.

Ниже приведен пример синтеза 5,7-ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитрохинолин-2-ил)-4-нитро-1,3-трополона 1.

Пример. 5,7-Ди(трет-бутил)-2-(4,7-дихлор-8-метил-5-нитрохинолин-2-ил)-4-нитро-1,3-трополон (1). Раствор 3,71 г (14 ммоль) 3,5-ди(трет-бутил)-1,2-бензохинона (3), 1,90 г (7 ммоль) 2,8-диметил-4,7-дихлор-5-нитрохинолина (2) в 10 мл AcOH нагревали при 60-65°С 10 ч. Охлаждали и разбавляли водой. Водный раствор экстрагировали хлороформом. Хлороформенный раствор упаривали и пропускали через хроматографическую колонку с Al₂O₃ (элюент - петролеиный эфир-CHCl₃, 1:1). Собирали ярко-желтую фракцию с R_ƒ 0.4. Отгоняли растворитель и остаток перекристаллизовывали из 2-пропанола. Выход 2,90 г (78 %), желтые кристаллы, т.пл. 183-185°С.

Спектр ЯМР ¹Н, (600 МГц), δ, м.д. (CDCl₃): 1.27 c (18Н, 5,7-С(СН₃)₃); 2.77 с (3Н, 8-CH₃); 6.47 c (1Н, 6-Н); 7.67 c (1Н, H_аром.); 8.29 с (1Н, H_аром.); 18.35 уш. с. (1Н, 3-ОН). ИК-спектр,ν/см^-1: 1664, 1602, 1547, 1490, 1464, 1366, 1281, 1244, 1096, 1053, 1020, 944, 869, 813, 735, 695. HRMS (ESI): m/z [M - H] вычислено для С₂₅Н₂₄Cl₂N₃О₆: 532.1048; найдено: 532.1042.

Исследование фармакологической активности.

Материалы и методы.

Эксперименты проведены на устойчивых опухолевых клеточных линиях немелкоклеточного рака легкого (A549, H441), эпителиального рака яичников (OVCAR-3, OVCAR-8), колоректального рака (HCT-116), рака поджелудочной железы (Panc1).

На первом этапе проводился поиск концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀) в выбраных клеточных линиях. Субстанции, проявившие цитотоксические свойства при низких концентрациях отбираются для дальнейшего исследования механизма действия на (опухолевую) клетку.

Метод исследования жизнеспособности клеток при окрашивании Aламара синего (alamarBlue®Cell Viability Reagent, Invitrogen, Великобритания) основан на преобразовании нетоксичного водорастворимого резазурина во флуоресцентное вещество резоруфин. Нефлуоресцирующий резазурин имеет синюю окраску, проникает через клеточные мембраны, превращаясь под воздействием редуктаз в резоруфин, обладающий яркой флуоресценцией в красном спектре. Процесс преобразования резазурина в резоруфин в жизнеспособных клетках протекает непрерывно, не вызывает гибели клеток, в результате чего формируется сигнал, регистрацию которого можно проводить как количественно (колориметрическим и флуориметрическим методом), так и качественно по видимому изменению синей окраски на розовую.

Клетки рассаживают в 96-луночный планшет и культивируют в стандартных стерильных условиях: питательная среда RPMI-1640 (для OVCAR-3, OVCAR-8, Panc1, HCT-116, H441) или DMEM (для A549), 10 % ЭТС, 5 % CO2, температура плюс 37°C

Вещество добавляли в концентрации от 1 до 5 мкМ, далее инкубировали в тех же стандартных стерильных условиях в течение 72 ч. По истечении срока инкубации к клетками добавляется краситель Аламар синий (alamarBlue®Cell Viability Reagent, Invitrogen, Великобритания) и проводили измерение флуоресценции (длины волн: возбуждение/эмиссия 540нм/590нм).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием теста Вилкоксона, критерия Краскела-Уолиса с постобработкой тестом Данна, либо с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста Ньюмана-Кеулса, в случае нормального распределения данных. Обсчет реализован в программе GraphPad Prism 5.0.

Результаты исследований

Об уровне цитотоксической активности судили по изменению степени флуоресценции в лунках, обработанных веществом по сравнению с контрольными лунками.

В таблице 1 представлены концентрации IC₅₀ для соединения 1 и для широко используемого в терапии рака Циспластина [4] в отношении исследованных клеточных линий.

Таблица 1. Влияние вещества 1 на жизнеспособность клеток, M±m.

*Примечание: отличия статистически достоверны по отношению к группе контроля (р≤0,05, по критерию Краскела-Уолиса).

Как видно, соединение 1 проявляет высокую цитотоксическую активность в отношении клеточных линий рака яичника OVCAR8, OVCAR3, рака легкого H441, A549, рака толстой кишки HCT116, рака поджелудочной железы Panc1. При этом его активность выше, чем у широко используемого циспластина.

Таким образом, предлагаемое соединение проявляет цитотоксическую активность в отношении клеточных линий рака яичника OVCAR8, OVCAR3, рака толстой кишки HCT116, рака поджелудочной железы Panc1, не неизвестную в ряду 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона, а также рака легкого H441, A549, при этом концентрация IC₅₀ соединения ниже, чем концентрация соединений ряда 2-хинолин-2-ил-производных 1,3-трополона, проявляющих цитостатическую активность.

Литература

[1] Ю.А. Саяпин, Е.А. Гусаков, И.В. Дороган, И.О. Тупаева, М.Г. Теймуразов, Н.К. Фурсова, К.В. Овчинников, В.И. Минкин. Новый 2-(4h-1,3-бензоксазин-4-он-2-ил)-1,3-трополон: синтез, структура и антибактериальные свойства // Биоорганическая химия, 2016, том 42, № 2, с. 247-2522.

[2] Патент на изобретение РФ № 2314295, МПК C07D215/14, 2008г.

[3] Зыонг Нгиа Банг, Ю.А. Саяпин, Хоанг Лам, Нгуен Данг Дык, В.Н. Комиссаров. Синтез и цитотоксическая активность производных [бензо[b][1,4]оксазепино[7,6,5-de]хинолин-2-ил]-1,3-трополонов // Химия гетероциклических соединений 2015, 51(3), 291-294.

[4] Cheff D.M., Hall M.D. A drug of such damned nature.1 Challenges and opportunities in translational platinum drug research // J. Med. Chem. - 2017. - Vol. 60. - P. 4517-4532. doi: 10.1021/acs.jmedchem.6b01351.