×
03.10.2019
219.017.d18e

Способ количественного определения протеолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области биохимии. Способ определения протеолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле, включающий приготовление геля, инкубацию образцов в контакте с гелем, окрашивание геля кумасси и фотографирование геля, отличается тем, что поддерживающей средой является гель полиакриламида, содержащий 3,9% акриламида, 0,1% метиленбисакриламида, 1% желатина и 0,05М трис-буферный раствор в качестве растворителя, в котором отсутствуют лунки для нанесения образца, а образцы в объеме 200 мкл помещаются в лунки стандартного 96-луночного иммунологического планшета, планшет соединяется с гелем таким образом, чтобы обеспечить контакт образцов с гелем без смешивания образцов между собой, определение производится в течение 20 минут, при этом для количественного определения ферментативной активности используется определение среднего значения цвета в цветовой модели RGB участков изображения, соответствующих зонам контакта с гелем отдельных образцов, с последующим пересчетом полученных значений в единицы ферментативной активности с помощью предварительно полученной калибровочной формулы. 1 пр., 5 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и энзимологии и может быть использовано для количественного определения активности протеолитических ферментов различного биологического происхождения.

Исследование протеолитических ферментов и количественная оценка их активности представляет интерес, в частности, ввиду их важной роли во взаимодействии организмов-фитофагов и патогенов с сельскохозяйственными растениями как одного из ключевых факторов агрессивности патогенов и фитофагов. Раскрытие молекулярных механизмов взаимодействия растений с патогенами и фитофагами является необходимым условием создания экологически-безопасных методов защиты культурных растений.

В настоящее время в практике исследовательских лабораторий практически отсутствуют простые, быстрые и дешевые, но в то же время чувствительные методы количественного определения активности протеолитических ферментов. Поэтому разработка новых и модификация существующих методов определения активности протеаз остается актуальной задачей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности протеолитических ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в геле агарозы. При этом используется 1%-ный агарозный гель, содержащий 1% субстрата и 0,05М трис-буферный раствор, рН 8, в качестве растворителя, и плашка - крышка от стандартного 96-луночного иммунологического планшета. В плашку заливают 20 мл геля, после остывания и затвердевания в геле вырезают лунки диаметром 4 мм с помощью пробкового сверла. В лунки помещают исследуемые образцы ферментов объемом 20 мкл, гель накрывают крышкой и помещают в термостат на 10 часов. После инкубации и окрашивания бромфеноловым синим активность протеолитических ферментов оценивают количественно по площади зон гидролизованного субстрата вокруг лунок с раствором фермента (Shpirnaya, I.A., Umarov, I.A., Shevchenko, N.D., Ibragimov, R.I. Evaluation of the activity of hydrolases and their inhibitors using substrates immobilized on agarose gel. Applied Biochemistry and Microbiology. 2009. №45 (4), pp.449-453).

Однако данный способ длителен, так как необходима инкубация в течение 10 часов для диффузии фермента в гель, и трудоемок, т.к. предполагает работу по вырезанию лунок в геле. Кроме того, данный способ предполагает относительно высокий расход геля, содержащего дорогостоящий препарат - агарозу.

Цель изобретения - ускорение, облегчение с точки зрения трудоемкости, удешевление способа определения протеолитических ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что для иммобилизации субстрата используют полиакриламидный гель, содержащий 3,9% акриламида и 0,1% метиленбисакриламида, 1% желатина и 0,05М трис-буферный раствор, рН 8, в качестве растворителя. Образцы растворов, обладающих ферментативной активностью, помещают в лунки стандартного 96-луночного иммунологического планшета. За счет малой толщины геля время, необходимое для диффузии фермента в гель, не превышает 20 минут. Изображения гелей анализируют для определения среднего значения цвета участков изображения, соответствующих отдельным лункам.

Предлагаемый способ определения гидролитической активности осуществляется следующим образом.

Стандартный 96-луночный планшет для иммуноферментного анализа помещают в суховоздушный термостат. В термостате должна поддерживаться температура, при которой будет производиться определение активности исследуемого фермента.

Собирают стекла со спейсерами, обеспечивающими пространство между ними, аналогично тому, как это делается при заливке геля для вертикального электрофореза.

Готовят раствор 4%-ного полиакриламидного геля по следующей прописи: Н2О - 5 мл, буферный раствор (0,05М трис-буфер, рН 8) - 3 мл, 30%-ный ПААГ (29,2% акриламида, 0,8% метиленбисакриламида) - 2 мл, желатин - 100 мг, TEMED - 4 μl, 10%-ный ПСА - 40 μl.

Количество раствора должно быть достаточным для заливки в стекла имеющегося размера. При избытке или недостатке раствора количество компонентов следует пропорционально изменить.

Заливают гель в стекла аналогично тому, как это делается при заливке геля для вертикального электрофореза. Гель полимеризуется около 15 минут. На время полимеризации помещают стекла в суховоздушный термостат, поддерживающий температуру, при которой будет производиться определение активности исследуемого фермента.

Помещают исследуемые образцы в лунки стандартного 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа. Объем образца в каждой лунке должен составлять 200 мкл. Если образцы получаются путем смешивания различных жидкостей, перемешивают жидкость в лунках планшета с использованием вортекса.

После полимеризации геля разделяют стекла, чтобы гель остался на одном из стекол. Смывают с поверхности геля незаполимеризовавшийся акриламид дистиллированной водой, стряхивают остатки воды, просушивают поверхность геля фильтровальной бумагой. Помещают стекло с гелем на планшет таким образом, чтобы гель закрыл сверху лунки с образцами. Закрепляют стекло с гелем на планшете с помощью резинок. После закрепления гель должен герметично закупоривать лунки с образцами и быть неподвижным относительно планшета при его переворачивании.

Переворачивают получившуюся конструкцию, чтобы стекло оказалось внизу, а планшет - вверху. Покачивают конструкцию в руке подобно маятнику, чтобы жидкость в лунках стекла на гель. Движения должны быть очень плавными, исключающими смещение геля относительно планшета и просачивание образцов за пределы лунок. Помещают конструкцию в термостат на 20 минут. На рис. 1 представлено схематичное изображение конструкции для определения активности: 1 - иммунологический планшет, 2 - образец с ферментативной активностью в лунке планшета, 3 - полиакриламидный гель, 4 - стекло.

Для окрашивания геля используют раствор кумасси. Объем раствора подбирается для геля конкретного размера.

По истечении 20 минут переворачивают конструкцию стеклом вверх, стряхивают растворы образцов на дно лунок, снимают резинки, отделяют стекло с гелем от планшета и немедленно промывают поверхность геля водой. Снимают гель со стекла и максимально быстро и равномерно погружают в окрашивающий раствор. Время окрашивания подбирается для геля конкретного размера.

После окрашивания получают цифровое изображение геля с помощью бытового сканера или гель-документирующей системы. Определяют среднее значение цвета участков изображения, соответствующих отдельным лункам. При этом для количественного определения ферментативной активности используется определение среднего значения цвета в цветовой модели RGB участков изображения, соответствующих зонам контакта с гелем отдельных образцов, с последующим пересчетом полученных значений в единицы ферментативной активности с помощью предварительно полученной калибровочной формулы.

Сущность изобретения. Благодаря использованию более прочного полиакриламидного геля (вместо агарозного) данный способ позволяет сделать гель более тонким. Данное обстоятельство, а также тот факт, что диффузия молекул фермента в анализируемом участке геля происходит перпендикулярно плоскости геля (в отличие от наиболее близкого аналога, где фермент диффундирует параллельно плоскости геля), позволили сократить время инкубации геля с образцами до 20 минут (вместо 10 часов у наиболее близкого аналога). Кроме того, реактивы, необходимые для формирования полиакриламидного геля, являются значительно более дешевыми (по сравнению с агарозой, используемой в наиболее близком аналоге), что также является важным преимуществом предлагаемого способа.

Пример. Для изучения возможности количественного определения активности протеаз брали растворы с различным содержанием коммерческого препарата трипсина. Гели окрашивали кумасси, изображения гелей анализировали в компьютерной программе для определения яркости отдельных участков изображения.

Как видно, на гелях (рис. 2-5), окрашенных кумасси, выявляются участки с различной яркостью, зависящей от концентрации фермента, что допускает возможность количественного анализа. На рис. 2 представлен гель с различным количеством фермента после окрашивания кумасси.; а рис. 3 - результат анализа геля с различным количеством фермента после окрашивания кумасси. По горизонтальной оси - количество микролитров раствора фермента; по вертикальной оси - среднее значение цвета участка геля. В качестве величины погрешности показан доверительный интервал выборочного среднего; на рис. 4. - результат анализа геля с различным количеством раствора трипсина после окрашивания кумасси. По горизонтальной оси - количество микролитров раствора фермента; по вертикальной оси - среднее значение цвета участка геля. В качестве величины погрешности показан доверительный интервал выборочного среднего; на рис. 5. - результат анализа геля с различным количеством протеаз L. decemlineata после окрашивания кумасси. По горизонтальной оси - количество микролитров раствора фермента; по вертикальной оси - среднее значение цвета участка геля. В качестве величины погрешности показан доверительный интервал выборочного среднего.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что в качестве поддерживающей среды используется не агарозный, а значительно более дешевый полиакриламидный гель. Предлагаемый способ не требует формирования лунок в геле, что значительно снижает трудоемкость процесса.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найден способ определения протеолитической активности, который предполагал бы использование полиакриламидного геля для иммобилизации субстрата. Предлагаемый способ предполагает использование минимальных количеств реактивов, не требует оснащения специальной аппаратурой и дорогостоящими реактивами, осуществляется в течение короткого промежутка времени. Таким образом, способ экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения.

Данный способ может быть использован в клинических и научно-исследовательских лабораториях для определения протеолитической активности в водных растворах.

Таким образом, предлагаемый способ определения гидролитической активности соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Способ определения протеолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле, включающий приготовление геля, инкубацию образцов в контакте с гелем, окрашивание геля кумасси и фотографирование геля, отличающийся тем, что поддерживающей средой является гель полиакриламида, содержащий 3,9% акриламида, 0,1% метиленбисакриламида, 1% желатина и 0,05М трис-буферный раствор в качестве растворителя, в котором отсутствуют лунки для нанесения образца, а образцы в объеме 200 мкл помещаются в лунки стандартного 96-луночного иммунологического планшета, планшет соединяется с гелем таким образом, чтобы обеспечить контакт образцов с гелем без смешивания образцов между собой, определение производится в течение 20 минут, при этом для количественного определения ферментативной активности используется определение среднего значения цвета в цветовой модели RGB участков изображения, соответствующих зонам контакта с гелем отдельных образцов, с последующим пересчетом полученных значений в единицы ферментативной активности с помощью предварительно полученной калибровочной формулы.
Способ количественного определения протеолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 48 items.
13.02.2018
№218.016.22a7

Способ разработки горизонтальных и пологих рудных тел средней мощности

Изобретение относится к горнодобывающей промышленности Способ разработки горизонтальных и пологих рудных тел средней мощности подэтажным обрушением включает проведение выработок: доставочного орта, буродоставочных штреков, разделяющих рудное тело на панели, погрузочных заездов, разделяющих...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642193
Дата охранного документа: 24.01.2018
13.02.2018
№218.016.2584

Способ получения энантиоселективного сорбента

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способу создания энантиоселективных сорбентов. Cпособ заключатся в модифицировании графитированной термической сажи Carboblack С или инертного носителя Inerton NAW супрамолекулярной структурой циануровой кислоты. Модифицирование...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002642796
Дата охранного документа: 26.01.2018
10.05.2018
№218.016.3bf7

Способ получения нефтяного высокотемпературного связующего пека

Изобретение относится к области нефтепереработки, в частности к способу получения нефтяных высокотемпературных связующих пеков, и может быть использовано в нефтехимической и нефтеперерабатывающей промышленности. Способ включает термополиконденсацию очищенной от низкокипящих компонентов тяжелой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002647735
Дата охранного документа: 19.03.2018
10.05.2018
№218.016.3f5b

Способ очистки возвратного растворителя

Изобретение относится к производству синтетических каучуков, получаемых растворной полимеризацией, в частности к регенерации возвратного растворителя со стадии выделения каучуков. Способ включает ректификацию возвратного растворителя на колонне, охлаждение паров в дефлегматоре, сбор дистиллята...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002648754
Дата охранного документа: 28.03.2018
10.05.2018
№218.016.4e1e

Способ исследования низкопроницаемых коллекторов с минимальными потерями в добыче

Изобретение относится к области нефтедобывающей промышленности и может быть использовано для определения фильтрационно-емкостных свойств низкопроницаемых пластов. Техническим результатом изобретения является повышение эффективности методов исследования скважин, а также снижение потерь добычи...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002652396
Дата охранного документа: 26.04.2018
25.06.2018
№218.016.6596

Устройство для измерения электрофизических параметров нефти и ее компонентов

Использование: для измерения частотных зависимостей полной электропроводности, ее активной и реактивной составляющих для нефти и ее компонентов. Сущность изобретения заключается в том, что устройство для измерения электрофизических параметров нефти и ее компонентов содержит сенсор,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002658539
Дата охранного документа: 21.06.2018
25.06.2018
№218.016.6739

Способ повышения эффективности селективного гидрирования

Изобретение относится к технологии промышленного проведения реакции каталитического гидрирования жидкофазных непредельных углеводородов и может быть использовано в нефтеперерабатывающей, нефтехимической и химической отраслях промышленности. Способ формирования комплекта газораспределительных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002658417
Дата охранного документа: 21.06.2018
01.07.2018
№218.016.69a6

Способ получения нефтяного высокотемпературного связующего пека

Изобретение относится к области нефтепереработки, в частности к способу получения нефтяных высокотемпературных связующих пеков, и может быть использовано в нефтехимической и нефтеперерабатывающей промышленности. Способ включает термополиконденсацию очищенной от низкокипящих компонентов тяжелой...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002659262
Дата охранного документа: 29.06.2018
14.07.2018
№218.016.7130

Биоразлагаемый полимерный композиционный материал на основе смеси полиэтилена низкого давления и вторичного полипропилена

Изобретение относится к области создания биоразлагаемых полимерных композиционных материалов, используемых при разделении и очистке газовых и паровых смесей различной природы, для очистки поверхности воды от нефти и нефтепродуктов, для очистки сточных вод от белковых токсикантов, а также для...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002661230
Дата охранного документа: 13.07.2018
09.08.2018
№218.016.784c

Способ очистки возвратного растворителя

Изобретение относится к производству синтетических каучуков, получаемых растворной полимеризацией, в частности к регенерации возвратного растворителя со стадии выделения каучуков. Способ очистки возвратного растворителя со стадии выделения каучуков включает ректификацию возвратного...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002663295
Дата охранного документа: 03.08.2018
Showing 1-2 of 2 items.
20.10.2014
№216.012.ffbb

Способ получения белково-липидного концентрата из растительного маслосодержащего сырья

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно растениеводству и агробиотехнологии. Белково-липидный концентрат может быть использован в качестве стимулятора роста и защиты сельскохозяйственных культур. Способ получения белково-липидного концентрата из измельченных семян льна включает их...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002531323
Дата охранного документа: 20.10.2014
08.12.2019
№219.017.eb6a

Способ количественного определения амилолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле

Изобретение относится к биохимии и энзимологии, и может быть использовано для подготовки образцов для определения амилолитической активности ферментов по гидролизу субстрата, иммобилизованного в полиакриламидном геле. Для этого осуществляют приготовление геля. При этом гель содержит 3,9%...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002708087
Дата охранного документа: 04.12.2019
+ добавить свой РИД