Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, касается способа определения количественного содержания аскорбиновой кислоты (АК) в лекарственных средствах (ЛС).

Для количественного определения АК известны методы окислительно-восстановительной титриметрии: индофенольный (титрант 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия), йодометрия (титрант йод), йод-хлорметрия (титрант йодмонохлорид), цериметрия (титрант церия (IV) сульфат). Методы основаны на экстрагировании АК из объекта анализа 2% раствором хлористоводородной кислоты, окислении АК титрантом до образования дегидроАК с установлением точки эквивалентности чаще индикаторным или инструментальным способом (Государственная фармакопея (ГФ) СССР, 1989, 11 изд, вып. 2, Общие методы анализа, М.: Медицина, 400 с.; ГОСТ 24556-89: Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С; ГОСТ 30627.2-98: Продукты молочные для детского питания. Методы измерений массовой доли витамина С). Методики предусматривают прямое или обратное титрование.

Ограничениями методов являются:

- нестабильность растворов титрантов (всех перечисленных, кроме церия (IV) сульфата) к действию света, воздуха, повышенной температуры, способствующая даже при создании специальных условий непродолжительным срокам хранения растворов (5-10 суток) и вызывающая необходимость установки титра перед каждым применением растворов;

- мешающее влияние сопутствующих восстановителей (ионов железа (II), йодид ионов, натрия гидросульфита, оксида серы (IV)), способных взаимодействовать с окислителями (титрантами) и приводить к завышенным результатам количественного определения АК;

- способность йода, используемого в качестве титранта, к окислению более сильными окислителями;

- высокая чувствительность титрантов (йодхлорида, церия (IV) сульфата) к изменению рН;

- невозможность титрования йодом при повышенной температуре вследствие его летучести;

- достаточно высокая относительная погрешность определений: ±5,5-15% при доверительной вероятности 95%.

Известен способ количественного определения АК в субстанции (порошке), ЛС (таблетках, драже, растворах), растительных ЛС (плодах) методом йодатометрии, основанным на окислении АК калия йодатом в кислой среде в присутствии калия йодида с образованием дегидроАК (уравнение 1):

Избыточная капля калия йодата окисляет в кислой среде йодид ионы до свободного йода (уравнение 2), образующего с крахмалом продукт синего цвета, по возникновению которого устанавливают точку эквивалентности:

Данный метод количественного определения АК рекомендован Государственными фармакопеями (ГФ) различных изданий для количественного анализа АК в ЛС. Методика определения АК в субстанции (ГФ СССР, 1968, 10 изд., М.: Медицина, 1079 с.) заключается в том, что точную навеску субстанции массой около 0,5 г растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки. К 10 мл приготовленного раствора добавляют 1 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты, 0,5 мл 1% раствора калия йодида, 2 мл 0,5% свежеприготовленного раствора крахмала и титруют 0,0167 моль/л раствором калия йодата до появления стойкого слабо синего окрашивания. Титр раствора калия йодата по АК составляет 8,824 мг/мл. Нормируемое содержание АК в субстанции - не менее 99,0%. Для определения АК в других ЛС (таблетках, драже, растворах и др.) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, Общая фармакопейная статья (ОФС) ОФС.1.2.3.0017.15: Методы количественного определения витаминов) используется та же методика, но с предварительной стадией изолирования АК: точную навеску порошка 10 растертых таблеток (драже) или исходного раствора, эквивалентную 0,1 г АК, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10 мл воды и 10 мл 2% раствора хлористоводородной кислоты, объем раствора доводят водой до метки, фильтруют. Далее 10 мл фильтрата анализируют по выше описанной методике с применением раствора калия йодата меньшей концентрации (0,00167 моль/л). Титр раствора калия йодата по АК составляет 0,8824 мг/мл. Данный метод определения количественного содержания АК наиболее близок к заявляемому способу и выбран за прототип.

Недостатками указанного способа являются (Пономарев В.Д. Аналитическая химия, 1982, ч. 2: Количественный анализ, М.: ВШ, 288 с.; Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика), 2005, кн. 2: Количественный анализ, М.: ВШ, 559 с.; ГОСТ 24556-89; ГОСТ 30627.2-98):

- неспецифичность титранта: калия йодат вступает в побочные взаимодействия с другими восстановителями (витаминами А, В₁, В₂, глюкозой, ионами и др.), являющимися сопутствующими компонентами или примесями к ЛС, ведущими к завышенным результатам количественного определения АК;

- зависимость реакции с калия йодатом от рН среды и ионной силы раствора;

- неустойчивость калия йодата в растворе к действию внешних факторов, вызывающая необходимость установки титра перед каждым применением растворов;

- визуальная фиксация точки эквивалентности, обусловливающая высокую относительную погрешность определения;

- при стоянии раствора крахмала происходит гидролиз полиса-харидных цепей и его окраска с йодом из синей превращается в красную, поэтому раствор индикатора должен быть всегда свежеприготовленным, что увеличивает продолжительность подготовки реактивов, а, значит, и анализа;

- резкое снижение чувствительности реакции с крахмалом при повышенной температуре;

- невозможность определения АК в мутных и окрашенных растворах;

- низкая точность определения: относительная погрешность составляет ±10-11,5%.

Цель изобретения - обеспечение специфичности, линейности, расширенного диапазона аналитической области, правильности, прецизионности, высокой точности методики количественного определения АК в ЛС методом окислительно-восстановительной титриметрии путем использования в качестве титранта окисленной формы ферроина (ОФФ) и потенциометрического способа фиксации точки эквивалентности.

Поставленная цель достигается тем, что для количественного определения АК сначала готовят раствор титранта ОФФ с примерной концентрацией 0,02 моль/л путем растворения точных навесок реагентов: 14,0820 г фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г железа (III) аммония сульфата додекагидрата в 100 мл воды очищенной и 25 мл 10% раствора серной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л с последующим доведением объема раствора водой очищенной до метки. Затем устанавливают титр раствора ОФФ путем добавления к 25,00 мл приготовленного раствора 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1% раствора крахмала и потенциометрического титрования смеси через 10 мин 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата на приборе «рН-340» при использовании платинового (индикаторный) и хлоридсеребряного (электрод сравнения) электродов с фиксацией значений электродвижущей силы электрохимической ячейки (Е^o, мВ) в зависимости от объема титранта (V_T, мл). В графической системе «Е^o, мВ - V_T, мл» строят кривые потенциометрического титрования, по которым определяют скачок титрования, V_T в точке эквивалентности (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1 ОФС.1.2.1.0004.15: Ионометрия). Для количественного определения АК в субстанции точную навеску массой около 0,1 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки, отбирают аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл. Для количественного определения АК в твердых ЛС (таблетках, драже), растворах, растительных ЛС точную навеску порошка растертых ЛС массой около 0,5 г или раствора объемом 0,50 мл вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой до метки, отбирают аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл. Далее аликвотную часть раствора помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из бюретки или микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ на приборе «рН-340», как указано выше.

Содержание АК (С, %) вычисляют по уравнению (3) (Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2):

где а - навеска для анализа, г;

V_Т - объем титранта в точке эквивалентности, мл;

К - поправочный коэффициент к заданной концентрации титранта;

Т_В/А - титр раствора титранта по определяемому веществу, мг/мл;

Р - общая масса (объем) анализируемого ЛС, г(мл);

V₁ - объем исходного раствора, мл;

V₂ - объем аликвотной части раствора, мл.

Величину Т_В/А определяют по уравнению (4) (Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2):

где С_В - концентрация раствора титранта, моль/л;

М_А - относительная молекулярная масса определяемого вещества;

k_А k_В - стехиометрические коэффициенты уравнения реакции перед определяемым веществом и титрантом соответственно.

В аналитической практике в качестве индикатора широко применяется ферроин - координационное соединение катиона железа (II) с 1,10-фенантролином (орто-фенантролином) (Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия, 1989, 448 с.; Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2) (уравнение 5):

Данное координационное соединение участвует в окислительно-восстановительных реакциях (ОВР), причем окисленная форма ферроина (ОФФ) более устойчива (lgβ=6,50), чем восстановленная форма (ВФФ) (lgβ=5,86) (Лурье Ю.Ю., 1989) (уравнение 6):

Интервал (потенциал) перехода окраски ферроина значителен: E°=+1,06 В; резкий переход цвета наблюдается при E°=+1,14 В. Кроме того, в ОВР ферроин практически не зависит от рН и ионной силы раствора (Лурье Ю.Ю., 1989). Перечисленные свойства побудили к предположению о возможности использования ОФФ в качестве титранта в окислительно-восстановительной титриметрии для количественного определения АК.

Предполагая, что в ОВР реагент ОФФ играет роль окислителя, а АК - роль восстановителя, уравнение реакции принимает вид в ионно-молекулярной форме (Лурье Ю.Ю., 1989; Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: в 2 ч., Пятигорск: ПГФА, 2003, 720 с.) (уравнение 7):

Любые реакции, включая ОВР, самопроизвольно протекают при постоянной температуре до момента установления в системе устойчивого химического равновесия, характеризуемого константой равновесия (Кр) при температуре 20°С для ОВР (Пономарев В.Д., 1982, ч. 2) (уравнение 8):

где n - сбалансированное число электронов, участвующих в реакции,

Е^o - стандартная электродвижущая сила (ЭДС) (стандартный потенциал) реакции.

С учетом Е^o потенциальных редокс-пар: окислителя [Fe(C₁₂H₈N₂)₃]³⁺/[Fe(C₁₂H₈N₂)₃]²⁺=+1,06В, восстановителя С₆Н₆О₆/С₆Н₈О₆=-0,326В (Лурье Ю.Ю., 1989), соответственно стандартной ЭДС реакции (1,06-(-0,326)=1,386В) и n=2, получаем: lgK=2⋅1,386/0,059=46,98, откуда Кр=9,6⋅10⁴⁶. Вычисленная величина Кр свидетельствует о возможности (Кр>1) и достаточной полноте протекания реакции (9,6⋅10⁴⁶>>10⁸) между ОФФ и АК при стандартных условиях. Данное заключение основано на известной закономерности практического протекания реакции до конца при условии величины степени превращения исходных веществ в продукты реакции не менее 99,99%, что соответствует константе равновесия Кр≥10⁸ (Пономарев В.Д., 1982, ч. 2; Харитонов Ю.Я., 2005, кн. 2). Таким образом, реакция между ОФФ и АК при стандартных условиях не только возможна, но и характеризуется очень высокой практической полнотой. Ранее ОФФ в качестве окислителя для количественного определения АК не использовался.

Теоретическое обоснование требует практических доказательств, поэтому сначала необходимо было получить ОФФ. В соответствии с уравнением реакции взаимодействия 1,10-фенантролина и иона железа (III) в ионно-молекулярной форме (Лурье Ю.Ю., 1989) (уравнение 9):

или в полной молекулярной форме (уравнение 10):

молярное соотношение 1,10-фенантролина и иона железа (III) в реакции образования ОФФ составляет 3:1. В результате эмпирического опыта определения АК, содержащегося в объектах анализа в малых количествах, чаще всего используемая концентрация растворов титрантов составляет 0,02 моль/л (ГФ СССР, 1968, 10 изд.; ГФ РФ, 2015, 13 изд., ОФС.1.2.3.0017.15; ГОСТ 24556-89; ГОСТ 30627.2-98).

Раствор титранта ОФФ с концентрацией 0,02 моль/л (титр раствора ОФФ 11,9294 мг/мл) готовят с учетом молярного соотношения реагентов: 1,10-фенантролина и иона железа (III) 3:1 (уравнения 9, 10) и их молярных масс (234,7 г/моль фенантролина гидрохлорида моногидрата, 56 г/моль иона железа (III), 482,2 г/моль железа (III) аммония сульфата додекагидрата (Лурье Ю.Ю., 1989)). Для этого точные навески реагентов: 14,0820 г (0,06 моль) фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г (0,02 моль) железа (III) аммония сульфата додекагидрата (1,12 г иона железа (III)) вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют 100 мл воды очищенной, 25 мл 10% раствора серной кислоты, доводят объем раствора водой очищенной до метки.

Установку титра раствора ОФФ проводят по методике установки титра 0,1 моль/л раствора железа (III) аммония сульфата (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.3.0001.15: Реактивы. Индикаторы): к 25,0 мл приготовленного раствора ОФФ прибавляют 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1% раствора крахмала и через 10 мин титруют потенциометрически на приборе «рН-340», как описано выше, 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата. Реакции протекают согласно уравнениям (11, 12):

Титр раствора ОФФ оценивают по величине К, которую определяют по уравнению (13) (ГФ СССР, 1987, 11 изд., вып. 1, 336 с.):

где К₁, V₁ - соответственно поправочный коэффициент и объем раствора ОФФ (мл), взятого для установки титра,

К₂, V₂ - соответственно поправочный коэффициент и объем (мл) титранта, израсходованного на титрование.

Важнейшей характеристикой любой методики анализа является ее специфичность - способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов (Валидация аналитических методик (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). Для оценки специфичности методики количественного определения АК с помощью ОФФ были приготовлены 3 модельные смеси (порошки), одна из которых (№1) аналогична составу драже «Ревит» (Машковский М.Д. Лекарственные средства, 2012, 16 изд. М.: Новая волна, 1216 с.) (табл. 1). Каждую смесь анализировали по выше описанной методике, но с большей концентрацией исходного раствора: навеску смеси массой около 0,5 г (точная навеска) растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки; далее отбирали 10 мл и титровали, как указано выше. Результаты титрования модельных смесей №1, №2, №3 с помощью 0,02 моль/л раствора ОФФ с К=1,00 приведены в табл. 2, из которых можно отметить, что величина Е^o модельной смеси №3 осталась без изменений, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия титранта ОФФ с сопутствующими компонентами. Кривые потенциометрического титрования модельных смесей №1 и №2 с помощью 0,02 моль/л раствора ОФФ в системе «Е^o, мВ - V_T, мл» аналогичны по характеру и практически совпадают друг с другом (рис. 1). При анализе потенциометрической кривой титрования модельной смеси №1 выделяется: резко выраженный скачок титрования, при котором Е^o составляет от (-150) до +750 мВ (ширина скачка 900 мВ); Е^o в точке эквивалентности составляет +307 мВ, ему соответствует V_T 3,84 мл. Практически такие же результаты получены при титровании модельной смеси №2: резко выраженный скачок титрования, при котором Е^o составляет: от (-148) до +749 мВ (ширина скачка 897 мВ); Е^o в точке эквивалентности составляет +306 мВ, ему соответствует V_T 3,83 мл. Учитывая, что взаимодействие ОФФ с АК происходит в молярном соотношении 2:1 (уравнение 7), рассчитанный по уравнению (4) титр раствора ОФФ по АК составляет: 0,02⋅176,13⋅1/2=1,761 мг/мл, т.е. 1 мл 0,02 М раствора ОФФ соответствует 1,761 мг АК. По уравнению (3) содержание АК:

- в модельной смеси №1 составляет:

- в модельной смеси №2 составляет:

Одинаковые результаты содержания АК в модельных смесях №1 и №2, а также стабильность потенциала для модельной смеси №3 свидетельствуют об отсутствии влияния сопутствующих компонентов на результаты количественного определения АК. Полученные данные доказывают специфичность методики количественного определения АК с помощью ОФФ.

Для сравнения с прототипом те же три модельные смеси титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата (способ-прототип) с потенциометрической фиксацией точки эквивалентности, как в случае заявляемого способа. Титр раствора калия йодата по АК составляет 0,8824 мг/мл. Результаты определения приведены в табл. 3. Из приведенных данных следует, что, несмотря на более широкий скачок титрования в способе-прототипе, чем в заявляемом способе, величины Е^o и V_Т в точке эквивалентности варьируют в зависимости от состава модельной смеси. Различные объемы титранта, израсходованного на титрование смесей №1 и №2, а также вклад сопутствующих компонентов (смесь №3) во взаимодействие с титрантом свидетельствуют об отсутствии специфичности методики количественного определения АК по способу прототипу. По-видимому, это связано с большей величиной Е^o калия йодата (+1,19 В) в сравнении с ОФФ (+1,06 В).

Рассчитанное по уравнению (3) содержание АК составило:

- в модельной смеси №1

- в модельной смеси №2

- в модельной смеси №3

Таким образом, методика количественного определения АК по заявляемому способу характеризуется специфичностью (относительная погрешность определения составила (0,3397-0,3500)⋅100/0,3500=2,9%), в отличие от способа прототипа (неспецифична, относительная погрешность определения (0,3901-0,3500)⋅100/0,3500=11,5%).

Важной характеристикой методики количественного определения является линейность - наличие линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества в анализируемой пробе (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). Для оценки линейности методики количественного определения АК 0,02 моль/л раствором ОФФ использована выше приведенная модельная смесь №1, из которой готовили исходный раствор путем растворения навески массой около 0,5 г (точная навеска) в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл и доведения объема раствора водой до метки. Из исходного раствора отбирали 6 аликвотных частей, которые титровали в выше описанных условиях 0,02 моль/л раствором ОФФ. Данные для расчета содержания АК: Р=5,0000 г, a=0,5002 г, V₁=50 мл, T=1,761 мг/мл, К=1,00. Результаты определения С_АК во взятых пробах приведены в табл. 4.

Для оценки линейности методики количественного определения АК заявляемым способом построен график в системе «V_T, мл - С_АК, г» (рис. 2), из которого видно, что между V_T и С_АК в модельной смеси №1 наблюдается линейная зависимость.

С целью определения линейной зависимости: расчета уравнения градуировочного графика и вычисления коэффициента корреляции С_АК обозначена через «х», V_T в точке эквивалентности через «у» (табл. 5). Коэффициенты уравнения линейной зависимости («а» и «b»), а также коэффициент корреляции («r») вычисляют по известным уравнениям (уравнения 14, 15, 16) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик):

Подставляя значения в приведенные уравнения, получаем коэффициенты для заявляемого способа:

Таким образом, зависимость между объемом титранта (ОФФ) и концентрацией АК в присутствии вспомогательных веществ описывается уравнением линейной регрессии: у=25,674х-4,186. Линейная зависимость отвечает условию количественного определения r≥0,99 (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), что позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости объема титранта ОФФ от концентрации АК.

Кроме того, наблюдаемая линейная зависимость во всем изученном диапазоне содержания АК (0,1761 г - 0,5952 г) составляет по отношению к номинальному значению содержания АК (0,3500 г) соответственно 50% и 170%. Таким образом, аналитическая область методики (интервал между верхним и нижним значением аналитических характеристик определяемого компонента в объекте анализа) составляет 50-170%) от номинального значения содержания АК, что вполне удовлетворяет фармакопейным требованиям к методикам количественного определения: «методики должны быть применимы в интервале 80-120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики» (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик).

Для сравнения со способом-прототипом модельную смесь №1 титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата: из смеси №1 готовили раствор путем растворения навески массой около 0,5 г (точная навеска) в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл и доведения объема раствора водой до метки. Анализу подвергали 6 аликвотных частей. Данные для расчета содержания АК: Р=5,0000 г, a=0,4988 г, V₁=50 мл, T=0,8824 мг/мл, К=1,00. Результаты определения С_АК во взятых пробах калия йодатом приведены в табл. 6. По графику «V_T, мл - С_АК, г», построенному аналогично рис. 2, установлена линейная зависимость между V_KIO3 и С_АК в модельной смеси №1. Данные для расчета уравнения градуировочного графика и вычисления коэффициента корреляции приведены в табл. 7. По приведенным уравнениям 14, 15, 16 вычислены коэффициенты «а», «b», «r» для способа-прототипа:

Таким образом, зависимость между объемом титранта (калия йодата) и концентрацией АК в присутствии вспомогательных веществ описывается уравнением линейной регрессии: у=51,203х-10,409. Полученная линейная зависимость не отвечает условию количественного определения r≥0,99 (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), при котором должна быть жесткая зависимость объема титранта от концентрации АК.

Следующей важной характеристикой методики количественного определения является правильность, характеризуемая отклонением среднего результата определений от значения, принимаемого за истинное значение. С целью оценки правильности методики количественного определения проводили 9 определений: три определения для каждой из трех аликвотных частей или концентраций, отличающихся на 20% (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). В работе использовали модельную смесь №1. Для этого навеску смеси массой около 0,5 г (точная навеска) растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки, отбирали 5,00, 10,00, 15,00 мл аликвотной части раствора. Каждую аликвотную часть трижды потенциометрически титровали 0,02 моль/л раствором ОФФ (Р=5,0000 г; a=0,5010 г; К=1,00; T=1,761 мг/мл). Открываемость (R, %) как характеристику критерия «правильность» определяли по уравнению (17) (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик):

Результаты определения правильности заявляемой методики приведены в табл. 8. Для анализа лекарственных средств с содержанием действующего вещества более 1% и менее 10% (С_АК в модельной смеси №1: 0,3500⋅100/5,0000=7%), согласно (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик), значение правильности должно быть в пределах 97-103%). Полученный средний результат по критерию «правильность» для заявляемой методики вполне удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Аналогичным образом оценивали способ-прототип по критерию «правильность», используя те же объемы аликвотных частей раствора. Каждую аликвотную часть трижды потенциометрически титровали 0,00167 моль/л раствором калия йодата (Р=5,0000 г; a=0,4995 г; К=1,00; T=0,8824 мг/мл). Результаты определения правильности методики-прототипа приведены в табл. 9. Полученный по методике-прототипу средний результат открываемости АК в модельной смеси №1 превышает верхний предел нормы, что свидетельствует о несоответствии методики фармакопейным требованиям по критерию «правильность».

Другой важной характеристикой методики количественного определения является прецизионность (воспроизводимость) - рассеяние результатов относительно величины среднего результата (ГФ РФ, 2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.1.0012.15: Валидация аналитических методик). С целью определения прецизионности использована модельная смесь №1, точную навеску которой массой около 0,5 г растворяли в воде в мерной колбе вместимостью 50 мл, доводили объем раствора водой до метки. Далее 10 мл приготовленного раствора по 6 раз титровали 0,02 моль/л раствором ОФФ (заявляемый способ) и 0,00167 моль/л раствором калия йодата (способ-прототип). Исходные данные: P=5,0000 г, a=0,5005 г, V₁=50 мл, V₂=10 мл, К=1,00, Т_ОФФ/АК=1,761 мг/мл, T_KIO3/АК=0,8824 мг/мл. Расчет стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD, %) проводили по известным уравнениям 18 и 19 соответственно:

Результаты определения прецизионности методик количественного определения АК в модельной смеси №1 заявляемым способом и способом-прототипом приведены в табл. 10. Оценка прецизионности является функцией аналитических концентраций: при содержании определяемого компонента в образце в пределах 1-10% (в модельной смеси №1 концентрация АК 7%) значение RSD должно быть ≤±2,7%. Полученные данные свидетельствуют о соответствии значений RSD требованиям выше указанной ассоциации, а, значит, и о прецизионности обеих методик.

С целью определения устойчивости 0,02 моль/л раствора ОФФ его хранили в склянках темного стекла с притертыми пробками в защищенном от света месте, периодически устанавливая его титр (поправочный коэффициент) с помощью 0,1 моль/л раствора натрия тиосульфата (подробная методика приведена в примере 1, пункт 1). Результаты определения устойчивости 0,02 моль/л раствора ОФФ приведены в табл. 11. Таким образом, при надлежащих условиях хранения даже в течение 4 месяцев 0,02 моль/л раствор ОФФ устойчив: согласно ГФ РФ (2015, 13 изд., т. 1, ОФС.1.3.0002.15: Титрованные растворы), допустимое отклонение К≤2%).

Способ количественного определения АК поясняется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Количественное определение АК в субстанции

1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента). 1 мл раствора должен содержать 11,9294 мг ОФФ.

В мерную колбу вместимостью 1 л с помощью 100 мл воды очищенной вносят точные навески 14,0820 г фенантролина гидрохлорида моногидрата и 9,6440 г железа (III) аммония сульфата додекагидрата (железоаммониевых квасцов), добавляют 25 мл 10% раствора серной кислоты, содержимое колбы перемешивают и через 10 мин доводят объем раствора водой очищенной до метки. Для установления точной концентрации к 25,00 мл приготовленного раствора ОФФ добавляют 3 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, 2 г калия йодида, 1 мл 0,1%) раствора крахмала. Через 10 мин смесь титруют из бюретки или микробюретки 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата потенциометрически на приборе «рН-340» при использовании платинового (индикаторный) и хлоридсеребряного (электрод сравнения) электродов, фиксируя значения Е^o (мВ) в зависимости от V_T (мл). В графической системе «Е^o, мВ - V_T, мл» строят кривую потенциометрического титрования (рис. 3), по которой определяют скачок титрования и V_T в точке эквивалентности. На представленной потенциометрической кривой титрования обнаружен скачок титрования, где в точке эквивалентности величина Е^o составляет +413 мВ, ей соответствует объем титранта (0,1 моль/л раствора натрия тиосульфата) 25,00 мл. Таким образом, используя уравнение (13), величина К раствора ОФФ составляет:

Значит, фактически раствор ОФФ приготовлен с теоретически заданной концентрацией (0,02 моль/л).

2. Количественное определение АК в субстанции

Около 0,1 г субстанции АК (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют примерно в 50 мл воды очищенной, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют 0,02 моль/л раствором ОФФ на приборе «рН-340», применяя в качестве индикаторного электрода платиновый электрод, в качестве электрода сравнения - хлоридсеребряный электрод. В процессе титрования фиксируют значения Е^o (мВ) и V_T (мл), по которым строят кривую потенциометрического титрования (рис. 4). На потенциометрической кривой титрования субстанции АК отмечен потенциал в точке эквивалентности, составивший +310 мВ, ему соответствует объем титранта 5,76 мл.

Результаты анализа: a=0,1015 г, V₁=100 мл, V₂=10 мл, V_T=5,76 мл, K=1,00, Т=1,761 мг/мл, Р=100%.

Содержание АК в субстанции:

Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в субстанции должно быть не менее 99,0%, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Пример 2. Количественное определение АК в 5% растворе для инъекций (производитель ОАО «Мосхимфармпрепараты», г. Москва)

1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.

2. Количественное определение АК в инъекционном растворе

Ампулу с инъекционным раствором АК вскрывают, содержимое ампулы с помощью шприца извлекают и переносят в химический стакан. 0,50 мл инъекционного раствора АК помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).

Результаты анализа: а=0,50 мл, V₁=50 мл, V₂=10 мл, V_T=2,85 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл, Р=1 мл.

Содержание АК в инъекционном растворе:

Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в 5% инъекционном растворе должно быть 0,0475-0,0525 г/мл, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Пример 3. Количественное определение АК в драже «Ревит», содержащих 35 мг АК, 0,86 мг ретинола пальмитата (витамин А), по 1 мг тиамина гидрохлорида (витамин В₁) и рибофлавина (витамин В₂), вспомогательных веществ до массы 1 драже 0,5 г (Машковский М.Д., 2012, 16 изд.) (производитель ОАО «Уралбиофарм», г. Екатеринбург)

1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.

2. Количественное определение АК в драже «Ревит»

На аналитических весах взвешивают каждое из 10 драже, определяют среднюю массу 1 драже. Затем 10 драже помещают в ступку и тщательно растирают до образования однородного порошка. Точную навеску порошка растертых драже массой около 0,5 г вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют примерно 25 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).

Результаты анализа: Р (средняя масса 1 драже)=0,5050 г, а=0,5012 г, V₁=50 мл, V₂=10 мл, V_T=4,00 мл, K=1,00, Т=1,761 мг/мл.

Содержание АК в драже «Ревит»:

Содержание АК в 1 драже «Ревит» должно быть 0,0333-0,0368 г, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Пример 4. Количественное определение АК в таблетках АК с глюкозой, содержащих по 25 мг АК и глюкозы, вспомогательных веществ до массы 1 таблетки 3,0 г (Машковский М.Д., 2012, 16 изд.) (производитель ОАО «Татхимфармпрепараты», г. Казань)

1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.

2. Количественное определение АК в таблетках АК с глюкозой

На аналитических весах взвешивают каждую из 10 таблеток, определяют среднюю массу 1 таблетки. Затем 10 таблеток помещают в ступку и тщательно растирают до образования однородного порошка. Точную навеску порошка растертых таблеток массой около 0,5 г вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют примерно 25 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки. Аликвотную часть полученного раствора объемом 10 мл помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, потенциометрически титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).

Результаты анализа: Р (средняя масса 1 таблетки)=3,0010 г, а=0,4995 г, V₁=50 мл, V₂=10 мл, V_Т=0,48 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл.

Содержание АК в драже «Ревит»:

Согласно ГФ (ГФ СССР, 1968, 10 изд.), содержание АК в 1 таблетке АК с глюкозой должно быть 0,0238-0,0263 г, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Пример 5. Количественное определение АК в плодах шиповника коричного (Rosa majalis)

1. Приготовление раствора титранта ОФФ (0,02 моль/л) и установление его титра (поправочного коэффициента) проводят аналогично примеру 1 (пункт 1). Величина К=1,00.

2. Количественное определение АК в плодах шиповника

Из грубо измельченных плодов шиповника отбирают точную навеску массой около 0,5 г, помещают в ступку, где тщательно растирают со стеклянным порошком, постепенно добавляя 50 мл воды, настаивают 10 мин. Извлечение декантируют, отбирают его аликвотную часть объемом 10 мл, помещают в химический стакан вместимостью 50 мл, титруют из микробюретки 0,02 моль/л раствором ОФФ аналогичным образом, как описано в примере 1 (пункт 2).

Результаты анализа: а=0,5100 г, V₁=50 мл, V₂=10 мл, V_T=1,85 мл, K=1,00, T=1,761 мг/мл, Р=100%.

Содержание АК в плодах шиповника коричного:

Согласно ГФ (ГФ СССР, 1989, 11 изд., вып. 2), содержание АК в плодах шиповника должно быть не менее 0,2%, поэтому полученный результат удовлетворяет фармакопейным требованиям.

Таким образом, положительный эффект предлагаемого способа заключается в следующем:

1. Заявляемая методика количественного определения АК, в отличие от способа-прототипа, характеризуется специфичностью: способностью однозначно оценить концентрацию АК в присутствии сопутствующих компонентов (действующих (лекарственных) и вспомогательных веществ). При одинаковом содержании АК в модельных смесях с сопутствующими компонентами и без них расход титранта (ОФФ) в обоих случаях одинаков; при наличии только сопутствующих компонентов расхода титранта не происходит. В способе-прототипе, напротив: расход титранта (калия йодата) наблюдается даже в случае отсутствия АК, кроме того, он завышен в смеси, где, наряду с АК, содержатся сопутствующие компоненты. Возможно, причиной этому является более высокое значение Е^o калия йодата (+1,19 B), вступающего в побочные взаимодействия с другими восстановителями (витаминами A, B₁, В₂, глюкозой и др.). Сравнивая с номинальным содержанием АК в модельных смесях, относительная погрешность определения по заявляемому способу составляет 2,9%, по способу-прототипу 11,5%. Специфичность заявляемой методики также подтверждена ее апробацией на различных ЛС промышленного производства (инъекционном растворе, драже, таблетках, плодах шиповника) путем сравнения полученных результатов определения АК с номинальным содержанием АК.

2. Заявляемая методика, в отличие от прототипа, характеризуется линейностью - достаточно жесткой зависимостью объема титранта (ОФФ) от концентрации АК, что графическим и расчетным способами подтверждается уравнением линейной регрессии: у=25,674х-4,186 и достаточным значением коэффициента корреляции (0,990), отвечающим фармакопейному условию количественного определения (≥0,99). Методика по способу-прототипу описывается уравнением линейной регрессии: у=51,203х-10,409 (с большими почти в 2 раза значениями углового коэффициента «b» и свободного члена уравнения «а») и недостаточным для фармакопейного условия количественного определения значением коэффициента корреляции (0,985).

3. Заявляемая методика характеризуется расширенным по сравнению с фармакопейным требованием ее применимости (80-120% от номинального значения определяемой аналитической характеристики при наличии линейной зависимости) диапазоном аналитической области концентраций АК (50-170%). Поскольку известная методика (способ-прототип) не отвечает условиям линейности, определение для нее аналитической области концентраций АК не представляется целесообразным.

4. Заявляемая методика, в отличие от прототипа, характеризуется правильностью, что подтверждается определением содержания АК при трех уровнях концентраций, отличающихся на 20%: открываемость АК, определяющая правильность методики, составляет 99,6%, что удовлетворяет фармакопейным требованиям (97-103%) для анализируемых концентраций АК). По способу-прототипу открываемость АК составляет 110,0%, что превышает допустимый верхний предел нормы (еще раз подтверждается получение завышенных результатов при применении известной методики).

5. Заявляемая методика, как и известная методика, обладает прецизионностью (воспроизводимостью результатов относительно среднего результата): значение относительного стандартного отклонения находится примерно на одном уровне (1,3-1,4%), не превышающем предельную норму (должно быть ≤±2,7% для анализируемых концентраций АК).

6. Заявляемая методика, в отличие от известной методики, отличается высокой точностью определения содержания АК: несмотря на то, что относительное стандартное отклонение результатов обеих методик примерно одинаковое (1,3%, 1,4%), относительная погрешность определения, оцененная по номинальному содержанию АК, по заявляемой методике (2,9%) в 4 раза ниже, чем по прототипу (11,5%). По-видимому, для способа-прототипа характерно наличие не случайных, а систематических погрешностей, обусловленных протеканием побочных реакций с сопутствующими компонентами.

7. Заявляемая методика отличается устойчивостью титранта (0,02 моль/л раствора ОФФ), при хранении которого в надлежащих условиях в течение наблюдаемого периода (4 месяцев), традиционного для устойчивых титрантов, поправочный коэффициент стабилен (отклонение на 1% при норме до 2%). Кроме того, реакция с предложенным титрантом (ОФФ), в отличие от реакции с применяемым титрантом (калия йодатом), не зависит от рН среды и ионной силы раствора.

8. Заявляемая методика отличается упрощенностью выполнения, не требуя использования никаких вспомогательных реактивов, что характерно для способа-прототипа (растворы хлористоводородной кислоты, калия йодида, крахмала). Кроме того, потенциометрический способ фиксации точки эквивалентности (заявляемый способ), в отличие от индикаторного способа (прототип), позволяет проводить титрование в окрашенных и мутных растворах (исключая фильтрацию взвесей), в растворах с повышенной температурой, снизить относительную погрешность определения АК.