Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ СНИЖЕНИЯ ВЯЗКОСТИ В СПОСОБЕ ПИВОВАРЕНИЯ

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме. Машиночитаемая форма включена в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу снижения вязкости в способе пивоварения, включающем солод и добавку.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы пивоварения хорошо известны из уровня техники. Как правило, он включает стадии получения солода, затирания, фильтрования затора, варки сусла и сбраживания/выдержки.

Вкратце, в процессе получения солода обеспечивают проращивание зерен, а затем сушат и необязательно обжаривают. Способ получения солода обуславливает активацию ряда ферментов в зерне, которые могут превращать крахмал зерна в сахар.

До затирания солод измельчают с образованием солодовой крупки, которую смешивают с водой с образованием затора. Солодовая крупка также может содержать одну или несколько добавок. Затирание представляет собой способ превращения крахмала в заторе в сбраживаемые и несбраживаемые сахара. Способ затирания, как правило, осуществляют в течение некоторого периода времени при различных температурах, для того, чтобы активировать эндогенные ферменты, ответственные за расщепление белков и углеводов.

Экзогенные ферменты можно добавлять при осуществлении способа затирания с целью ускорения реакций, и также они позволяют лучше контролировать процесс пивоварения. К концу затирания, температуру можно повышать до 75-80°C. После затирания, полученную жидкость процеживают от зерен на стадии фильтрования, такой как фильтрование затора или сцеживание. Полученная из стадии фильтрования жидкость известна как сусло. Сусло с высоким содержанием сахаров затем кипятят с хмелем, охлаждают, а затем сбраживают в этанол с применением дрожжей. Полученное пиво выдерживают в течение периода времени от недели до нескольких месяцев, а затем упаковывают.

Важными некрахмальными полисахаридами, присутствующими в зерне злаков, являются бета-глюкан и арабиноксилан. Клеточная стенка эндосперма злаков различных злаковых растений содержит, как правило, 20-75% бета-глюкана, 20-75% арабиноксилана и 5% оставшегося белка, с небольшим количеством целлюлозы, глюкоманнана и фенольных кислот. Длинные цепи арабиноксиланов, и в меньшей степени бета-глюкана, которые не были модифицированы за счет ферментативного гидролиза, могут обуславливать образование гелей при растворении в воде, и данные гели будут сильно увеличивать вязкость сусла и снижать фильтрационную способность.

В патентном документе WO 97/42301 описывают применение альфа-L-арабинофуранозидаз (GH51 и GH54) в способе получения сусла.

За последнее время произошло резкое изменение цен на сырьевые материалы, обусловленное повышенным спросом на зерно, глобальным дефицитом воды, изменением погодных условий и т. д. Это подтолкнуло пивоваренную промышленность сосредоточиться на эффективности производства, а также на экономии сырьевого материала.

Существует потребность в улучшенных способах фильтрования в пивоварении, которые будут снижать затраты и/или повышать эффективность производства.

На фигуре 1 приведена сравнительная характеристика принадлежащих семейству GH51 и GH43 арабинофуранозидаз в отношении снижения вязкости при высокоплотном затирании ячменя и солода. Левая часть: кривые зависимости эффекта от дозы. Правая часть: снижение вязкости, выраженное в процентах от контроля.

На фигуре 2 приведена сравнительная характеристика принадлежащих семейству GH51 и GH43 арабинофуранозидаз в отношении снижения вязкости при высокоплотном затирании пшеницы и солода. Левая часть: кривые зависимости эффекта от дозы. Правая часть: снижение вязкости, выраженное в процентах от контроля.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что вязкость в ходе процесса пивоварения может быть существенно снижена посредством добавления арабинофуранозидазы GH43 к затору, таким образом, заявляется следующее.

Способ снижения вязкости в способе пивоварения, включающий стадии:

(a) получения затора из солода и добавки и

(b) добавления арабинофуранозидазы GH43 к затору.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где добавка выбрана из группы, состоящей из ячменя и пшеницы.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют бета-глюканазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют ксиланазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где арабинофурозидаза GH43 по меньшей мере на 70% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где в заторе соотношение воды/солодовой крупки составляет от 2,0:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где добавка составляет по меньшей мере 10% (вес/вес) от общего веса добавки и солода.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где затирание включает стадию инкубирования при температуре в диапазоне от 45°C до 60°C.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют протеазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют пуллуланазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют липазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где к затору дополнительно добавляют альфа-амилазу.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где затор фильтруют с получением сусла.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где сусло сбраживают с получением пива.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где добавляют арабинофуранозидазу GH43 в количестве 0,5-10,0 мг белка-фермента на кг солодовой крупки.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу, где арабинофуранозидаза GH43 обладает активностью по отношению к дизамещенным ксилозам.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В данном раскрытии применяются различные термины, которые обычно понятны специалистам в данной области техники. Некоторые термины, используемые в конкретном значении, тем не менее, имеют значение, определенное следующим образом.

В контексте данного документа термин “солодовая крупка” понимают как материал, содержащий крахмал или сахар, который является основой для получения пива, например, ячменный солод и добавку. Как правило, солодовая крупка вообще не содержит добавленную воду.

Термин “солод” понимают как любое соложеное зерно злаков, в частности, ячменя.

Термин “добавка” понимают как часть солодовой крупки, которая не является ячменным солодом. Добавка может представлять собой любой растительный материал с высоким содержанием крахмала, например, несоложеное зерно, такое как, без ограничения, ячмень, кукуруза, рис, сорго и пшеница. Добавка также включает легко сбраживаемый сахар и/или сироп.

Крахмал некоторых из добавок характеризуется относительно низкой температурой клейстеризации, что обеспечивает их затирание вместе с солодом, тогда как другие добавки, такие как рис, кукуруза и сорго, характеризуются более высокой температурой клейстеризации, такие добавки, как правило, термически обрабатывают отдельно и разжижают с помощью альфа-амилазы перед добавлением их к затору.

Термин “затор” понимают как содержащую крахмал взвесь, содержащую измельченный ячменный солод, измельченное несоложеное зерно, другой содержащий крахмал материал или их комбинацию, замоченные в воде с получением сусла.

Термин “сусло” понимают как не подвергшуюся брожению жидкость, стекшую после экстракции солодовой крупки во время затирания.

Термин “дробина” понимают как отжатые твердые вещества, оставшиеся, когда солодовая крупка была экстрагирована, а сусло отделено.

Термин “пиво” в данном документе понимают как сброженное сусло, т.е. алкогольный напиток, сваренный из солода, добавки и хмеля. Подразумевается, что используемый в данном документе термин "пиво" охватывает по меньшей мере пиво, полученное из заторов, полученных из смеси соложеных и несоложеных злаков. Термин "пиво" также охватывает сорта пива, полученные из добавок, и сорта пива со всеми возможными значениями содержания спирта.

Идентичность последовательностей: родство между двумя аминокислотными последовательностями описывается параметром “идентичность последовательностей”.

В целях настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который применен в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, обозначенные как “наиболее длинный идентичный участок” (полученные с применением опции – nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка – общее число гэпов в выравниваемом участке).

Получение сусла в соответствии с настоящим изобретением

Настоящее изобретение относится к способу снижения вязкости в способе пивоварения, включающему стадии:

(a) получения затора из солода и добавки и

(b) добавления арабинофуранозидазы GH43 к затору.

В соответствии с настоящим изобретением к затору добавляют арабинофуранозидазу GH43, при этом снижается вязкость, и каждая последующая стадия фильтрования в способе пивоварения будет проходить быстрее.

Солод предпочтительно получают из одного или нескольких видов зерна, выбранного из перечня, состоящего из кукурузы, ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса и риса. Предпочтительно, солод представляет собой ячменный солод.

В дополнение к солоду, солодовая крупка в соответствии с настоящим изобретением содержит одну или несколько добавок, таких как несоложеная кукуруза или другое несоложеное зерно, такое как ячмень, пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, майло, просо и/или сорго, или сырой и/или рафинированный крахмал, и/или содержащий сахар материал, полученный из растений, таких как пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, майло, просо, сорго, картофель, сладкий картофель, маниок, тапиока, саго, банан, сахарная свекла и/или сахарный тростник. В соответствии с настоящим изобретением добавки можно получать из клубней, корней, стеблей, листьев, бобов, злаков и/или цельного зерна.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительной является добавка, выбранная из группы, состоящей из ячменя и пшеницы.

Перед получением затора солод и/или добавку предпочтительно размалывают и наиболее предпочтительно размалывают посредством сухого или мокрого помола.

В соответствии с настоящим изобретением, добавка составляет по меньшей мере 10% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 15% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 20% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 25% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 30% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 35% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 40% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 45% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 50% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 55% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 60% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 65% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 70% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 75% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 80% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 85% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 90% (вес/вес) от общего веса добавки и солода, например, добавка составляет по меньшей мере 95% (вес/вес) от общего веса добавки и солода.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения затор получают путем измельчения солодовой крупки, содержащей солод и добавку. Добавленная к солодовой крупке вода может быть предварительно подогрета для достижения необходимой температуры затора в момент образования затора.

Настоящее изобретение является особенно пригодным при низком соотношении воды/солодовой крупки, таким образом, в соответствии с настоящим изобретением соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,0:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес), например, соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,1:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес), например, соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,2:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес), например, соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,3:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес), например, соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,4:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес), например, соотношение воды/солодовой крупки в заторе составляет от 2,5:1,0 до 3,0:1,0 (вес/вес).

Температурный профиль способа затирания может представлять собой профиль общепринятого процесса затирания, где показатели температуры устанавливают для достижения оптимального расщепления сухого вещества солодовой крупки ферментами солода.

В способе затирания, как правило, используют контролируемое постадийное повышение температуры, где на каждой стадии предпочтение отдается одному ферментативному действию над другим. Температурные профили затирания в целом известны из уровня техники. В одном аспекте настоящего изобретения затирание включает по меньшей мере одну стадию инкубирования при температуре в диапазоне от 45ºC до 60ºC, при этом арабинофуранозидаза GH43 является активной.

Примером температурного профиля при затирании, пригодного в соответствии с настоящим изобретением, является 52°C (20 мин.); 64°C (40 мин.); 72°C (20 мин.); 78°C (5 мин.); при этом применяемая скорость нагревания составляет 1°C/мин.

В одном аспекте pH затора находится в диапазоне от приблизительно 4,6 до приблизительно 6,4. В другом аспекте pH находится в диапазоне от приблизительно 4,6 до 6,2, как например, в диапазоне pH от приблизительно 4,8 до приблизительно 6,0, предпочтительно в диапазоне pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, более предпочтительно в диапазоне pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,6, еще более предпочтительно в диапазоне pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,4.

Получение сусла из затора, как правило, включает процеживание сусла от дробины. Через дробину можно пропускать горячую воду для выполаскивания, или вымывания, оставшегося экстракта из солодовой крупки.

После отделения сусла от дробины из солодовой крупки сусло можно применять в неизменном виде или его можно обезвоживать с получением концентрированного и/или высушенного сусла. Концентрированное и/или высушенное сусло можно применять в качестве экстракта при пивоварении, в качестве отдушки из солодового экстракта, для безалкогольных солодовых напитков, солодового уксуса, сухих завтраков, для кондитерских изделий и т. д.

В предпочтительном варианте осуществления сусло сбраживают для получения алкогольного напитка, предпочтительно пива, например, эля, крепкого эля, пива "биттер", пива "стаут", пива "портер", пива "лагер", пива марки "экспорт", солодового напитка, ячменного вина, хаппосю, пива с высоким содержанием алкоголя, пива с низким содержанием алкоголя, низкокалорийного пива или светлого пива. Сбраживание сусла также может включать подачу в сусло дрожжевой суспензии, содержащей свежие дрожжи, т. е., дрожжи, не используемые ранее для настоящего изобретения, или дрожжи могут представлять собой повторно используемые дрожжи. Используемые дрожжи могут представлять собой любые дрожжи, пригодные для варки пива, в частности, дрожжи, выбранные из Saccharomyces spp., как например, S. cerevisiae и S. uvarum, в том числе естественные или искусственно полученные варианты этих организмов. Способы сбраживания сусла для получения пива хорошо известны специалистам в данной области техники.

Ферменты

В одном аспекте арабинофуранозидазу GH43 вводят в начале затирания. В другом аспекте арабинофуранозидазу GH43 вводят во время затирания.

В одном аспекте настоящее изобретение включает добавление к затору как арабинофуранозидазы GH43, так и бета-глюканaзы; в частности, добавление к затору GH43 и бета-глюканазы GH5; предпочтительно добавление к затору арабинофуранозидазы GH43 и бета-глюканaзы GH5_5.

В одном аспекте настоящее изобретение включает добавление к затору как арабинофуранозидазы GH43, так и ксиланазы; в частности, добавление к затору арабинофуранозидазы GH43 и ксиланазы GH10.

В одном аспекте настоящее изобретение включает добавление к затору арабинофуранозидазы GH43, бета-глюканaзы и ксиланазы.

В одном аспекте настоящее изобретение включает добавление арабинофуранозидазы GH43, бета-глюканaзы GH5 и ксиланазы GH10, в частности, арабинофуранозидазы GH43, бета-глюканaзы GH5_5 и ксиланазы GH10.

В другом предпочтительном варианте осуществления к затору добавляют дополнительный фермент(ы), при этом указанный фермент(ы) включает(ют) без ограничения протеазу, пуллуланазу, липазу и альфа-амилазу.

Ферменты, используемые в настоящем изобретении, следует выбирать исходя из их способности сохранять достаточную активность при температуре способа согласно способам по настоящему изобретению, а также исходя из их способности сохранять достаточную активность в заторе при умеренно кислом pH, и их следует добавлять в эффективных количествах. Ферменты можно получать из любого источника, предпочтительно из растения или водоросли, и более предпочтительно из микроорганизма, как например, из бактерий или грибов.

Арабинофуранозидаза GH43

В используемой в настоящем раскрытии нумерации семейств гликозидгидролаз придерживаются концепции Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) CAZy - Carbohydrate-Active Enzymes server по URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html, или, в качестве альтернативы, Coutinho, P.M. & Henrissat, B. 1999; The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach, в "Genetics, Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation", K. Ohmiya, K. Hayashi, K. Sakka, Y. Kobayashi, S. Karita and T. Kimura eds., Uni Publishers Co., Tokyo, pp. 15-23, and Bourne, Y. & Henrissat, B. 2001; Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules, Current Opinion in Structural Biology 11:593-600.

В предпочтительном варианте осуществления арабинофуранозидаза GH43, также называемая альфа-L-арабинофуранозидазой GH43, обладает активностью по отношению к дизамещенным ксилозам.

Арабинофуранозидаза GH43 может быть микробного происхождения, например, получаемая из штамма нитчатого гриба (например, Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) или из бактерий (например, Bacillus, Bifidobacterium).

Предпочтительно, арабинофуранозидазу GH43 получают из Humicola insolens. Наиболее предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 70% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 75% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 80% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 85% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 91% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 92% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 93% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 94% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 96% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 97% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 98% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 по меньшей мере на 99% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 на 100% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1.

Арабинофуранозидазу GH43 также можно получать из Bifidobacterium adolescenti. Более предпочтительно арабинофуранозидаза GH43 представляет собой фермент, описанный Van Laere, 1997, в Appl.Microbiol.Biotechnol, 47, 231-235 и/или Van den Broek, 2005, в Applied Microbiology and Biotechnology.

Арабинофуранозидазу GH43 можно добавлять в количестве 0,5-20 мг белка-фермента на кг солодовой крупки; предпочтительно 0,5-15 мг белка-фермента на кг солодовой крупки; и еще более предпочтительно 0,5-10 мг белка-фермента на кг солодовой крупки.

Арабинофуранозидаза GH51

Арабинофуранозидаза GH51, также называемая альфа-L-арабинофуранозидазой GH51, обладает активностью по отношению к однозамещенным ксилозам. Она может быть микробного происхождения, например, получаемая из штамма нитчатого гриба (например, Meripilus, Humicola, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Penicillum) или из бактерий (например, Bacillus).

Предпочтительно фермент является арабинофуранозидазой GH51, полученной из Meripilus giganteus. Наиболее предпочтительно арабинофуранозидаза GH51 представляет собой полипептид, представленный как SEQ ID NO:2.

Бета-глюканaза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют бета-глюканaзу (EC 3.2.1.4.). Бета-глюканaза, также называемая целлюлазой, может быть грибкового происхождения, как например, из Aspergillus, например, Aspergillus orzyae или Aspergillus niger, или из бактерий, как например, Bacillus, например, Bacillus subtilis.

В частности, бета-глюканазу можно получать из Thermoascus, в частности, из Thermoascus aurantiacus. Наиболее предпочтительно бета-глюканаза является GH5 глюканазой; в частности, GH5_5 глюканазой.

Ксиланаза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют ксиланазу. В одном аспекте ксиланазная активность обеспечивается ксиланазой из семейства 10 гликозилгидролаз. В одном аспекте ксиланаза по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична ксиланазе, описанной в патентном документе WO 94/21785. В другом аспекте ксиланаза представляет собой Shearzyme ™ от Novozymes A/S.

В предпочтительном варианте осуществления ксиланазу получают из Aspergillus aculeatus, в частности, ксиланазу семейства GH10 из Aspergillus aculeatus.

Протеаза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют протеазу. Пригодные протеазы включают микробные протеазы, такие как грибковые и бактериальные протеазы. Предпочтительными протеазами являются кислые протеазы, т. е. протеазы, характеризующиеся способностью гидролизовать белки в кислых условиях при pH ниже 7. Протеазы отвечают за уменьшение общей длины высокомолекулярных белков до низкомолекулярных белков в заторе. Низкомолекулярные белки являются необходимыми для питания дрожжей, а высокомолекулярные белки обеспечивают стойкость пены. Следовательно, специалисту в данной области техники хорошо известно, что протеазу следует добавлять в сбалансированном количестве, которое одновременно обеспечивает достаточное количество свободных аминокислот для дрожжей и оставляет достаточно высокомолекулярных белков для стабилизации пены. В одном аспекте протеазная активность обеспечивается системой протеолитических ферментов, характеризующейся подходящей активностью для образования FAN, включающей эндопротеазы, экзопептидазы или любую их комбинацию, предпочтительно металлопротеазу. Предпочтительно, протеаза по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:6, описанной в патентном документе WO 99/67370. В другом аспекте протеаза представляет собой Neutrase™, доступную от Novozymes A/S.

Пуллуланаза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют пуллуланазу (EC 3.2.1.41). Пуллуланаза катализирует гидролиз (1->6)-альфа-D-глюкозидных связей в пуллулане, амилопектине и гликогене и в предельных альфа- и бета-декстринах амилопектина и гликогена.

Пуллуланаза согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой пуллуланазу, например, из Pyrococcus или Bacillus, как например, Bacillus acidopullulyticus, например, описанную в Kelly et al., 1994, FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, или пуллуланазу, доступную от Novozymes A/S как Promozyme 400L. Пуллуланаза может также происходить из Bacillus naganoencis или Bacillus deramificans, как например, пуллуланаза, полученная из Bacillus deramificans (патент США №5736375).

Наиболее предпочтительно пуллуланазу получают из Bacillus acidopullulyticus. Предпочтительная пуллуланаза представляет собой пуллуланазу с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 50%, как например, по меньшей мере на 55%, как например, по меньшей мере на 60%, как например, по меньшей мере на 65%, как например, по меньшей мере на 66%, как например, по меньшей мере на 70%, как например, по меньшей мере на 75%, как например, по меньшей мере на 80%, как например, по меньшей мере на 85%, как например, по меньшей мере на 86%, как например, по меньшей мере на 87%, как например, по меньшей мере на 88%, как например, по меньшей мере на 89%, как например, по меньшей мере на 90%, как например, по меньшей мере на 91%, как например, по меньшей мере на 92%, как например, по меньшей мере на 93%, как например, по меньшей мере на 94%, как например, по меньшей мере на 95%, как например, по меньшей мере на 96%, как например, по меньшей мере на 97%, как например, по меньшей мере на 98%, как например, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична последовательности пуллуланазы 3, раскрытой в патентном документе WO 2009/075682.

Липаза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют липазу (EC 3.2.1.41). В одном варианте осуществления липазная активность обеспечивается липазой, характеризующейся активностью в отношении триглицеридов, и/или галактолипидов, и/или фосфолипидов. Предпочтительно липазная активность обеспечивается липазой из Fusarium (в том числе F. oxysporum и F. heterosporum), Aspergillus (в том числе A. tubigensis), Rhizopus (в том числе R. oryzae) или Thermomyces (в том числе T. lanuginosus) или их вариантом. Примером является Lipopan X (Lipopan Xtra), вариант липазы Thermomyces lanuginosus с заменами G91A +D96W +E99K +P256V +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270A +271G +272G +273F (+274S), описанный в патентном документе WO 2004/099400A2. В другом аспекте липаза представляет собой липазу/фосфолипазу из Fusarium oxysporum, описанную в EP 869167, доступную от Novozymes A/S как Lipopan™ F. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липаза представляет собой Lipozyme TL^® или Lipolase^®; данная липаза оказывает значительное положительное действие на скорость фильтрования и уменьшение мутности, и доступна от Novozymes A/S, Дания. Липаза также может представлять собой Lipex^®, вариант Lipozyme, доступный от Novozymes A/S, Дания. Липазы расщепляют липиды ячменя, например, триглицериды, до неполных глицеридов и свободных жирных кислот. Это приводит к меньшему помутнению и значительно улучшенным свойствам фильтрования затора и сцеживания пивного сусла.

Альфа-амилаза

В дополнительном варианте осуществления к затору добавляют альфа-амилазу (EC 3.2.1.1). Конкретный фермент-альфа-амилаза, применяемый в способах и/или композициях по настоящему изобретению, может представлять собой альфа-амилазу из Bacillus. Хорошо известные альфа-амилазы Bacillus включают альфа-амилазу, полученную из штамма B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. stearothermophilus. В одном аспекте настоящего изобретения применяемая альфа-амилаза Bacillus представляет собой альфа-амилазу, которая определена в патентном документе WO 99/19467, со страницы 3, строка 18, по страницу 6, строка 27. Предпочтительно альфа-амилаза по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 91%, предпочтительно по меньшей мере на 92%, предпочтительно по меньшей мере на 93%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 96%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в аминокислотной последовательности, раскрытой как SEQ ID NO: 3 в WO 99/19467, с мутациями: I181* + G182* + N193F. Также предполагается применение альфа-амилазы Termamyl™ SC от Novozymes A/S. Другой альфа-амилазой, применяемой в способах по настоящему изобретению, может быть любая грибковая альфа-амилаза, например, альфа-амилаза, из видов рода Aspergillus, и предпочтительно из штамма Aspergillus niger.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не предполагаются как ограничивающие каким-либо образом объем заявляемого изобретения.

Пример 1

Сравнительная характеристика арабинофуранозидаз (AraF) семейства GH43 и семейства GH51 в отношении их способности снижать вязкость сусла при добавлении к затору, содержащему ячменный солод и ячмень

Солодовое сусло получали следующим образом.

В стакан для затирания добавляли 48,0 г молотого ячменного солода (0,2 мм) и 32,0 г ячменя вместе со 197 мл H₂O (54°C) и 3,0 мл раствора CaCl2 (11,0 г CaCl₂⋅2H₂O/500 мл H₂O).

Арабинофуранозидазы, принадлежащие семейству GH43 (SEQ ID NO:1) и GH51 (SEQ ID NO:2), по отдельности добавляли в начале затирания (52°C) в дозах, составляющих соответственно 2,5, 5 и 10 мг EP/кг солодовой крупки.

Применяли следующий профиль затирания: 52°C (20 мин.), 64°C (40 мин.), 72°C (20 мин.), 78°C (5 мин.), охлаждение до 20°C. Скорость нагревания между перерывами затирания составляла 1°C/мин.

После затирания потери при испарении были откорректированы путем добавления воды с целью получения конечного веса 280 г. Затор фильтровали через фильтровальную бумагу (Whatman 597½), помещенную в пластиковую воронку. Фильтрат (сусло) анализировали в отношении плотности (анализатор пива, Anton Paar, Грац, Австрия) и динамической вязкости (микровискозиметр, Anton Paar, Грац, Австрия) при 20°C. Динамическую вязкость η = f (плотность) нормализовали до уровня 24,2°П с применением гиперболической функции, описанной в Mitteleuropäische Brautechnische Analysenkommission (MEBAK) “Raw Material” (2011), глава 3.1.4.4.

На фигуре 1 приведена сравнительная характеристика принадлежащих семейству GH51 и GH43 арабинофуранозидаз в отношении снижения вязкости при высокоплотном затирании ячменя и солода. Левая часть: кривые зависимости эффекта от дозы; правая часть: снижение вязкости, выраженное в процентах от контроля. На фигуре показано, что при уровне фермента, составляющего 2,5 мг белка-фермента на кг солодовой крупки, в случае применения AraF GH51, снижение вязкости составляет 2,1%, в то время как в случае применения AraF GH43, снижение вязкости составляет 7,7%. Это показывает, что AraF GH43 является неожиданно подходящей при высокоплотном затирании.

Пример 2

Сравненительная характеристика арабинофуранозидаз (AraF) семейства GH43 и семейства GH51 в отношении их способности снижать вязкость сусла при добавлении к затору, содержащему ячменный солод и пшеницу

Солодовое сусло получали следующим образом.

В стакан для затирания добавляли 48,0 г молотого ячменного солода (0,2 мм) и 32,0 г пшеницы вместе со 197 мл H₂O (54°C) и 3,0 мл раствора CaCl₂ (11,0 г CaCl₂⋅2H₂O/500 мл H₂O).

Арабинофуранозидазы, принадлежащие семейству GH43 (SEQ ID NO:1) и GH51 (SEQ ID NO:2), по отдельности добавляли в начале затирания (52ºC) в дозах, составляющих соответственно 2,5, 5 и 10 мг EP/кг солодовой крупки.

Применяли следующий профиль затирания: 52°C (20 мин), 64°C (40 мин), 72°C (20 мин.), 78°C (5 мин), охлаждение до 20°C. Скорость нагревания между перерывами затирания составляла 1°C/мин.

После затирания потери при испарении были откорректированы путем добавления воды с целью получения конечного веса 280 г. Затор фильтровали через фильтровальную бумагу (Whatman 597½), помещенную в пластиковую воронку. Фильтрат (сусло) анализировали в отношении плотности (анализатор пива, Anton Paar, Грац, Австрия) и динамической вязкости (микровискозиметр, Anton Paar, Грац, Австрия) при 20°C. Динамическую вязкость η = f (плотность) нормализовали до уровня 24,2ºП с применением гиперболической функции, описанной в Mitteleuropäische Brautechnische Analysenkommission (MEBAK) “Raw Material” (2011), глава 3.1.4.4.

На фигуре 2 приведена сравнительная характеристика принадлежащих семейству GH51 и GH43 арабинофуранозидаз в отношении снижения вязкости при высокоплотном затирании пшеницы и солода. Левая часть: кривые зависимости эффекта от дозы; правая часть: снижение вязкости, выраженное в процентах от контроля. На фигуре показано, что при уровне фермента, составляющем 2,5 мг белка-фермента на кг солодовой крупки, в случае применения AraF GH51 снижение вязкости составляет 1,7%, в то время как в случае применения AraF GH43 снижение вязкости составляет 11,3%. Это показывает, что AraF GH43 является неожиданно подходящей при высокоплотном затирании.

Пример 3

Влияние применения арабинофуранозидазы семейства GH43 из H. insolens (SEQ ID:1) при затирании на последующую фильтрацию затора

Материалы и способы

Несоложеный ячмень (184 г) и солод Pilsner (276 г) размалывали с применением молотковой дробилки, оснащенной ситом с отверстием 0,2 мм. К обессоленной воде добавляли хлорид кальция с достижением конечной концентрации 60 ppm ионов Ca²⁺. После нагревания воды до 51°C добавляли солодовую крупку (комнатной температуры). По достижении температуры затора 50°C, добавляли ферменты согласно таблице 2 и начинали процедуру затирания (таблица 1).

После затирания вес горячего затора корректировали в соответствии с потерями при испарении и сразу переносили в нагретое с помощью рубашки (78°C) фильтрующее устройство типа KHS EW14/2CW, оснащенное стандартным полипропиленовым тканевым фильтром для затора и патрубком для подачи газа под давлением. Обеспечивали оседание затора в течение 4 минут. Затем фильтр поддавали воздействию давления (избыточное давление 40 кПа) и после дополнительной минуты начинали фильтрование путем открывания донного клапана фильтра. Вес фильтрата отслеживали в автоматическом режиме каждые 2 секунды, пока общая масса не достигала 1050 г. Чтобы оценить эффективность фильтрования, использовали модифицированный способ, описанный Vandenbusche et al. (Brewing and Beverage Industry International (3), 2004, p. 14-18). Вкратце, линеаризацию отслеженных данных осуществляли путем построения графика зависимости время/масса от массы. Для расчета коэффициента фильтрации (значение Fk) применяли наклон кривой линеаризованных данных в пределах 200-1000 г. Значение Fk определяли как Fk = η*a*c/p (η = динамическая вязкость; a = удельное сопротивление осадка на фильтре; c = концентрация нерастворимых частиц; p = давление). Низкое значение Fk указывает на хорошее фильтрование.

В дополнение к значению Fk, для иллюстрирования применяли второй, более простой параметр оценки эффективности фильтрования, время до момента сбора 1000 г фильтрата.

Фильтрат (сусло) анализировали на предмет вязкости, плотности экстракта, содержания β-глюкана>10000 кДа и арабиноксилана.

Таблица 1. Режим затирания, применяемый в эксперименте

Таблица 2. Сравнение эффективности фильтрования для исследуемых ферментов и аналитические данные полученных фильтратов. Во всех испытаниях Termamyl SC и Neutrase 0.8L применяли при уровнях доз 36 KNU-S/кг солодовой крупки и 0,16 AU-N/кг солодовой крупки соответственно, с тем, чтобы компенсировать снижение активности эндогенных ферментов солода (→ с применением 40% несоложеного ячменя). FXU = единицы активности грибковой ксиланазы, EGU = единицы активности эндоглюканазы, KNU-S = единицы активности альфа-амилазы, AU-N = единицы активности протеазы.

Результаты

Заторы получали из 40% ячменя и 60% солода, и при соотношении воды и солодовой крупки 2,5:1. Высококачественную смесь ферментов Ultraflo Max™, применяемую в производстве для улучшения разделения затора, содержащую эндоксиланазу и смесь целлобиогидролаз, с эндо- и экзо-бетаглюканазной активностью, добавляли при двух уровнях дозы (50 FXU = единицы активности грибковой ксиланазы + 140 EGU = единицы активности эндоглюканазы и 100 FXU + 280 EGU, исходя из массы солодовой крупки) в начале затирания. Эффективность фильтрования затора для этих ферментов сравнивали с заторами, полученными аналогичным образом, но с той разницей, что добавляемая смесь ферментов содержала эндо-1,4-бета-ксиланазу семейства GH10 из Aspergillus aculeatus, эндоглюканазу семейства GH5_5 из Thermoascus aurantiacus, и третий фермент, арабинофуранозидазу семейства GH43 из Humicola insolens (SEQ ID:1).

В таблице 2 показано, что применение последней комбинации при затирании уменьшает время фильтрования сладкого сусла до ~63% (при сравнении с низкой дозой Ultraflo Max низкой дозы) и ~72% (высокая доза Ultraflo Max), соответственно. Улучшенная фильтрация отображается на меньшей вязкости, которая снижается до ~89% (низкая доза Ultraflo Max) и 92% (высокая доза Ultraflo Max), соответственно.

Снижение вязкости можно объяснить лучшим расщеплением высокомолекулярного арабиноксилана, содержание которого снижается на ~53% при применении комбинации арабинофуранозидазы семейства GH43 из Humicola insolens (SEQ ID:1) с эндо-1,4-бета-ксиланазой семейства GH10 из Aspergillus aculeatus вместо применения исключительно эндо-1,4-бета-ксиланазы.

Пример 4

Влияние применения арабинофуранозидазы семейства GH43 из H. insolens при затирании на фильтрование пива

Материалы и способы

Несоложеный ячмень (64 г) и солод Pilsner (96 г) размалывали с применением дисковой мельницы с размольным зазором 0,2 мм. К обессоленной воде добавляли хлорид кальция с достижением конечной концентрации 60 ppm ионов Ca²⁺. После нагревания воды до 51°C добавляли солодовую крупку (комнатной температуры). По достижении температуры затора 50°C, добавляли ферменты согласно таблице 4 и начинали процедуру затирания (таблица 3). Соотношение воды и солодовой крупки при затирании составляло 2,5:1. После затирания вес горячего затора корректировали до 600 г в соответствии с потерями при испарении и сразу фильтровали через фильтровальную бумагу Macherey-Nagel 514¼.

Сладкое сусло анализировали в отношении плотности и разбавляли до 14°Плато с применением автоклавированной, обессоленной воды с содержанием 60 ppm ионов Ca²⁺. Разбавленное сусло нагревали до температуры кипения и добавляли 0,145 г хмеля (Hallertauer Tradition, 2012, 17% альфа кислот) на 450 г сусла. Сусло кипятили в течение 40 минут, и после кипячения потери при испарении компенсировали добавлением автоклавированной воды. Дрожжи штамма W34/70, которые размножали в течение ночи, добавляли в концентрации 2*10⁷клеток/мл сусла. Сбраживание осуществляли при 12°C в течение 7 дней с последующим хранением на льду в течение 5 дней. Затем проводили дегазацию пива и центрифугировали при 2ºC при 2000 об/мин, и надосадочную жидкость предварительно фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman 597^1/2 для удаления оставшихся дрожжевых клеток. Затем 50 мл предварительно отфильтрованного пива загружали в колонку XK26 (GE-Healthcare), доведенную до 0°C и оснащенную 0,45 мкм фильтром из ацетата целлюлозы. После достижения температуры равновесия к колонке прилагали давление 50 кПа (N₂). Массу пива, фильтруемого в течение некоторого времени, отслеживали в автоматическом режиме каждую 1 секунду. Применяемый тип фильтрования может быть описан как поверхностное фильтрование, что означает, что через некоторое время фильтрования скорость потока снижается в связи с повышением сопротивления фильтра. Первой стадией оценивания влияния отдельных добавляемых при затирании ферментов на эффективность фильтрования пива был расчет исходной скорости потока на основе отслеженных данных. Параметр, применяемый для определения эффективности фильтрования пива, получали путем определения массы фильтрата и время фильтрации на основе отслеженных значений данных, достигнутых в точке, где скорость потока составляла половину исходной скорости потока. До и после фильтрования пиво анализировали в отношении содержания β-глюкана, арабиноксилана и вязкости (при 0°C).

Таблица 3. Режим затирания, применяемый в эксперименте

Таблица 4. Сравнение эффективности фильтрования пива для исследуемых ферментов и аналитические данные полученных нефильтрованных образцов и фильтратов. Во всех испытаниях Termamyl SC и Neutrase 0.8L применяли при уровнях доз 36 KNU-S/кг солодовой крупки и 0,16 AU-N/кг солодовой крупки соответственно, с тем, чтобы компенсировать снижение активности эндогенных ферментов солода (→ с применением 40% несоложеного ячменя). FXU = единицы активности грибковой ксиланазы, EGU = единицы активности эндоглюканазы, KNU-S = единицы активности альфа-амилазы, AU-N = единицы активности протеазы.

Результаты

Сорта пива получали из 40% ячменя и 60% солода с плотностью пива 14°Плато. Высококачественную смесь ферментов Ultraflo Max, применяемую в производстве для улучшения разделения затора и пива, содержащую эндо-ксиланазу и смесь целлобиогидролаз, с эндо- и экзо-бета-глюканазной активностью, в начале затирания применяли в дозе при верхнем пределе дозировки, обычно используемой в производстве (100 FXU = единицы активности грибковой ксиланазы + 280 EGU = единицы активности эндоглюканазы, исходя из массы солодовой крупки) в качестве проверяемого эталона. Эффективность фильтрования сравнивали с сортами пива, полученными аналогичным образом, но с тем отличием, что добавляли смесь ферментов, содержащую эндо-1,4-бета-ксиланазу семейства GH10 из Aspergillus aculeatus, эндоглюканазу семейства GH5_5 из Thermoascus aurantiacus, и третий фермент, арабинофуранозидазу семейства GH43 из Humicola insolens (AraFGH43). В таблице 2 показано, что применение последней комбинации при затирании улучшало фильтрование на ~17% (исходя из массы фильтрата, собранного после промежутка времени до момента снижения исходной скорости потока до 1/2* относительно исходной скорости потока) или ~14% (исходя из продолжительности периода до момента снижения исходной скорости потока до 1/2* относительно исходной скорости потока). Улучшенное фильтрование связано с более низкой вязкостью, обеспечивающей более быстрый исходный поток, т. е. с более низким содержанием общего количества гемицеллюлозы (сумма β-глюкана + арабиноксилана), что снижает насыщение (с учетом регистрации момента) мембраны фильтра остатком фильтрата на единицу массы фильтрата (насыщение мембраны в диапазоне ~63-82 мг гемицеллюлозы).