Результат интеллектуальной деятельности: Способ иммуноферментного выявления возбудителя псевдотуберкулеза 1 серотипа на основе моноклональных антител к о-боковым цепям липополисахарида

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам обнаружения и идентификации псевдотуберкулезного микроба, в том числе выявления обсемененности бактериями Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis) эпидемиологически значимых объектов.

На территории Российской федерации порядка 93÷98% от числа выделенных штаммов Y. pseudotuberculosis относятся к I сероварианту [Псевдотуберкулез / Г.П. Сомов [и др.]. М.: Медицина, 2001. - 256 с], поэтому актуальным является разработка диагностикума, направленного на выявление возбудителя именно этого серотипа.

Традиционно для диагностики псевдотуберкулеза используется бактериологический метод, который отличается трудоемкостью и длительностью исследования материала. В литературных источниках также имеется информация о различных иммунохимических методах идентификации псевдотуберкулезного микроба.

Так, известен диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный иммуноглобулиновый, основанный на использовании иммуноглобулинов класса G, выделенных из поликлональной псевдотуберкулезной агглютинирующей сыворотки. Диагностикум предназначен для выявления антигенов Y. pseudotuberculosis в сыворотке крови больных. Набор позволяет выявлять клетки Y. pseudotuberculosis в концентрации 800 тыс.м.к./мл, при этом, по данным авторов, отсутствуют перекрестные реакции с антигенами возбудителей дизентерии, сальмонелеза основных групп и кишечного иерсиниоза [Дулатова М.В., Антонов B.C., Головачева С.Н. и др. Опыт применения иммуноглобулинового эритроцитарного препарата для ранней лабораторной диагностики псевдотуберкулеза // Журн. микробиол. - 1992. - №4. - С. 55-57]. Диагностикум не проверялся на наличие перекрестных реакций с антигенами возбудителя чумы, наиболее близкородственного с псевдотуберкулезным микробом. Также при клинических испытаниях доля неспецифических реакций составила 15%. Данный диагностикум не проходил государственной сертификации.

Известен диагностикум латексный иммуноглобулиновый жидкий производства НИИ вакцин и сывороток, г. Санкт-Петербург [Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.Н. и др. Иммуноглобулиновые латексные препараты для экспресс-диагностики иерсиниозов // Журн. микробиол. - 1993. - №6. - С.92-93]. Этот набор является сертифицированным и разрешенным к применению для выявления возбудителя псевдотуберкулеза. Диагностикум основан на применении иммуноглобулинов класса G из поликлональной агглютинирующей сыворотки, полученной к Y. pseudotuberculosis I серотипа. Препарат позволяет выявлять псевдотуберкулезный микроб в копрофильтратах путем реакции агглютинации латекса (РАЛ) на стекле. При этом диагностикуму присущи такие недостатки как невысокая чувствительность и относительно невысокая специфичность, что связано с использованием поливалентной сыворотки, а также высокая стоимость.

Известен также способ идентификации Y. pseudotuberculosis - диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклональный [патент на изобретение RU 2377308. Диагностикум псевдотуберкулезный эритроцитарный моноклониальный // Бывалов А.А., Елагин Г.Д., Печенкин Д.В. МПК С12Р 21/08, G01N 33/554. Заявка №2008120443/13, 22.05.2008. Опубл. 27.12.2009 в бюл. №36]. Данный диагностикум основан на использовании формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных моноклональными антителами (МКАт). МКАт, использованные в этом диагностикуме являются специфичными в отношении липополисахарида, выделенного из клеток Y. pseudotuberculosis серотипа I. Набор предназначен для проведения реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и позволяет выявлять клетки псевдотуберкулезного микроба в концентрации 500 тыс.м.к./мл. При этом отсутствуют перекрестные реакции с клетками Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli в концентрации 100 млн м.к./мл. Большая специфичность анализа достигается за счет применения моноклональных антител. Недостатком диагностикума является относительно невысокая воспроизводимость анализа, определяемая нестандартностью отдельных серий носителя антител - эритроцитов барана.

Также известна иммунохроматографическая моноклональная тест-система для выявления Y. pseudotuberculosis [Н.В. Богачева, Г.Д. Елагин и др. Разработка иммунохроматографической моноклональной тест-системы для выявления Yersinia pseudotuberculosis серогруппы I // Пробл. особо опасных инф. - 2016. - №2. - С. 65-68.]. В диагностикуме использованы нитроцеллюлозные мембраны с нанесенными на них моноклональными антителами, полученными к «холодовому» липополисахариду псевдотуберкулезного микроба. Полученная тест-система показала свою специфичность в отношении псевдотуберкулезного микроба серогруппы I, не выявляя Y. pseudotuberculosis II серогруппы, а также Y. pestis, Y. enterocolitica и Е. coli в концентрации 100 млн. м.к./мл. Чуствительность диагностикума находится в пределах 500 тыс.м.к./мл до 4 млн. м.к./мл. Также тест-система позволяет быстро проводить анализ, время постановки анализа составляет 15 минут. Недостатками тест-системы являются трудоемкость способа изготовления, относительно высокая себестоимость анализа и субъективность оценки результатов при концентрациях микробных клеток в образцах, близких к пороговым значениям.

Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого решения является способ, описанный в работах [Feodorova V.A., Sfmalija J.G., Devdariani Z.L. Heat-stable serogroup-specific proteins of Yersinia pseudotuberculosis // Journal of Medical Microbiology. - 2003. - Vol.52. - P. 1-7; Федорова В.А. и др. Моноклональные антитела для изучения роли антигенов белковой природы в серотипировании бактерий Yersinia pseudotuberculosis // Молекул, генетика. - 2001. - №3. - С. 28-35]. Данная методика, используемая для серотипирования Y. pseudotuberculosis, основана на использовании поликлональных и моноклональных антител к белковым эпитопам возбудителя в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа (ИФА). В процессе выполнения методики дно лунки планшета сенсибилизируют иммуногобулинами, выделенными из поликлональной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов бактериями Y. pseudotuberculosis I-VI сероваров. После стадий отмывки и блокировки лунок 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в них добавлялась суспензия бактериальных клеток в концентрации 1×10⁹ м.к./мл. Лунки отмывались, после чего проводили инкубацию с меченными пероксидазой хрена моноклональными антителами, полученными авторами. После инкубации и отмывки в лунки добавлялся субстрат, содержащий 2,2'-азинобис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты), после инкубации с которым проводили измерение оптической плотности при длине волны 405 нм. Благодаря набору моноклональных антител, взаимодействующих с белковыми эпитопами, специфичными для различных серогрупп псевдотуберкулезного микроба, возможно проведение его серотипирования, а также дифференциации Y. pseudotuberculosis от других патогенных иерсиний. Недостатком данного метода является то, что методика направлена главным образом на серотипирование возбудителя псевдотуберкулеза с использованием бактериальных суспензий с высокой концентрацией клеток (1×10⁹ м.к./мл), а не на его обнаружение и идентификацию. Сведений о чувствительности анализа авторами не представлено.

Рассмотренные тест-системы характеризуются либо невысокой чувствительностью выявления Y. pseudotuberculosis, либо высокой трудоемкостью изготовления и стоимостью одного анализа, либо относительно низкой воспроизводимостью, либо субъективностью учета результатов анализа.

Технический результат заключается в разработке иммуноферментного способа выявления возбудителя псевдотуберкулеза с высокой чувствительностью и специфичностью.

Достигается технический результат тем, что в заявляемом способе, включающем сенсибилизацию лунок планшета кроличьими поликлональными антипсевдотуберкулезными антителами, блокирование с помощью бычьего сывороточного альбумина, последовательное внесение исследуемой пробы, специфических моноклональных антител мыши, антимышиного иммунопероксидазного конъюгата, субстрата О-фенилендиамина, используют в качестве антител-сенситина иммуноглобулинов из поликлональной антисыворотки к инактивированным формальдегидом клеткам Y. pseudotuberculosis I серотипа, выращенным при температуре 10°С, а в качестве вторых антител используют моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis I серотипа.

Используемые высокоспецифичные моноклональные антитела МКАт2 к О-боковым цепям липополисахарида Y. pseudotuberculosis, полученные с использованием ранее полученной гибридомы, характеризуются стабильными антителопродуцирующими и пролиферативными свойствами [Бывалов А.А., Дудина Л.Г. и др. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №2. - С. 203-210.]. Тест-система предназначена для выявления возбудителя псевдотуберкулеза в пробах (смывы с объектов окружающей среды, копрофильтраты), предварительно прошедших «холодовое» обогащение в жидкой питательной среде на основе солянокислотного гидролизата казеина в течение 3 суток при температуре 8-12°C. Названное условие определяется психрофильностью Y. pseudotuberculosis, которая выражается в том числе резким повышением продукции О-боковых цепей липополисахарида при понижении температуры культивирования, что обеспечивает высокие чувствительность и специфичность иммуноферментного выявления возбудителя с помощью МКАт2.

Способ включает в себя:

1. Получение иммуноспецифических реагентов.

2. Постановку анализа.

1. Получение иммуноспецифических реагентов.

А. Получение асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела.

Гибридомы были получены способом, описанным в работе [Бывалов А.А., Дудина Л.Г. и др. Исследование поверхностных антигенных эпитопов Yersinia pseudotuberculosis с помощью моноклональных антител // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - №2. - С. 203-210.] и хранились до использования в жидком азоте. Культуру гибридом, продуцирующую МКАт2, вводят внутрибрюшинным способом мышам линии BALB/c в дозе 2-5 млн живых клеток на одно животное. Через 9-12 сут. у мышей с развитым асцитом после цервикальной дислокации брюшную полость промывают 5 мл фосфатного буферного раствора (ФБР), отсасывают содержимое брюшной полости, центрифугируют. Полученную надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр. Ее контролируют по показателю специфической активности в ИФА с использованием в качестве сенситина липополисахарида бактерий Y. pseudotuberculosis, выращенных при температуре 10°С. Асцитная жидкость признается кондиционной при ее титре в ИФА не ниже 1:51200.

Б. Получение поликлональной сыворотки.

В качестве первичных антител, адсорбируемых на дно лунок полистиролового планшета, использовали иммуноглобулины, выделенные из поликлональной кроличьей сыворотки. Поликлональные антитела получали путем гипериммунизации кроликов породы «Шиншилла», включающей трехкратное, с интервалом в один месяц, подкожное введение суспензии инактивированных формальдегидом бактерий Y. pseudotuberculosis I серотипа, выращенных при температуре 10°С, в нарастающих дозах: ~0.5⋅10⁹, 1.0⋅10⁹, 3.0⋅10⁹ м.к. соответственно. В качестве адъюванта использовали неполный адъювант Фрейнда. Забор крови для получения сыворотки производили через 10 суток после заключительной инъекции. Сыворотка признается кондиционной, если ее титр в ИФА, проводимом как и в контроле асцитной жидкости, не ниже 1:12800.

В. Выделение иммуноглобулинов.

К асцитной жидкости, содержащей МКАт2, добавляли насыщенный раствор сульфата аммоний в объемном соотношении 1:1. Выдерживали смесь при комнатной температуре в течение 40 минут. Образовавшийся осадок отделяли при 5000 g в течение 15 минут на центрифуге Universal 320 R (Hettich, Германия). Осадок растворяли в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7.3, в объеме, равном объему надосадочной жидкости. К полученному раствору, содержащему антитела, добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в объемном соотношении 1.5:1, выдерживали смесь при комнатной температуре в течение 40 минут. Образовавшийся осадок, содержащий иммуноглобулины, после центрифугирования (5000 g, 15 минут) ресуспендировали в ФБР. Антитела из кроличьей поликлональной сыворотки выделяли аналогичным методом.

У полученных препаратов иммуноглобулинов определяли содержание белка по Лоури и иммунохимическую активность в ИФА, используя в качестве сенситина лунок планшета препарат липополисахарида, выделенный из культуры бактерий Y. pseudotuberculosis серотипа I, выращенных при температуре 10°С.

2. Постановка анализа.

Сенсибилизацию лунок 96-луночного полистиролового планшета осуществляли 100 мкл разведенных в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9.5, поликлональных кроличьих иммуноглобулинов в концентрации 5 мкг/мл, которые выдерживали в лунках планшета в течение ночи при комнатной температуре. После инкубации лунки трижды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки (ЗФР, рН 7.3, содержащий 0.05% Твин-20), после чего вносили 250 мкл буфера для блокировки (1% БСА в буфере для разведения и отмывки). Планшет выдерживался на термошейкере при температуре 37°С и 250 встряхиваниях/мин в течение одного часа. Затем блокирующий буфер удаляли, в лунки приливали 250 мкл буфера для разведения и отмывки, выдерживали планшет 30 минут при комнатной температуре, после чего буфер удаляли.

Исследуемые образцы микробных культур разводили в буфере для разведения и отмывки. В лунки вносили по 100 мкл исследуемых образцов. На этой стадии в лунки, служащие отрицательным контролем, вносили по 100 мкл буфера для разведения и отмывки. Планшет инкубировали 1 час при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваниях/мин. После инкубации лунки четырежды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки. Затем в лунки добавляли по 100 мкл раствора иммуноглобулинов МКАт2 в разведении 1:2000 в буфере для разведения и отмывки, выдерживали в течение 1.5 часов при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваний/мин, после чего лунки четырежды отмывали 250 мкл буфера для разведения и отмывки. После этого в лунки вносили конъюгат антимышиных антител с пероксидазой хрена (Anti-Mous IgG (Fab specific) - Peroxidase antibody produced in goat, Sigma aldrich (США)), в рабочем разведении (1:2000) в буфере для разведения и отмывки, с добавлением 0.5% БСА, инкубировали 1 час при температуре 37°С на термошейкере при 250 встряхиваниях/ мин и затем четырежды отмывали описанным выше способом. В чистой стеклянной посуде готовили раствор субстрата, растворяя навеску ортофенилендиамина, требуемую для получения концентрации 0.04%, в буфере для приготовления субстрата (0.05% перекиси водорода в цитрат-фосфатном буфере, рН 4.8). В лунки вносили по 100 мкл раствора субстрата и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 50 мкл 1 н раствора серной кислоты. Измерение оптической плотности осуществляли при длине волны 492 нм. Положительным результатом для исследуемых проб считали такой, когда оптическая плотность в опытных лунках превышала таковую в лунках с отрицательным контролем не менее чем на 0.15 единиц.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующим примером.

В соответствии с изложенной выше процедурой осуществления заявляемого способа были приготовлены три серии иммуноферментной моноклональной тест-системы, результаты оценки чувствительности и специфичности которой представлены ниже.

Для определения специфичности тест-системы использовали бактерии нескольких видов энтеробактерий, включая генетически наиболее близкие псевдотуберкулезному микробу Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica. Анализ проводили описанным выше методом ИФА. Результаты представлены в таблице 1.

Представленные в таблице 1 данные, свидетельствуют о высокой специфичности ИФА на основе приготовленных серий тест-системы. Ни в одном из опытов не было зарегистрировано положительного сигнала при анализе всех бактериальных культур, взятых в концентрации 100 млн м.к./мл.

Результаты лабораторного изучения чувствительности тест-системы представлены в таблице 2.

Как видно из приведенных в таблице 2 данных, чувствительность тест-системы была не ниже 400 тыс.м.к./мл и ~1000 тыс.м.к./мл для культур, выращенных при температурах 10 и 37°С соответственно.

Таким образом, иммуноферментная тест-система, основанная на использовании моноклональных антител к О-боковым цепям липополисахарида (МКАт2) в качестве вторых антител является видоспецифической и высокочувствительной для выявления возбудителя псевдотуберкулеза.

Примечание. В качестве антигена использовали разводки суспензии клеток Y. pseudotuberculosis 1b (штамм депонирован в коллекции ФКУЗ РосНИИПЧИ «Микроб», кат. №474), выращенных на плотной питательной среде на основе БТН-агара («Биотехновация», Россия).