×
09.06.2019
219.017.7cf5

ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ

Вид РИД

Изобретение

Юридическая информация Свернуть Развернуть
Краткое описание РИД Свернуть Развернуть
Аннотация: Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для разработки средств и методов биологической защиты. Предложен штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, антигенная структура которого отлична от структуры эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и наиболее близка структуре вирусов гриппа свиней. Штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, номер депонента ГКВ-2452. Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. 5 ил.
Реферат Свернуть Развернуть

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для разработки средств и методов биологической защиты.

Истории вирусологии известен не один эпизод инфицирования людей вирусами гриппа А(H1N1), антигенно родственными штамму вируса гриппа свиней. Вирус гриппа человека, подобный вирусу гриппа свиней, вызвавший самую крупную пандемию 20 века "Испанку" (1918-1919 гг.), нанес огромные материальные и моральные потери, унеся более 50 млн человеческих жизней [1]. В январе 1976 года в военном лагере Форд-Дикс (штат Нью-Джерси, США) была зарегистрирована вспышка заболеваний более 500 человек, вызванная штаммом, близким по антигенной структуре вирусу гриппа свиньи A/Swine/Taiwan/1/75 (H1N1). Однако как эта вспышка, так и последующие после 1976 г. периодически регистрируемые единичные случаи заражения людей от свиней не привели к широкому распространению этого вируса [2, 3].

15 и 17 апреля 2009 г. специалистами Центров по контролю за заболеваемостью и профилактике (CDC&P, Атланта, США) в Мексике была расшифрована вспышка свиного гриппа A(H1N1)swl, которая привела к быстрому распространению вируса в разных странах и континентах [4-6]. На 03.06.2009 г. общее число 21267 из них 125 с летальным исходом [7, 8]. Наибольшее число заболевших было зарегистрировано в США и Мексике.

По данным Минздравсоцразвития Российской Федерации в нашей стране впервые лабораторно подтвержденный случай заболевания вирусом гриппа A(HlNl)swl был зафиксирован 21.05.2009 г. у россиянина, вернувшегося из США с признаками ОРВИ и госпитализированного в 1-ую инфекционную больницу г.Москвы. Специалисты НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН выявили РНК вируса, а затем выделили вирус из носоглоточного смыва. Вирус был идентифицирован как вирус гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, антигенно родственный вирусу гриппа свиней.

Объявление ВОЗ 11.06.2009 г. о начале новой пандемии, вызванной этой разновидностью вируса гриппа А, определило необходимость разработки средств индикации и идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиск эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl.

При диагностике гриппозной инфекции наиболее часто используют серологические и молекулярно-биологические методы. Их чувствительность зависит как от особенностей самих методов, так и от выбранного антигенсодержащего субстрата. В настоящее время для выявления эпидемических штаммов вирусов гриппа широко применяются методы изоляции вируса в культуре клеток MDCK и реже - куриных эмбрионах (КЭ) с последующей идентификацией вируса в РТГА [9]. Кроме того, разработаны тест-системы для определения РНК вирусов гриппа А и В в носоглоточных смывах методом ОТ-ПЦР (с детекцией методом электрофореза или в режиме реального времени).

Необходимым элементом при создании диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызванного им заболевания, создания эффективных средств защиты - противогриппозных вакцин, химиопрофилактических и лечебных препаратов, является наличие штамма вируса гриппа с выраженными патогенными и иммуногенными свойствами, а также обладающего высокой репродуктивностью в выбранных культурах.

Выделенный штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl не имеет аналогов в Российской Федерации. Его антигенная структура отлична от структуры эпидемических штаммов вирусов гриппа A(Н1N1) и наиболее близка антигенной структуре вирусов гриппа свиней (фиг.1).

Целью настоящего изобретения является получение штамма вируса гриппа A(H1N1)swl, антигенно родственного свиному вирусу гриппа и предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в РТГА, ИФА для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, определения РНК вируса A(H1N1)swl в ОТ-ПЦР, приготовления вакцинных штаммов, а также оценки эффективности терапии и химиопрофилактики.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований в мае 2009 г. выделен вирус гриппа A(H1N1)swl, антигенно родственный свиному, из носоглоточного смыва пациента, прибывшего из США и госпитализированного в г.Москве. Штамм A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК вируса гриппа человека A(H1N1)swl, подобного вирусу гриппа свиней с помощью ОТ-ПЦР, в конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений.

В настоящем изобретении представлены антигенные, биологические и молекулярно-генетические свойства этого вируса. Принадлежность выделенного штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl, антигенно родственного свиному вирусу гриппа, доказана методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанной в CDC&P для типирования и субтипирования вирусов гриппа свиней типа А. Идентификация вируса проведена также в РТГА с диагностической сывороткой к референс-штамму A(HswlN1) (1976 г.), приготовленной к вирусу гриппа свиней (ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", г.Санкт-Петербург). Данные были подтверждены частичным секвенированием генов, кодирующих гемагглютинин и М-белки 22.05.2009. После заражения материалом от больного культуры клеток MDCK развитие цитопатического действия с полным разрушением монослоя отмечено через 72 часа. Инфекционная активность составила 6,51g ТЦИД50 (тканевая цитопатическая инфекционная доза).

Пример выполнения

Отбор пациентов и взятие материала (носоглоточные смывы, кровь) от пациентов с отягощенным эпиданамнезом.

Изоляцию вирусов гриппа проводили из носоглоточных смывов от заболевших традиционными методами: на культуре клеток MDCK с добавлением 2 мкг/мл ТРСК-трипсина ("Sigma -Aldrich", США) и в полостях (амнион и аллантоис) 9-11 дневных КЭ. Для индикации вируса использовали 0,75% взвесь эритроцитов человека 0(1) группы крови и 0,5% эритроциты кур.

Выявление РНК вируса гриппа проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанным CDC&P для типирования и субтипирования вирусов гриппа свиней типа A.

Вирусы: A/California/04/2009 (H1N1)swl, выделенный на культуре клеток MDCK и A/California/07/2009 (H1N1)swl, выделенный на КЭ, любезно предоставлены сотрудниками CDC&P, Атланта, США; эталонный штамм гриппа свиней из Государственной коллекции вирусов - А/свинья/Висконсин/67(H1N1).

Сыворотки. Использованы специфические сыворотки к эпидемическим эталонным штаммам вирусов гриппа - A(H1N1), A(H3N2), В/Флорида/4/2006 (линии В/Ямагата-подобных), В/Малайзия/2506/2004 (В/Виктория-подобных) из диагностического набора ВОЗ, а также к вирусу гриппа свиней (1976 г.) - A(HswlN1) (ООО "Предприятие по производству диагностических препаратов", г.Санкт-Петербург). Перед постановкой РТГА для удаления неспецифических ингибиторов сыворотки обработаны ферментом - нейраминидазой нехолерных вибрионов (RDE, Япония) и прогреты при 37°C в течение 30 минут.

Типирование изолятов проводили в РТГА по общепринятой методике с диагностическими сыворотками к сезонным вирусам гриппа A и B и сывороткой к вирусу гриппа A(HswlN1), а также постановкой ОТ-ПЦР в реальном времени, что позволило субтипировать вирусы гриппа А и дифференцировать новый вирус гриппа свиней A(H1N1).

Секвенирование генома. Выделение РНК проводили стандартным методом с применением фенола и изотиоционата натрия. Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов ПЦР проводили методом Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя. Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакета прикладных программ Lasergene(«DNASTAR Inc.», США).

Определение инфекционных титров вируса проводили заражение культуры клеток MDCK и 9-дневных куриных эмбрионов 10-кратными разведениями вируса, с последующим инкубированием при 37°C в течение 48-72 часов. После постановки реакции гемагглютинации проводили расчет инфекционных титров по методу Рида и Менча, определяя эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД50) и ТЦИД50.

Изучение чувствительности вируса к химиопрепаратам проводили инфицированием монослоя культуры клеток MDCK 96-луночных панелей в присутствии/отсутствии таких препаратов, как ремантадин, арбидол, рибавирин (в концентрациях - 1,25-20 мкг/мл) и ингавирин (50,0-500,0 мкг/мл) в течение 24 часов, с последующим учетом результатов постановкой ИФА (1). Чувствительность к озельтамивиру определяли при анализе нуклеотидной последовательности гена нейраминидазы вируса (NA) в положении 274.

Родословная штамма представлена на схеме (фиг.2).

Число пассажей к моменту паспортизации - 1.

Характеристика штамма A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl

A. Особенностями выделенного штамма являются:

i) различия в антигенных свойствах поверхностных белков от других эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1);

ii) изоляция вирусов через 72 часа против стандартных 48 часов для вирусов гриппа этого подтипа;

iii) одинаковое взаимодействие с эритроцитами человека и кур в реакции гемагглютинации(РГА), в отличие от большинства современных эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) [10];

iiii) возможность перехода вируса, первично изолированного на культуре клеток MDCK, на куриные эмбрионы, инфекционный титр через 72 часа после инфицирования составил 5,5 lg ЭИД50. Большинство современных штаммов вируса гриппа А не обладают такой способностью [10].

Б. Для полученного штамма характерно:

1. высокая способность продуцироваться как в культуре клеток MDCK, так и в КЭ: выделен в культуре клеток MDCK и/или из амниотической полости 9-10-дневных куриных эмбрионах (КЭ) через 72 часа при 37°C после заражения. Изолированные вирусы характеризовались титром 1:8-1:16 AE. Инфекционный титр в КЭ через 72 часа составил 7,0 lg ЭИД50, а в MDCK - через 48 часов составлял 6,5 lg ТЦИД50;

2. термолабильность гемагглютинина при нагревании в течение 1 часа при 56°C;

3. при типировании гемагглютинирующего изолята в РТГА установлено, что диагностическая сыворотка A(HswlN1), приготовленная к вирусу гриппа свиней (1976 г.) - A(HswlN1) ингибировала гемагглютинирующую активность изолята до титра 1:80 при отсутствии взаимодействия со специфическими сыворотками к сезонным вирусам гриппа A и B. При этом гомологичные титры составляли 1:320-1:10240 (фиг.1);

4. отсутствие патогенности в модельных опытах: не вызывает гибели белых крыс при подкожном, внутримышечном, внутрибрюшинном способе введения;

5. контроль контаминации: штамм не контаминирован микрофлорой, грибами, посторонними вирусами;

6. способ лиофилизации, стандартный для вирусов гриппа. Культуральную или эмбриональную вируссодержащую жидкость в условия вакуума (1-5 мкм) замораживают при -70°C в течении 4-6 часов, затем температуру повышают до 20°C, далее следует досушивание в течении 10-16 часов, закупорка флаконов и облицовка алюминиевыми колпачками. После лиофилизации вирус сохранял свою антигенную и инфекционную активность.

В. Иммуногенные свойства штамма: гомологичный титр иммунной сыворотки, полученной на крысах, составляет 1:160 (фиг 3). Антитела сыворотки взаимодействовали с пандемическими вариантами A(H1N1)swl, изолированными ранее в США, а также позднее в России. Взаимодействие антител со штаммом А/свинья/Висконсин/1/79 составило 1/16 гомологичного титра сыворотки, что свидетельствует о значительных различиях в гемагглютининах вируса гриппа свиней и вирусов гриппа человека A(H1N1)swl.

Г. Чувствительность штамма к этиотропным лечебным препаратам:

выявлена его резистентность к ремантадину, высокая чувствительность к озельтамивиру, арбидолу и рибавирину, при средней активности - к ингавирину (фиг.4). Аналогичные данные получены в отношении референс-штаммов A(H1N1)swl, выделенных от людей - A/California/04/2009 и A/California/07/2009 и изолированного от свиньи - А/свинья/Висконсин/67.

Д. Секвенирование полного генома вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl выявило аминокислотные замены в вирионных белках, отличающие штаммы A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl, A/New York/3205/2009 и A/California/04/2009 (H1N1) (фиг.5). В белках Ml, М2 и РВ2 аминокислотных замен при сравнении со штаммом A/California/04/2009(H1N1) не обнаружено. Из анализа первичной последовательности генов московского штамма однозначно следует его большее родство со штаммом, изолированным в Нью-Йорке, по сравнению с Калифорнийским штаммом вируса. Уникальной заменой только для штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl и не обнаруженной ни у одного другого опубликованного в GenBank к настоящему времени штамма, можно считать значащую замену в NA-гене кодона GAC на GGC, что привело к замене Asp на Gly в позиции 451.

Штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl депонирован 24 мая 2009 г. в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им Д.И.Ивановского РАМН, номер депонента ГКВ-2452. Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)swl (ГКВ №2452), впервые изолированный на территории РФ, получен заражением культуры клеток MDCK биологическим материалом от больного с признаками гриппозной инфекции, не типичной для сезонного гриппа, его антигенная структура отлична от структуры эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1) и наиболее близка антигенной структуре вирусов гриппа свиней, характеризуется высокой способностью репродуцироваться в культуре клеток MDCK и куриных эмбрионах, пригоден для получения диагностических и вакцинных препаратов, оценки противовирусной активности различных препаратов и новых соединений. Штамм может быть использован в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах для специфического выявления: РНК вируса гриппа человека, подобного вирусу гриппа свиней A(H1N1) - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), антител к нему - в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и иммуноферментном анализе (ИФА), а также для разработки и создания средств защиты и лечения населения.

Литература

1. Taubenberger J.K., Reid А.Н., Kraft А.Е. et al. Initial genetic characterization of the 1918 "Spanish influenza virus". // Science. - 1997. - V.275. - P.1793-1796.

2. Patriarca P.A., Kendal A.P., Zakowsky P.C. et al. Lack of significant person-to-person spread of swine influenza-like virus following fatal infection in an immunocompromised chold. // Am. J.Epidem. - 1984. V.119. - N.2. - P.152-158.

3. Schulze I.T., Fitch W.M., Ludwig S. et al. Evolution of pig influenza viruses. // Virology. - 1991. - V.183. - P.61-73.

4. Shinde V., Bridges C.B., Uyeki T.M. et al. Triple reassortants swine influenza A(H1) in humans in the United States, 2005-2009. // N.Engl.J.Med. - 2009. - 361. - DOI:10.1056/NE J.Moa093812.

5. Update: Swine A(H1N1) infection in two children - southern California. March-April 2009. // CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR). - 2009. - Vol.58. - N.17. - P.400-402.

6. Update: Novel influenza A(H1N1) virus infections - worldwide, May 6, 2009. // CDC. Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR). - 2009. - Vol.58. - N.17. - P.453-457.

7. http://www.who.int/csr/disease/swinefluenza/index.html

8. Jordan H., Mosquera M., Nair H., France A. Swine origin influenza A(H1N1) virus infection in a school - New York City, April 2009. // http://www.cdc.gov.mmwr.preview/mmwrhtml/mm58d0430al.htm

9. Бурцева Е.И., Шевченко Е.С., Ленева И.А. и др. Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 гг. // Вопр. вирусол. - 2007. - N.2. - С.24-29.

10. Иванова В.Т., Матюшина P.O., Слепушкин А.Н. и др. Эпидемические штаммы вирусов гриппа A и B в сезоне 2005-2006 гг. в России. // Вопр. вирусол. - 2008. - №4. - С.13-18.

Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)swl (ГКВ №2452), содержащий Gly (GAC-GGC) в 451 позиции молекулы нейраминидазы, предназначенный для приготовления на его основе диагностических тест-систем, а также для разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.
Источник поступления информации: Роспатент

Showing 1-10 of 22 items.
20.07.2013
№216.012.5738

Штамм вируса гриппа a/iiv-anadyr/177-ma/2009 (h1n1) pdm09, адаптированный к тканям легких лабораторных мышей

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса гриппа. Предложен штамм вируса гриппа A/IIV-Anadyr/177-ma/2009 (H1N1) pdm09, адаптированный к тканям легких лабораторных мышей. Штамм получен путем многократного пассирования родительского штамма A/IIV-Anadyr/177/2009 (H1N1)...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002487936
Дата охранного документа: 20.07.2013
27.10.2013
№216.012.7882

Способ лечения вирусного гепатита с

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть использована для лечения вирусного гепатита C. Для этого пациенту вводят эффективное количество глутарилгистамина или его фармацевтически приемлемой соли. Данное средство может также вводиться в комбинации с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002496512
Дата охранного документа: 27.10.2013
27.07.2014
№216.012.e43a

Пептидные производные 1-(1-адамантил)этиламина и их противовирусное действие

Изобретение относится к новым биологически активным производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина), представляющим собой адамантил-пептиды, обладающие противовирусным действием. Полученные новые малотоксичные соединения обладают избирательной противовирусной активностью в отношении ВГС....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002524216
Дата охранного документа: 27.07.2014
20.08.2014
№216.012.ebd3

Средство для снижения репродукции вируса гепатита с

Изобретение относится к противовирусным средствам и представляет собой средство для снижения репродукции вируса гепатита С, содержащее хотя бы один полипренилфосфат или полипренилпирофосфат с количеством изопреновых звеньев от 9 до 20, преимущественно - от 13 до 18, либо смесь различных...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002526179
Дата охранного документа: 20.08.2014
20.02.2015
№216.013.2aa8

Способ лечения коклюша у детей в возрасте до трех лет

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, и может быть использовано для лечения коклюшной инфекции у детей до трех лет. Для этого на фоне общепринятой комплексной терапии в виде противокашлевых препаратов и препаратов, восстанавливающих бронхолегочную проходимость,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002542377
Дата охранного документа: 20.02.2015
20.02.2015
№216.013.2b0a

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита с в реакции агломерации объемной (рао)

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО). Благодаря повышению специфичности реакции и уменьшению сроков исследования крови изобретение может быть успешно использовано в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002542475
Дата охранного документа: 20.02.2015
20.06.2015
№216.013.57bd

Производное 1,3-адамантандиуксусной кислоты и его противовирусная активность

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, конкретно к новому производному 1,3-адамантандиуксусной кислоты с аминокислотным остатком этилового эфира треонина указанной ниже формулы. Данное соединение обладает избирательной противовирусной активностью в отношении вируса...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002553991
Дата охранного документа: 20.06.2015
27.11.2015
№216.013.9403

Сорбент, представляющий собой наноалмазный материал (варианты), способы получения и использования.

Группа изобретений относится к сорбентам на основе наноалмазов, которые могут быть использованы для иммобилизации или удаления вирусов, специфических антител, иммуносорбции, в диагностических целях, для дезактивации и удаления вирусов из внешней среды. Сорбенты из наноалмазсодержащих материалов...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002569510
Дата охранного документа: 27.11.2015
27.12.2016
№216.013.9e18

Производные 1-(1-адамантил)этиламин-n-ациламинокислот и их противогриппозная активность

Изобретение относится к новым аминокислотным производным 1-(1-адамантил)этиламина указанной ниже общей формулы, а именно к соединениям 1-3, в которых , (соединение 1); R1=Н, (соединение 2) и , (соединение 3). Предлагаемые соединения обладают избирательной противовирусной активностью в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002572102
Дата охранного документа: 27.12.2015
25.08.2017
№217.015.c221

Адамантиламиды серосодержащих кислот и их противогриппозная активность

Изобретение относится к новым синтетическим соединениям, а именно 1-(1-адамантил)этиламиду-3-(2-тиэнил)-пропеновой кислоты (TEPr-Rem), 1-адамантаиламиду-3-(2-тиэнил)-пропеновой кислоты (TEPr-Amt) и 1-(1-адамантил)этиламиду-4-(2-тиэнил)-бутановой кислоты (TEBu-Rem): Предложенные соединения:...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002617850
Дата охранного документа: 28.04.2017
+ добавить свой РИД