ЛАЗЕРНЫЙ ДОПЛЕРОВСКИЙ АНАЛИЗАТОР

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано в доплеровской анемометрии для определения скорости, перемещения и размеров частиц, взвешенных в жидкой или газообразной пробе. Наиболее эффективно его использовать при определении электрофоретической подвижности молекул и частиц в микропробе (здесь и далее под микропробой понимается микро- и нанообъемная проба).

Известен лазерный доплеровский анализатор подвижностей и коэффициентов диффузии макромолекул в растворе, состоящий из кюветы с анализируемой пробой, оснащенной электродной системой для создания электрического поля, оптически согласованных лазерного источника монохроматического электромагнитного излучения, падающего на макромолекулы, и фотоприемного устройства, выход которого связан с входом блока обработки и регистрации доплеровского сигнала, характеризуемого изменением спектральных характеристик рассеянного пробой лазерного излучения по отношению к исходному излучению (US 3870612, G01N 27/447, В01К 5/00, 1975).

Однако данное устройство обладает низкой точностью в связи с нестабильностью и невозможностью регулирования опорного сигнала, в качестве которого здесь используется лазерное излучение, рассеянное и отраженное стенками кюветы.

Известен также лазерный доплеровский анализатор, содержащий оптически согласованные лазер, цилиндрический объектив, поляризационный расщепитель лазерного излучения на опорный и зондирующий пучки, блок транспортных линз, блок сведения и фокусирования указанных пучков излучения в окрестности анализируемого объекта и фотоприемное устройство, подключенное к блоку измерения скорости перемещения анализируемого объекта (SU 529660, G01P 3/36, 1979; RU 2144194, G01P 3/36, 2000).

Для определения электрофоретической подвижности частиц, несущих поверхностный заряд, анализируемая проба помещена в кювету с плоскопараллельными стенками, выполненными из оптически прозрачных пластин на основе индия, к которым приложено электрическое напряжение. При этом опорный пучок света направлен через пробу параллельно указанным пластинам, а зондирующее освещение сформировано в виде двух пучков, отраженных от стенок трехгранной призмы (GB 2194112, С25В 7/00, G01S 17/88//17/58, 1988; JP 63045553, G01N 27/447//27/26, G02F 1/19, 1988).

Недостаток данных анализаторов заключается в низкой точности контроля потоков жидкостей и газов, а также невозможности определения размера движущихся в них частиц.

Наиболее близким к заявляемому является лазерный доплеровский анализатор, содержащий оптически согласованные лазерный источник линейно-поляризованного излучения, светоделитель для формирования зондирующего и опорного пучков излучения, блок сведения и фокусирования данных пучков излучения и фотоприемное устройство, выход которого связан с входом блока обработки и регистрации доплеровского сигнала. Для возможности анализа удаленных объектов анализатор дополнительно содержит аналогично выполненный дополнительный канал измерений, причем длина волны излучения лазерного источника в одном из указанных каналов совпадает с максимумом, а во втором - с ближайшим минимумом поглощения исследуемого объекта. При этом блок обработки и регистрации доплеровского сигнала выполнен дифференциальным для сравнения отсчетов в данных каналах (RU 2227303, G01P 3/36, G01S 17/00, 2004).

Однако прототип не позволяет анализировать размеры и скорость движения частиц в микропробе.

Техническая задача предлагаемого анализатора заключается в определении размеров и скоростей движения частиц в микропробе. Дополнительная техническая задача заключается в обеспечении высокой точности и разрешающей способности измерений.

Решение указанной технической задачи состоит в том, что в конструкцию лазерного доплеровского анализатора, содержащего оптически согласованные лазерный источник линейно-поляризованного излучения, светоделитель для формирования зондирующего и опорного пучков излучения, блок сведения и фокусирования данных пучков излучения и фотоприемное устройство, выход которого связан с входом блока обработки и регистрации доплеровского сигнала, вносятся следующие изменения:

а) блок сведения и фокусирования зондирующего и опорного пучков излучения включает оптически согласованные объектив и капилляр, выполненный на базе микрочипа и подключенный к магистралям подачи и отвода анализируемой пробы;

б) на магистрали отвода и/или подачи анализируемой пробы установлен фильтр с размером пор от 0,2 до 1,2 мкм;

в) на входе блока обработки и регистрации доплеровского сигнала установлен аналого-цифровой преобразователь (АЦП);

г) блок сведения и фокусирования зондирующего и опорного пучков выполнен с образованием угла сведения из расчета:

где α - угол сведения зондирующего и опорного пучков света;

d - диаметр светового пучка лазерного источника излучения, см;

F - фокусное расстояние объектива блока сведения и фокусирования зондирующего и опорного пучков излучения, см;

f - частота дискретизации аналого-цифрового преобразователя, Гц;

λ - длина волны лазерного источника излучения, см;

n - показатель преломления анализируемой пробы;

ν_max - максимальное значение скорости частиц в пробе, см/с.

Причинно-следственная связь внесенных изменений с достигнутым техническим результатом заключается в следующем.

1. Микрочипное выполнение капилляра для помещения пробы обеспечивает не только анализ микро- и даже нанообъема анализируемой взвеси, но и позволяет повысить напряженность электрического поля при оснащении капилляра электродной системой для проведения электрофореза с целью увеличения скорости движения взвешенных частиц. Это имеет следствием повышение точности и разрешающей способности анализатора (при макроисполнении элемента для помещения пробы приложение сопоставимых напряжений сопровождается резким увеличением тока, протекающего через пробу, что недопустимо).

2. Установленный на магистрали подачи анализируемой пробы фильтр имеет целью освобождение пробы от крупных примесей, наличие которых вносило методическую погрешность в измерения. В варианте с установкой второго фильтра (на магистрали отвода пробы) достигается возможность измерений в условиях инвертирования направления прокачки.

3. Оснащение блока обработки и регистрации доплеровского сигнала АЦП позволяет использовать компьютер в составе указанного блока. Вместе с тем, в предлагаемом анализаторе АЦП позволяет также упростить настройку устройства, поскольку частота АЦП является параметром, учитываемым при определении угла сведения световых потоков, рассчитываемого по формуле (1).

4. Диапазон возможных значений угла α сведения световых потоков, рассчитываемых по формуле (1), установлен теоретически и подтвержден экспериментально тем, что при значении угла α, меньшем, чем нижний предел, часть зондирующего излучения будет попадать на фотоприемник, внося существенную погрешность в измерения, а при превышении углом α верхнего предела искажается информационный сигнал доплеровского сдвига, что также приводит к резкому повышению погрешности измерений (проиллюстрировано далее).

При техническом осуществлении анализатора в качестве светоделителя может использоваться прозрачная пластина, рабочая поверхность которой расположена под тупым углом к оптической оси лазерного источника линейно-поляризованного излучения, при этом на тыльную поверхность данной пластины нанесено зеркальное покрытие, а на образованной светоделителем магистрали опорного излучения установлен ослабитель светового потока для регулирования соотношения интенсивностей опорного и зондирующего световых потоков.

Для проведения электрофореза анализируемой пробы капилляр оснащен электродной системой.

На фиг.1 дана блок-схема анализатора; на фиг.2 приведен доплеровский спектр сыворотки крови; в табл.1 и 2 даны метрологические характеристики анализатора при различных значениях параметров конструкции.

Анализатор (фиг.1) содержит оптически согласованные лазерный источник 1 линейно-поляризованного излучения типа МЛН 3-660-025СД (изготовитель - Белорусское ОМО «ЛЭМП») длиной волны 660 нм и фокусным расстоянием 7 мм, светоделитель 2 для формирования зондирующего (а) и опорного (б) пучков излучения, блок 3 сведения и фокусирования данных пучков излучения и фотоприемное устройство 4, выход которого связан с входом блока 5 обработки и регистрации доплеровского сигнала. Блок 3 сведения и фокусирования зондирующего а и опорного б пучков излучения включает оптически согласованные объектив 6 и капилляр 7, выполненный на базе микрочипа и подключенный к магистралям подачи и отвода анализируемой пробы (поз.8 и 9 соответственно). На магистралях 8 и 9 подачи и отвода анализируемой пробы установлены политетрафторэтиленовые фильтры 10 и 11 с размером пор 0,2 мкм. Блок 5 обработки и регистрации доплеровского сигнала включает АЦП 12, вход которого связан с выходом фотоприемного устройства 4. Выход АЦП 12 подключен к входу компьютера 13.

Особенности выполнения данного варианта анализатора

1. Капилляр 7 оснащен электродами 14 и 15, выполненными из пористого углерод-углеродного композита с размером пор 2 мкм и установленными на расстоянии 1 см. Объем пробы в капилляре - 20 нл.

2. Светоделитель 2 представляет собой пластину 16, выполненную из оптического стекла Крон-8 толщиной 6 мм, рабочая поверхность которой расположена под тупым углом 135° к оптической оси лазерного источника 1 линейно-поляризованного излучения. На тыльную поверхность пластины 16 нанесено зеркальное покрытие 17, а на образованной светоделителем магистрали 6 опорного излучения установлен ослабитель 18 светового потока, представляющий собой стеклянную пластину, на поверхность которой нанесена полупрозрачная пленка платины (в комплект анализатора входят несколько пластин с различной толщиной пленки платины для регулирования соотношения интенсивностей опорного и зондирующего световых потоков). Для настройки угла сведения опорного и зондирующего световых потоков целесообразно располагать комплектом пластин 16 различной толщины.

3. Фотоприемное устройство 4 выполнено на основе кремниевого фотодиода, при этом на входе данного устройства установлена апертурная диафрагма 19 (необязательный элемент) для надежного исключения его внешней засветки. Ту же цель преследует установка апертурной диафрагмы 20 между объективом 6 и капилляром 7.

4. После сведения пучков в точке О капилляра 7 на магистрали зондирующего пуска а установлена фотокамера 21 (необязательный элемент), с помощью которой удобно юстировать оптические узлы анализатора.

5. Блок 3 сведения и фокусирования зондирующего и опорного пучков выполнен с образованием угла сведения α из расчета согласно формуле (1). В данном примере d=0,45 см; F=5,0 см; f=6600 Гц; λ=6,6·10^-5 см; n=1,33; ν_max=1,0 см/с.

Согласно формуле (1), минимальное значение угла α составляет

a максимальное значение этого угла составляет

Исходя из результатов расчета, конструкция анализатора выполнена с α=6°. Установку требуемого значения угла α в данном варианте исполнения производят выбором толщины пластины 16 из комплекта, входящего в состав прибора, под контролем фотокамеры 21, подключаемой при юстировке его оптической системы.

Пучок поляризованного излучения лазера 1 разбивается светоделительной пластинкой 16 с зеркалом 17 на два пучка - зондирующий а и опорный б. Эти пучки сводятся и фокусируются с помощью объектива 6 в центре капилляра 7. Зондирующий пучок а рассеивается на частицах пробы, находящейся в капилляре 7, а опорный пучок 6 выполняет функцию гетеродина выделения доплеровского сигнала в детектируемом пучке рассеянного света. Поэтому на фотоприемное устройство 4 поступает оптический сигнал, несущий доплеровскую информацию, которая, будучи преобразованной фотоприемным устройством 4 в аналоговый электрический сигнал, поступает на АЦП 12 и далее на компьютер 13.

Обработка сигнала компьютером 13 может быть произведена с использованием одной из известных математических зависимостей, связывающих размеры частиц или коэффициент диффузии, а также и скорость их перемещения или электрофоретическую подвижность со спектральной плотностью доплеровского сигнала, снятого с выхода фотоприемного устройства 4. В настоящем примере математическая обработка доплеровского сигнала выполняется с учетом известной формулы (B.J.Berne, R.Pecora, Dynamic Light Scattering with Applications to Chemistry, Biology and Physics, Dover Publication, Inc, N.Y., 2000, p.74):

где S(ω) - нормированная спектральная плотность доплеровского сигнала;

D - коэффициент диффузии частиц, см²·с^-1;

ω - круговая частота доплеровского сигнала, с^-1;

q - модуль волнового вектора рассеяния, см^-1;

Δω - доплеровский сдвиг, с^-1.

Доплеровский сдвиг Δω вычисляют относительно положения максимума функции S(ω).

Из формулы (2) можно определить зависимости скорости ν и размеров (радиуса) r частиц с учетом (Спектроскопия оптического смешения и корреляции фотонов. Под ред. Г.Камминса и Э.Пайка, М.: Мир, 1978, с.297) в явном виде, а именно:

где ν - скорость частиц, см·с^-1;

φ - угол между волновым вектором рассеяния и направлением скорости частиц;

r - радиус частиц, см;

k - постоянная Больцмана, эрг·К^-1;

Т - температура анализируемой пробы, К.

η - вязкость анализируемой пробы, Пз.

Результаты работы анализатора проиллюстрированы на фиг.2 доплеровским спектром S(ω) ЭФП белковых фракций сыворотки крови человека. Кривая 1 фиг.1 соответствует стационарному состоянию диффузии белков в отсутствие электрического поля. Кривая 2 представляет собой доплеровскую характеристику электрофоретической миграции фракций в капилляре при напряженности 1000 В·см^-1 внешнего электрического поля, приложенного путем подачи напряжения 1000 В между электродами 14 и 15. Диапазон величин доплеровского сдвига составляет от 0 до 1300 Гц. Уширение спектральных полос фракций (разность между верхней и нижней частотами полосы, занимаемой фракцией) составляет от 20 до 70 Гц. Длительность анализа в данном примере - менее 10 с.

Как видно из кривой 2, разрешающая способность измерений характеризуется наличием на кривой 10 пиков, что позволило компьютеру 13 по формулам (3) и (4) рассчитать значения распределения размеров и электрофоретической подвижности фракций, которые в настоящем примере составляют: размер - от 40 до 150 кДа; ЭФП - (2÷6)·10^-5 м²/В·с. Эти результаты свидетельствуют о высокой точности и разрешающей способности измерений, что достигнуто за счет перехода измерений на микроуровень, что обеспечивает возможность работы в условиях высокой напряженности электрического поля. Кроме того, в микрокапилляре при электроосмотическом движении пробы отсутствуют мениски, искажающие результаты измерений.

Результаты определения размеров и ЭФП белков, содержащихся в экстракте гомогенизата печени крысы в фосфатном буферном растворе, при различных материалах (ацетатцеллюлоза, политетра-фторэтилен, лавсан, полиамид, поливинилхлорид, фоторезист) и размерах пор (от 0,1 до 10 мкм) фильтра 10 приведены в табл.1. Как видно из табл.1, при размерах пор фильтра 10 от 0,2 до 1,2 мкм коэффициент вариации измерений размеров наночастиц лежит в пределах от 0,23 до 0,40, независимо от материала фильтра. При больших размерах пор (1,5; 3 и 10 мкм, а также в отсутствие фильтра) вариация измерений размера частиц возрастает, находясь в пределах от 0,58 до 0,76. При использовании фильтра с размером пор 0,1 мкм измерения невозможны из-за пузырения, высокого гидравлического сопротивления, а также отфильтровывания значимых фракций пробы. Еще резче необходимый размер пор просматривается в отношении вариации ЭФП, а именно при размерах пор фильтра в пределах от 0,2 до 1,2 мкм коэффициент вариации ЭФП составляет от 0,21 до 0,37, независимо от материала фильтра. При больших размерах пор, вплоть до отсутствия фильтра, этот коэффициент лежит в пределах от 0,42 до 0,65.

В табл.2 приведены значения коэффициента вариации измерений размеров и ЭФП наночастиц полистирольного латекса и человеческого гамма-глобулина при различных значениях угла α сведения опорного и зондирующего излучений. Как видно из таблицы, при значениях угла α, лежащих в диапазоне, установленном формулой (1), вариация измерений размеров частиц составляет 0,26÷0,48, а вариация ЭФП - 0,24÷0,58. При нижних запредельных значениях α≅0,5α_min измерения невозможны из-за засветки фотоприемного устройства зондирующим пучком. При верхних запредельных значениях α≅1,5α_max вариация измерений размеров частиц возрастает до 0,57÷0,75, а вариация ЭФП - до 0,63÷0,75.

Таким образом, как пояснено приведенными примерами, использование предлагаемого технического решения обеспечивает возможность определения размеров и скоростей движения частиц в микропробе с высокими точностью и разрешающей способностью измерений.