СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСЕЙ, ИМИТИРУЮЩИХ НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОЛОГИЧЕСКУЮ МОЧУ ЧЕЛОВЕКА, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ОБУЧЕНИЯ СТУДЕНТОВ ГЛЮКОЗООКСИДАЗНОМУ МЕТОДУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к биомедицине, а именно к медицинскому и биологическому образованию, и может быть использовано как компонент учебных симуляционных технологий для приобретения и закрепления умений и навыков по освоению глюкозооксидазного метода количественного определения глюкозы в биологических жидкостях (моче) на лабораторных занятиях у студентов вузов и колледжей.

Учебная программа медицинских и биологических специальностей вузов и колледжей, утвержденная Министерством здравоохранения РФ и Министерством науки и высшего образования РФ, включает разделы, посвященные работе с биологическими жидкостями человека. В настоящее время эпидемиологическая ситуация в нашей стране и других странах мира, в связи с резким увеличением количества носителей и больных гепатитом, СПИДом, другими вирусными и бактериальными инфекциями, требует возрастного ограничения и лицензирования групп медицинского персонала, допущенных к работе с образцами биологических жидкостей человека (например, Постановление Правительства РФ от 26.01.2010 г. №29 (ред. от 04.09.2012 г. №882) «Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии» [1]). Кроме того, обеспечение безопасных условий труда и проведения учебных занятий в химических лабораториях и при работе с химическими веществами в высших и средних специальных учебных заведениях предполагает строгое соответствие установленным нормам санитарно-эпидемиологического контроля (например, ГОСТ 12.4.113-82. «Система стандартов безопасности труда. Работы учебные лабораторные. Общие требования безопасности» (утв. Постановлением Госстандарта СССР от 25.06.1982 г. №2525 [2] или действующий Приказ Гособразования СССР от 13.10.1989 г. №789 «О введении в действие Правил безопасной работы с химическими веществами в высших и средних специальных учебных заведениях, на предприятиях и в учреждениях системы Гособразования СССР» [3]).

В связи с этим, использование образцов настоящих биологических жидкостей человека, в том числе мочи, в учебном процессе нецелесообразно, что существенно ограничивает приобретение студентами медицинских и биологических специальностей вузов и колледжей практических умений и навыков, в частности, по определению количественного уровня глюкозы, мочевины, мочевой кислоты, креатинина и других компонентов нормальной и патологической мочи пациентов. Подобный подход также ограничивает педагогическую перспективу формирования профессиональной компетентности будущего врача и специалиста-биолога.

Прототипом, а также методом наиболее близким по технической сути предлагаемому нами способу послужил стандартный глюкозооксидазный метод определения глюкозы в биологических жидкостях, в котором для определения уровня глюкозы используются настоящие кровь, сыворотка или моча человека [4-6]. Моча человека представляет собой водный раствор солей, содержащий хлориды, фосфаты, сульфаты, бикарбонаты, а также другие более сложные органические соединения (мочевина, мочевая кислота, креатинин, некоторые гормоны и др.). Из солей в наибольшей концентрации в моче представлены NaCl, KCl, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, то есть компоненты стандартного нартий-фосфатного буфера, осмолярность и концентрации ионов в растворе которого соответствуют концентрациям в теле человека, оптимальное значение рН 6,0-7,0. Принцип глюкозооксидазного метода заключается в том, что глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы кислородом воздуха до глюкуроновой кислоты с образованием эквимолярного количества пероксида водорода, который под действием пероксидазы способствует окислительному азосочетанию 4-аминоантипирина и фенола (или его производных) до хинонимина, окрашенного в розово-малиновый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Метод является высокоспецифичным для глюкозы и дает надежные количественные результаты по ее содержанию в крови, моче и других биологических жидкостях.

Недостатком данного метода, который имеет важное значение при использовании стандартных диагностических реакций в учебном процессе, являются дорогостоящие и небезопасные образцы настоящих биологических жидкостей человека. Кроме того, не всегда нужный биологический образец имеется в наличии, особенно это касается образцов пациентов с гиперглюкоземией и глюкозурией. Вместе с тем, использование данного метода применительно к моче с кислым значением рН 4,5-5,5 занижает концентрацию глюкозы за счет ингибирования активности ферментов, что приводит к искажению результатов. Использование искусственно созданного имитатора мочи полностью устранит перечисленные недостатки.

Техническим результатом предлагаемого способа является его многократное и самостоятельное воспроизведение обучающимися за счет безопасности, простоты, воспроизводимости, однозначности интерпретации, низкой стоимости, что позволит развить уверенность при формировании профессиональной компетентности будущего врача и специалиста-биолога. Точность воспроизведения результатов предлагаемого имитационного способа не отличается от стандартного метода с использованием настоящих биологических жидкостей и составляет 100%.

Технический результат данного способа достигается получением смесей, имитирующих мочу человека, используемых для обучения студентов глюкозооксидазному методу количественного определения глюкозы в биологических жидкостях, включающий этапы приготовления имитаторов нормальной и патологической мочи человека, где в качестве основы смесей используют натрий-фосфатный буфер (рН 6,0-7,0), в обе смеси имитаторов нормальной и патологической мочи добавляют 1% раствор титанового желтого таким образом, чтобы цвет имитаторов был аналогичен цвету нормальной мочи, в имитатор патологической мочи дополнительно вносят порошок глюкозы (декстрозы) до концентрации 0,5-2,0% (28-112 ммоль/л) от объема имитирующей мочу смеси.

Алгоритм этапов предлагаемого способа аналогичен алгоритму стандартных тестов [4-6], так же как и визуально диагностируемый оценочный результат:

1 этап - приготовление имитатора нормальной мочи человека. Имитатором образца нормальной мочи человека является натрий-фосфатный буфер (рН 6,0-7,0), подкрашенный 1% раствором титанового желтого до цвета, аналогичного нормальной моче, без добавления порошка глюкозы (декстрозы). Натрий-фосфатный буфер готовят согласно стандартной методике: 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ растворяют в 800 мл дистиллированной воды, доводят рН до 6,0-7,0 35% НС1 или 40% NaOH, добавляют дистиллированной воды до 1 литра [7] или с помощью коммерчески доступных таблетированных (или порошковых) препаратов компаний Applichem (Германия) или Amresco (США). Таблетки (или порошок) разводят дистиллированной водой до заданного объема и получают раствор заданной концентрации. Кислотность (рН) имитатора мочи корректируется с обязательной регистрацией на рН метре.

2 этап - приготовление имитатора патологической мочи человека. Имитатором образца патологической мочи человека является натрий-фосфатный буфер (рН 6,0-7,0), подкрашенный 1% раствором титанового желтого до цвета, аналогичного нормальной моче, с добавлением порошка глюкозы (декстрозы) до 0,5-2,0% (28-112 ммоль/л) от объема имитирующей мочу смеси. Натрий-фосфатный буфер готовят согласно стандартной методике: 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ растворяют в 800 мл дистиллированной воды, доводят рН до 6,0-7,0 35% HCl или 40% NaOH, добавляют дистиллированной воды до 1 литра [7] или с помощью коммерчески доступных таблетированных (или порошковых) препаратов компаний Applichem (Германия) или Amresco (США). Таблетки (или порошок) разводят дистиллированной водой до заданного объема и получают раствор заданной концентрации. Кислотность (рН) имитатора мочи корректируется с обязательной регистрацией на рН метре.

3 этап - приготовление комплекта набора реагентов для определения уровня глюкозы в моче глюкозооксидазным методом. Наиболее простым способом является использование коммерчески доступных наборов реагентов для реализации глюкозооксидазного метода количественного определения глюкозы в биологических жидкостях. Состав набора реагентов для воспроизведения данного метода должен быть следующим:

1) Рабочий реагент (фосфатный буфер (рН 7,5) 100 ммоль/л; фенол - 5 ммоль/л; 4-аминоантипирин - 0,5 ммоль/л, глюкозооксидаза >10000 МЕ/л, пероксидаза >2000 МЕ/л);

2) Калибратор (водный раствор глюкозы) (глюкоза - 5,55 ммоль/л).

Рабочий реагент можно хранить в темном месте в плотно укупоренной посуде при температуре +2-8°С в течение 1 месяца. Стандартный раствор глюкозы необходимо готовить перед каждым применением. Все реагенты в используемых концентрациях являются нетоксичными.

К занятию со студентами подготовка этапов данного способа проводится лаборантом.

Пример способа количественного определения глюкозы в биологических жидкостях глюкозооксидазным методом с использованием имитаторов мочи человека (действия, представленные в примере, выполняются студентами).

Студенту выдается индивидуальный штатив, укомплектованный имитаторами нормальной и патологической мочи человека, а также рабочим реагентом, калибратором глюкозы и дистиллированной водой. Все реагенты на штативе должны быть маркированы. Вместе со штативом студенту должны быть выданы: автоматические дозаторы, позволяющие отбирать объем жидкости 10 и 1000 мкл, с соответствующими наконечниками; пробирки вместимостью 5-10 мл; перчатки резиновые или пластиковые.

Успешная реализация метода также предусматривает наличие в лаборатории спектрофотометра (длина волны 510 нм) или фотоэлектроколориметра (длина волны 480-520 нм); кювет с толщиной поглощающего свет слоя 10, 5 или 3 мм; термостата, обеспечивающего температуру +37°С; секундомера или часов. Данный метод может быть осуществлен с использованием автоматических или полуавтоматических биохимических анализаторов.

Проведение анализа.

Компоненты реакционной смеси с использованием автоматических дозаторов вносят в пробирки в количествах, указанных в таблице.

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при температуре +37°С в течение 10 минут или при комнатной температуре (+18…+25°С) в течение 20 минут. Далее измеряют оптическую плотность опытных проб и калибровочной пробы против контрольной пробы при длине волны 500 (480-520) нм в кюветах на 5 мм (3 мм). При использовании кювет другого объема расход реагентов может быть пропорционально изменен с сохранением соотношения объема анализируемых образцов к объему рабочего реагента 1:100. Окраска стабильна в течение 60 мин после окончания инкубации при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.

Концентрацию глюкозы в опытных пробах, содержащих имитаторы нормальной и патологической мочи, рассчитывают по формуле:

С=Ео/Екал × 5,55, где

С - концентрация глюкозы в опытных пробах, (ммоль/л);

Ео - оптическая плотность опытной пробы, ед. опт. пл.;

Екал - оптическая плотность калибровочной пробы, ед. опт. пл.;

5,55 - концентрация глюкозы в калибровочной пробе, ммоль/л.

Нормальное содержание глюкозы в нативной моче здорового человека, определенное данным методом, составляет <0,5 ммоль/л. С использованием имитаторов мочи результаты будут следующими: в случае имитатора нормальной мочи человека оптическая плотность опытной пробы не изменяется, уровень глюкозы не определяется, результат считается отрицательным; в случае имитатора патологической мочи человека концентрация глюкозы в пробе составит 28-112 ммоль/л.

Таким образом, по результатам проведенного анализа в случае использования имитатора патологической мочи человека студент диагностирует у пациента глюкозурию, что аналогично оценке результатов стандартного теста-прототипа по определению уровня глюкозы в моче глюкозооксидазным методом.

Предложенный способ прошел испытание на лабораторных занятиях по биологической химии у студентов 2 курса специальностей «Лечебное дело», «Педиатрия», «Фармация» и «Биология» в ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет»; внедрен и успешно используется в течение 3 лет на кафедре биомедицинской химии, иммунологии и лабораторной диагностики Медицинского института при обучении студентов медицинских и биологических специальностей.

Точность воспроизведения результатов имитационного способа составляет 100%. Алгоритм всех этапов аналогичен алгоритму стандартной методики количественного определения глюкозы в моче глюкозооксидазным методом, так же как и диагностируемый оценочный результат. Каждый студент может многократно и самостоятельно воспроизвести данный обучающий способ, используя учебные пособия и методические указания по курсу биологической химии. Это позволит закрепить знания, умения и навыки студентов, развить самостоятельность и уверенность, что важно для формирования профессиональной компетентности будущего врача и специалиста-биолога.

Данный обучающий способ заменяет дорогостоящие и небезопасные образцы настоящих биологических жидкостей человека (моча) их имитаторами. Используемые в нем химические и биологические реагенты доступны, приемлемы по цене, безопасны в рекомендуемых концентрациях. Обучающая методика вполне может быть внедрена в образовательный процесс, использована на лабораторных занятиях студентов медицинских и биологических специальностей вузов и колледжей при освоении профессиональных компетенций. Способ также с успехом может быть использован в клинико-диагностических экспресс-тестах (с тест-полосками) определения содержания глюкозы в моче.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Постановление Правительства РФ от 26.01.2010 г. №29 (ред. от 04.09.2012 г. №882) «Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии» // Российская газета. - 2012.

2. ГОСТ 12.4.113-82. Система стандартов безопасности труда. Работы учебные лабораторные. Общие требования безопасности (утв. Постановлением Госстандарта СССР от 25.06.1982 г. №2525). - М.: Изд-во стандартов, 1982.

3. Приказ Гособразования СССР от 13.10.1989 г. №789 «О введении в действие Правил безопасной работы с химическими веществами в высших и средних специальных учебных заведениях, на предприятиях и в учреждениях системы Гособразования СССР». - М.: Гособразование СССР, 1989.

4. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 504 с.

5. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - М.: Высшая школа, 1988. - 239 с.

6. Биохимия. Руководство к практическим занятиям: учебное пособие. Чернов Н.Н., Березов Т.Т., Буробина С.С. и др. / Под ред. Н.Н. Чернова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 240 с.

7. Досон Р., Эллиот Д. Справочник биохимика / Перевод с английского. -М.: Мир, 1991. -544 с.