Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДА И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МНОЖЕСТВЕННО МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения наличия множественно модифицированных липопротеинов (ммЛП) в сыворотке крови человека.

Множественно модифицированные липопротеины являются одним из ключевых факторов атеросклероза, приводящего к возникновению сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - одного из основных причин смертности в развитых странах. Большинство ССЗ являются следствием атеросклероза коронарных артерий. Одним из ключевых моментов патогенеза атеросклероза является внутриклеточное накопление липидов в протеогликановом слое интимы артерий. В экспериментах in vitro показано, что химическая модификация липопротеинов низкой плотности (мЛП) (ацетилирование, обработка малоновым диальдегидом, окисление ионами металлов переменной валентности, избыточное гликозилирование и т.д.) приводит к накоплению липидов в культивируемых клетках эндотелия [4, 7]. Способность патологической сыворотки вызывать накопление липидов в эндотелиальных клетках определяют как атерогенность крови. Показано, что атерогенные свойства мЛП связаны с образованием ассоциатов мЛП [12]. После установления факта атерогенности модифицированных in vitro липопротеинов в сыворотке крови больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) были обнаружены циркулирующие множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛП) [8, 13], значительно отличающиеся от нативных по физико-химическим свойствам. Так, ммЛП имеют пониженное содержание сиаловых кислот, маннозы и других моносахаридов. Показано, что ммЛП избирательно связывают и активируют С1 компонент системы комплемента [2]. Окисленные липопротеины низкой плотности (охЛП) являются иммуногенными и индуцируют аутоиммунный ответ у людей. Аутоантитела к охЛП являются преимущественно провоспалительными IgGl и IgG3 изотипами и при образовании иммунного комплекса активируют классический путь системы комплемента и запускают фагоцитоз клетками, экспрессирующими Fcγ рецепторы [11]. Одним из наиболее патогенных свойств охЛП является взаимодействие с тромбоцитами, приводящее к их гиперреактивности [6] и к сосудистому воспалению [5].

Наиболее разрабатываемыми методами определения мЛП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к охЛП, МДА-модифицированным ЛП, избыточно гликозилированным ЛП [14].

Существенным недостатком иммуноферментых тест-систем является необходимость диссоциации комплексов мЛП-антитело, что требует предварительной преципитации иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ) с последующим отделением ПЭГ-преципитата центрифугированием, декантацией, отмыванием и растворением ПЭГ-преципитата в буфере, содержащем детергенты и хаотропные агенты для диссоциации иммунного комплекса. На следующей стадии избавляются от детергента и хаотропного агентов диализом [14]. Наличие мЛП требует проведения минимум двух тестов с разными моноклональными антителами. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста затрудняют использование их в рутинных исследованиях.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований реагенты и методы определения содержания ммЛП в сыворотке. Учитывая важную патогенетическую роль ммЛП при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения ммЛП.

Наиболее близким техническим решением является определение β- и пре-β-липопротеинов по методу Бурштейна и Самая с турбидиметрическим определением помутнения, образующегося при добавлении хлористого кальция и гепарина к сыворотке крови человека [1].

Недостатком этого способа является определение уровня β- и пре-β-липопротеинов, которые представляют собой липопротеины низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП) сыворотки крови в норме. Только при наличии явного атеросклероза наблюдается повышение этого показателя.

Задачей настоящего изобретения является разработка буфера для избирательной преципитации ммЛП в сыворотке крови человека и способа определения ммЛП, являющегося ключевым маркером атерогенности крови.

Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека раствора поливинилпирролидона (ПВП), определения степени помутнения раствора сыворотки турбидиметрическим способом и расчета содержания [ммЛП] по приведенной ниже формуле.

Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала реагентов для специфической агрегации ммЛП, получение тест-системы для определения уровня [ммЛП], упрощение, сокращение длительности процедуры исследования, а также его удешевление.

Этот результат достигается тем, что определение ммЛП в сыворотке крови человека проводят путем обработки ее 10% раствором поливинилпирролидона (ПВП)-12600 при объемном соотношении сыворотка:среда (1:8), инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре, измерения светопоглощения в опытной и контрольной пробах, вычисления разности между ними, при этом при величине разности более 2,7 У.Е. констатируют атерогенность крови.

Среду для преципитации ммЛП готовят растворением 10 г ПВП (относительная молекулярная масса 12600±2700) в 100 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Среду добавляют к сыворотке крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения спетрофотометрически и рассчитывают уровень содержания [ммЛП] по формуле:

где

[ммЛП] - уровень содержания ммЛП в опытной пробе в условных единицах (У.Е.);

Е_о - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 450 нм, ед. опт. пл.;

Е_К - оптическая плотность контрольной пробы, сыворотки с соответствующим количеством буфера без ПВП (контрольный буфер), ед. опт. пл.;

100 У.Е - коэффициет перерасчета в условные единицы (У.Е.).

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП для преципитации ммЛП в сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной сыворотки крови от 10 больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) добавляют 100-800 мкл 10% раствора ПВП в 0,01 М Трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl. тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 9-луночных плоскодонных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Рассчитывают уровень содержания [ммЛП] по формуле. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП в инкубационной системе с 6,7% до 8,9% наблюдается агрегация ммЛП и помутнение раствора. Максимальная агрегация ммЛП достигается при концентрации 8,9%, т.е. при объемном соотношении сыворотка:среда (1:8). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 8,9% наблюдается снижение степени агрегации.

Для подтверждения агрегации именно ммЛП сыворотки больных атеросклерозом в 8,9% растворе ПВП нами была исследована пулированная сыворотка от 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Добавление к пулированной сыворотке крови здоровых доноров возрастающих концентраций 10% ПВП не приводит к агрегации нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности.

Пример 2. Определение содержания холестерина, триацилглицерида (ТАГ) и общих белков в ПВП-преципитатах. Для подтверждения наличия ммЛП в ПВП-преципитатах были проведены следующие эксперименты. Из 0,5 мл пулированной сыворотки больных ИБС и контрольных здоровых доноров были приготовлены ПВП-преципитаты в условиях 8,9% ПВП. Преципитат был осажден путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантировали, ПВП-преципитат 2 раза отмывали 8,9% раствором ПВП и ресуспендировали в 0,5 мл 0,01 М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. В полученных ПВП-преципитатах определяли содержание холестерина, ТАГ и общих белков с использованием реактивов фирмы «Диакон-ДС», Россия. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, в ПВП-преципитате пулированной сыворотки больных ИБС содержание холестерина в 12 раз, а ТАГ в 16 раз больше, чем в ПВП-преципитате из сыворотки здоровых доноров. Содержание общего белка в 1,3 раза выше в ПВП-преципитате больных.

Таким образом, наличие холестерина, ТАГ и белка в ПВП-преципитатах из сывороток свидетельствует о липопротеиновой природе агрегатов, образующихся в присутствии 8,9% ПВП. Повышенный уровень ПВП-преципитата, содержащего ммЛП у больных с ИБС, является специфическим маркером атеросклеротического процесса.

Пример 3. Подбор оптимального времени инкубации смеси сыворотки с ПВП для агрегации ммЛП. К 50 мкл пулированной сыворотки больных ИБС и здоровых доноров добавляют 400 мкл 10% раствора ПВП в 0,01 М трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10, 20, 30 и 60 мин в 9-луночных плоскодонных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, в пулированной сыворотке больных ИБС агрегация ммЛП максимально протекает в течение 10 минут. При дальнейшей инкубации наблюдается незначительная агрегация остаточного количества ммЛП (примерно 8%). Уровень ммЛП в пулированной сыворотке здоровых доноров при инкубации 60 мин остается без изменений на уровне 8,3 У.Е.

Таким образом, для выявления повышенного уровня [ммЛП] 10-минутная инкубация является оптимальной для рутинных исследований атерогенности крови.

Пример 4. Определение связывания комплемента морской свинки преципитатами ммЛП в зависимости от концентрации. К 10-160 мкл раствора ПВП-преципитата (4,3 мг/мл по белку), приготовленного из пулированной сыворотки больных с ИБС и разбавленного в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, добавляют 20 мкл раствора, разбавленного 1:19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубировали 20 мин при 37°C. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика (ЕА) и инкубировали 30 мин при 37°C. После инкубации в каждую пробу добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину А₄₀₅ супернатанта. Контрольная проба не содержала ПВП-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

,

где Н, R и Х - величины оптической плотности A₄₁₂ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:

Данные о степени связывания комплемента при разных концентрациях ПВП-преципитата приведены в таблице 5.

Как видно из данных, представленных в таблице 5, ммЛП, преципитированные в растворе 8,9% ПВП, обладают комплементсвязывающей способностью, причем эффект является дозозависимым. При увеличении концентрации ПВП выше 8,9% в системе наблюдается уменьшение количества преципитированного холестерина, ТАГ, белков, а также комплементсвязывающей активности ПВП- преципитатов (данные не приведены).

Таким образом, определение комплементсвязывающей способности ПВП-преципитата свидетельствует о наличии ммЛП и о специфическом взаимодействии ммЛП с комплементом морской свинки. Определение холестерина, ТАГ и общих белков в ПВП-преципитате при концентрации 8,9%, а также максимальная комплементсвязывающая способность подтверждает оптимальную концентрацию 8,9% ПВП в системе для специфической агрегации ммЛП из сыворотки больных с атеросклеротической болезнью.

Пример 5. Влияние ммЛП на агрегацию тромбоцитов. ммЛП были приготовлены в условиях 8,9% ПВП, как описано в примере 2. Для исследования агрегации тромбоцитов получали кровь из краевой вены уха кролика в 3,8% раствор цитрата натрия (9:1 по объему). Центрифугировали кровь при 150 g в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму (БТП) крови, использовали для анализа агрегации тромбоцитов. Исследования агрегации тромбоцитов проводили по методу Born [3] в модификации O'Brien [9, 10] с графической регистрацией на агрегометре фирмы Crono-Log Со. (США). Принцип метода основан на изменении оптической плотности БТП при добавлении индукторов агрегации. При агрегации суспензия тромбоцитов становится более прозрачной и за счет падения оптической плотности светопропускание растет. Графически это отображается отклонением кривой от нулевой линии (0% агрегации) до 100% агрегации.

Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°C в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили препарат ммЛП, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. За 100% агрегации принимали светопропускание пробы, содержащей 0,25 мл тромбоцит бедной плазмы. В качестве параметров агрегации использовали максимальный процент снижения оптической плотности - В (%). Степень агрегации тромбоцитов при действии ммЛП характеризовали величиной В_оп/В_к, где В_оп и В_к - изменение светопропускания соответственно богатой тромбоцитами плазмы, содержащей ммЛП, и контрольного образца. Результаты представлены в таблице 6.

Как видно из данных, представленных в таблице 6, предварительное введение ммЛП при конечной концентрации 0,4 мкг/мл вызывает усиление агрегации, в то время как ПВП-преципитат из сыворотки контрольной группы здоровых доноров практически не оказывает влияния на функцию тромбоцитов.

Таким образом, ПВП-преципитат, приготовленный из сыворотки больных ИБС, вызывает гиперреактивность тромбоцитов.

Пример 6. Влияние концентрации и времени инкубации ммЛП на агрегацию тромбоцитов. Ход определения: 0,25 мл ТБП помещали в кювету агрегометра, прогревали до 37°C в течение 1 мин при постоянном перемешивании и выставляли 0% агрегации. В опытную пробу вносили возрастающие концентрации препарата ммЛП, приготовленного из сыворотки больных ИБС, дополнительно инкубировали в течение 4 мин и проводили агрегацию тромбоцитов введением индуктора АДФ (конечная концентрация 1,25 мкМ). Регистрировали агрегацию в течение 5 мин. Результаты представлены в таблице 7.

Как видно из данных, представленных в таблице 7, эффект усиления агрегации тромбоцитов под влиянием ммЛП имеет дозозависимый характер. Причем, до 10 мкг/мл ммЛП наблюдается усиление агрегации тромбоцитов, а свыше 10 мкг/мл наблюдается плато, что свидетельствует об эффекте насыщения, т.е. увеличение концентрации в 2 раза (20 мкг/мл) не вызывает дальнейший эффект.

Влияние времени предварительной инкубации ммЛП с тромбоцитами на функцию тромбоцитов. Для этих исследований использовали концентрацию 10 мкг/мл ммЛП. Использовали два интервала времени - 0 мин и 5 мин. В первой серии экспериментов к богатой тромбоцитами плазме добавляли ммЛП и сразу запускали агрегацию тромбоцитов добавлением АДФ без предварительной инкубации. Во второй серии экспериментов после добавления ммЛП к ТБП инкубировали 5 мин и затем добавляли индуктор АДФ. Полученные данные свидетельствуют о том, что эффект усиления агрегации тромбоцитов практически не зависит от времени предварительной инкубации.

Таким образом, эффект усиления агрегации тромбоцитов под действием ммЛП: 1) зависит от концентрации, причем наблюдается эффект насыщения; 2) для связывания ммЛП с тромбоцитами практически не требуется предварительная инкубация, что свидетельствует об очень высокой аффинности и скорее всего связано с взаимодействием ммЛП с рецепторами на мембране тромбоцитов.

Пример 7. Влияние хранения сыворотки на уровень содержания ммЛП. Определяли уровень содержания ммЛП предлагаемым способом в день забора крови и через 7 суток хранения при 4°C сыворотки больных ИБС и здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 8.

Полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что уровень ммЛП в сыворотке крови при хранении в течение 7 суток при 4°C не меняется у здоровых доноров. В то время как данный показатель начинает возрастать при хранении сыворотки больных ИБС. Параллельно с повышением уровня ммЛП возрастает бланк сыворотки у больных ИБС. Данный факт может свидетельствовать о том, что при хранении сыворотки крови больных ИБС при 4°C, с одной стороны, наблюдается дальнейшая модификация липопротеинов низкой плотности, с другой стороны, повышение бланка сыворотки свидетельствует о наличии повышенного уровня криоглобулинов, которые преципитируют при 4°C.

Пример 8. Определение уровня содержания [ммЛП] в сыворотке крови у больных ИБС и здоровых доноров с использованием биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem" Финляндия). Проведены исследования содержания [ммЛП] предлагаемым способом в сыворотке 18 больных ИБС и 60 здоровых доноров (контрольная группа) с использованием биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem" Финляндия). К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляли 400 мкл 10% ПВП в 0,01М трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 9-луночных плоскодонных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01М Трис-HCl-буфера, pH 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Рассчитывали уровень содержания [ммЛП] по формуле, приведенной выше. Полученные результаты приведены в таблице 9.

В контрольной группе уровень содержания [ммЛП] колебался от 1,1 до 9,9 У.Е. и среднее значение составило 4,59±2,58. Данная величина ммЛП нами принята за нормальный показатель у здоровых доноров. У больных ИБС содержание [ммЛП] колебалось от 9,9 до 37,1 У.Е. и среднее значение составило 21,26±10,64 У.Е., что в 4,6 раза больше нормального показателя. Нужно отметить, что при использовании других биохимических анализаторов в каждой лаборатории должен быть уточнен диапазон нормальных величин [ммЛП] для обследуемого контингента людей.

Пример 9. Определение уровня содержания [ммЛП] в сыворотке крови у больных ИБС и здоровых доноров с использованием фотометра иммуноферментного анализа Multiskun MCC ("Labsystem" Финляндия). Проведены исследования содержания [ммЛП] предлагаемым способом в сыворотке 53 больных ИБС и 42 здоровых доноров (контрольная группа) с использованием фотометра иммуноферментного анализа Multiskun MCC ("Labsystem" Финляндия). К 14 мкл исследуемой сыворотки добавляли 116 мкл 10% ПВП в 0,01М трис-HCl-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 96-луночных плоскодонных плашках. Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством 0,01М Трис-HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Рассчитывали уровень содержания [ммЛП] по формуле, приведенной выше. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Как видно из данных, представленных в таблице 10, в контрольной группе уровень содержания [ммЛП] колебался от 1,6 до 2,7 У.Е. и среднее значение составило 2,24±0,39. Данная величина [ммЛП] нами принята за нормальный показатель у здоровых доноров, полученных с использованием фотометра иммуноферментного анализа. У больных ИБС содержание [ммЛП] колебалось от 2,8 до 19,9 У.Е. и среднее значение составило 8,08±4,14 У.Е., что в 3,6 раза больше нормального показателя.

Таким образом, использование фотометра иммуноферментного анализа для измерения уровня [ммЛП] позволяет повысить производительность лабораторных исследований, а также уменьшает расход сыворотки до 14 мкл на 1 тест. Учитывая оснащенность клинико-диагностических лабораторий фотометрами иммуноферментного анализа нами предлагается диапазон нормальных величин [ммЛП] на уровне от 1,6 до 2,7 У.Е.

Таким образом, из приведенных выше примеров следует следующее.

1. В присутствии 8,9% ПВП из сыворотки больных с ИБС преципитируют ммЛП, в то время как у здоровых доноров не наблюдается преципитация нативных ЛП.

2. 10 мин инкубация смеси сыворотки с ПВП приводит к максимальной преципитации ммЛП у больных ИБС.

3. Атерогенность ммЛП подтверждается двумя независимыми тестами: а) ммЛП обладают провоспалительным эффектом за счет связывания и активации системы комплемента; б) ммЛП обладают тромбогенным эффектом, обусловленным гиперагрегацией тромбоцитов.

4. Хранение сыворотки при 4°C не приводит к появлению ммЛП в сыворотке крови здоровых доноров, в то время как в сыворотке больных с ИБС наблюдается спонтанная ассоциация ммЛП наряду с криопреципитацией.

Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание сыворотки с раствором ПВП и регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие ммЛП непосредственно в сыворотке без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (10 мин на 1 анализ, при проведении серии из 30 проб не более 30 мин). Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет выявлять доклинические состояния атеросклероза, может служить специфическим биохимическим маркером для терапии атеросклеротических заболеваний, позволит проводить углубленное исследование патогенеза атеросклероза, дает возможность их ранней профилактики и позволяет контролировать эффективность проводимой терапии.