ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В ИММУННЫХ КОМПЛЕКСАХ

Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК) в сыворотке крови человека.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения ХИК. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛПНП), при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения ХИК (Собенин И.А. и др., 2012; Burut D.F.P. et al., 2010).

Известны способы определения ХИК в сыворотке крови преципитацией их 2,5%, 3,5% и 4% растворами полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000) в течение 24 часов. Агрегированные иммунные комплексы, содержащие множественно модифицированные ЛПНП, осаждают центрифугированием, промывают преципитат 3 раза буфером, содержащим соответствующую концентрацию ПЭГ-6000, и определяют в преципитате холестерин после экстракции. (Szondy E et al., 1983; Тертов В.В. и др. 1989; Lopes-Virella M.F. et al., 2007; Virella G. et al., 2008).

Недостатком приведенных способов является низкая специфичность, длительность процедуры, неполная преципитация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности и, как следствие, низкие значения ХИК.

В качестве прототипа использован способ определения уровня циркулирующих иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350) (Шойбонов Б.Б. и др., 2012). Использование ПЭГ-3350 при концентрации 5% позволило авторам преимущественно преципитировать из сыворотки циркулирующие иммунные комплексы.

Задачей настоящего изобретения является разработка экспресс-способа определения уровня холестерина в иммунных комплексах для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов сыворотки, содержащих ммЛПНП, проводят путем обработки сыворотки 0,01 М Трис-HCl-буфером, содержащим 8,3%-ный ПЭГ 3350, 3,3%-ный ПВП 12600 и 0,15 М NaCl, pH 7,4, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПЭГ-3350 и ПВП-12600 и определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах с использованием стандартного ферментативного набора. При концентрации ХИК свыше 8,3 мг/дл констатируют повышенный уровень.

Способ определения ХИК включает:

1) буфер-1 для преципитации ХИК, который содержит смесь 8,3% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 и 3,3% поливинилпирролидона с молекулярной массой 12600 в 0,01 М трис-HCl-буфере с pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

2) буфер-2 для растворения преципитата ХИК представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

Экспресс-способ определения холестерина иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина в иммунных комплексах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 для преципитации ХИК в соотношении 1:1,2 инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме в Буфере-2; уровень ХИК определяют с использованием ферментативного набора «Холестерин» и при содержании ХИК свыше 8,3 мг/дл констатируют повышенный уровень.

Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют с помощью гемолитических тестов с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×10⁸ кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺).

Содержание IgG в составе преципитата определяют с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека, антителами барана против IgG человека. В качестве стандарта используют препарат человеческого IgG с концентрацией 1 мг/мл.

Этап 1. Подбор оптимальной концентрации ПВП-12600 (при постоянной концентрации 4,5% ПЭГ-3350) для осаждения иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП (ммЛПНП) из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.

1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при возрастающих концентрациях ПВП-12600 в присутствии 4,5% ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляли от 10 до 40 мкл раствора 20% ПВП (молекуляная масса 12600±2700), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантировали, и преципитат растворяли в 50 мкл буфера-2.

1.2. Определение холестерина и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПВП-12600 и постоянной концентрации 4, 5% ПЭГ-3350. В преципитатах после растворения в 50 мкл буфера-2 определяли содержание холестерина и общего белка с использованием наборов реагентов фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Общий белок в преципитате представлял собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), содержащие как ммЛПНП в качестве антигена, так и другие антигены. Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.3. Определение степени связывания комплемента морской свинки циркулирующими иммунными комплексами в преципитатах, приготовленных при возрастающих концентрациях ПВП и постоянной концентрации 4,5% ПЭГ-3350. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺ и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл ЕА и повторно инкубировали 30 мин при 37°С. После 30-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугировали и определяли величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержала преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле

У(%)=[(Х-К)/(Н-К)×100],

где Н, R и X - величины оптической плотности А₄₀₅ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле

ССК(%)=100-У.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.4. Определение содержания IgG в преципитате.

1.4.1. Приготовление эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека. Предварительно определяли титр гетерофильных антител в сыворотке крови человека. Использовали инактивированную прогреванием при 56°С в течение 20 мин сыворотку крови человека с титром гетерофильных антител 1:512 для получения иммунного комплекса (эритроциты барана-антитела человека (ЕА_ч) в субагглютинирующей дозе). После 30 мин инкубации сформированный комплекс ЕА_ч отделяли центрифугированием, осадок 3 раза промывали 0,15 М раствором NaCl при центрифугировании и готовили 1% взвесь ЕА_ч.

1.4.2. Определение титра антител барана к IgG человека с использованием, приготовленного иммунного комплекса (ЕА_ч). Предварительно титровали препарат антител барана в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках, добавляли равный объем 1% суспензии ЕА_ч, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации определяли конечное разведение антител барана, при котором наблюдается полная гемагглютинация. Данное разведение считается 1 гемагглютинирующей единицей (ГАЕ). В нашем случае 1 ГАЕ был титр равный 1:32400. Для РТГА использовали разведение препарата антител против IgG человека 1:8100 (4 ГАЕ).

1.4.3. Проведение РТГА. Предварительно титровали преципитаты иммунных комплексов, разведенных 1:99, на 12 лунок в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках. В качестве стандарта титровали препарат IgG с исходной концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и стандартного препарата IgG добавляли равный объем разбавленного раствора антител против IgG человека, содержащего 4 ГАЕ, т.е. препарат антител был разбавлен 1:8100. Тщательно перемешивали и добавляли равный объем 1% суспензии иммунных комплексов (ЕА_ч), повторно перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации определяли для каждой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглютинации. Расчеты проводили с использованием данных по торможению гемагглютинации стандартного раствора IgG человека. Полученные данные представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации 4,5% ПЭГ-3350 в сыворотке не наблюдается агрегация ни иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины (ммЛПНП), ни нативных липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Показателями агрегации и преципитации как иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, так и нативных ЛПНП и ЛПОНП, являются содержание холестерина в преципитатах. Добавление ПВП-12600 в раствор сыворотки, содержащей 4,5% ПЭГ-3350, вызывает агрегацию иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, начиная с 0,3% до 1,7%. Дальнейшее увеличение концентрации ПВП-12600 выше 1,7% в системе приводит к агрегации и преципитации нативных ЛПНП и ЛПОНП. Об этом свидетельствует отсутствие возрастания степени связывания комплемента преципитатами, полученными при концентрации ПВП-12600 свыше 1,7%. Сохранение степени связывания комплемента на уровне 65-68% и возрастание концентрации холестерина и общего белка в преципитатах при увеличении концентрации ПВП-12600 (более 1,7%) свидетельствует, с одной стороны, о полной агрегации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, с другой стороны, об агрегации нативных ЛПНП и ЛПОНП, которые не обладают комплементсвязывающей способностью. Возрастание уровня общего белка также подтверждает агрегацию и преципитацию нативных ЛПНП и ЛПОНП. Наличие IgG в преципитахах, приготовленных в присутствии ПВП, свидетельствует об иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП, так же как постоянный уровень IgG в преципитатах, полученных при концентрации ПВП-12600 1,7% и выше, свидетельствует о специфической преципитации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП.

Таким образом, при постоянной концентрации ПЭГ 3350 (4,5%) и концентрациях ПВП-12600 в диапазоне от 0,3% до 1,7% наблюдается избирательная дозозависимая агрегация и преципитация иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, и не наблюдается агрегация и преципитация как нативных ЛПНП и ЛПОНП, так и свободных IgG.

Этап 2. Определение содержания холестерина иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ишемической болезнью сердца.

2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 1,7% ПВП-12600 и 4,5% ПЭГ-3350. К 50 мкл сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и относительно здоровых доноров добавляли 60 мкл буфера-1 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 23°С в течение 5 мин при 6000 об/мин. Супернатант декантировали и осадок растворяли в 50 мкл буфера-2. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в группе относительно здоровых доноров в трех пробах содержание ХИК было заметно выше, чем в остальных пробах этой контрольной группы. Полученные данные о повышенном уровне ХИК у трех доноров, возможно, свидетельствуют о субклинической стадии атеросклероза. При исключении данных доноров из группы контроля по ХИК, средний уровень ХИК составляет 7,07±1,15, при колебании от 5,9 до 8,3 мг/дл. Следовательно, уровень ХИК до 8,3 мг/дл можно предварительно считать нормальным уровнем у здоровых людей. В группе больных ИБС в 100% случаев определяется повышенный уровень ХИК и колебания составили от 11,7 до 40,3 мг/дл.

Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения холестерина в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови человека. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволят проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, реализация изобретения позволит как контролировать эффективность проводимого лечения, так и выявлять доклинические состояния атеросклероза.

Литература

1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103.

2. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С.и др. Холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т. 29, №8. - С.35-38.

3. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов // Описание изобретения к патенту РФ №2452962 от 10.06.2012 г. Бюл. №16.

4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V. 61, №7. - P.679-689.

5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.

6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46. - P.93-98.

7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, №3. - P.394-400.