Результат интеллектуальной деятельности: ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПРОТИВОМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НАПРАВЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ, СОДЕРЖАЩЕГО НАНОЧАСТИЦЫ

Изобретение относится к области фармакологии и медицины, конкретно к способу получения нового поколения лекарственных средств направленного действия на основе разрешенных к применению в медицинской практике Российской Федерации субстанций (веществ, обладающих фармакологической активностью и предназначенных для производства и изготовления лекарственных препаратов [1]).

Целью настоящего изобретения является разработка технологически доступного способа получения лекарственных средств нового поколения на основе известных субстанций, высокоэффективных, практически нетоксичных препаратов, содержащих наночастицы.

Поставленная цель достигнута с помощью современных достижений фармакологии и медицины, с учетом доминирования в наномире явлений самоупорядочения и самоорганизации, отражающих проявление эффектов матричного копирования и синергетических процессов [2].

Среди лекарственных субстанций использованы водорастворимые и нерастворимые в воде вещества, имеющие простые и сложные в химическом отношении молекулярные структуры. Для иллюстрации изобретения в теоретическом и экспериментальном плане выбрана наиболее значимая в социальном плане фармгруппа лекарств для лечения инфекционных заболеваний.

Известно, что наряду с вирусами возбудителями инфекций являются микроорганизмы, которые были открыты в 1676 году Антони ван Левенгуком, и лишь через два века после работ Роберта Коха по изучению сибирской язвы стала ясна их определяющая роль в возникновении эпидемий. Успехи в лечении инфекционных заболеваний достигнуты благодаря применению антибиотиков (небелковых веществ изначально природного происхождения), сульфамидов, диамино-пиримидинов, хинолонов и других групп антибактериальных химиопрепаратов. К сожалению, в настоящее время произошел эпидемиологический сдвиг, когда многие инфекционные заболевания возвращаются вновь в новом качестве, как результат приобретенной микроорганизмами резистентности (устойчивости) к известным лекарственным препаратам [3].

Сегодня одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний стал туберкулез. Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) каждый год туберкулезом заболевают примерно 3.5 млн человек, а к 2010 году более 70 млн жителей планеты умрет от этой болезни, если не будут найдены новые более эффективные средства лечения [4]. Вместе с тем, за последние 10 лет арсенал противомикробных средств для лечения туберкулеза практически не изменился. По-прежнему используют изониазид, рифампицин, этамбутол и ряд других известных субстанций или их композиций. Как правило, лечение больных туберкулезом не доводится до полного выздоровления, что служит причиной возврата заболевания, появления вторичной резистентности к лекарственным средствам. При этом на эффективность лечения влияет кратность приема препаратов в течение дня. Опубликованы данные о том, что при 3-кратном приеме препаратов режим дозирования соблюдают лишь 37.7% пациентов, при 2-кратном приеме - 68.9%, и при однократном - 79.6% [5]. Очевидно, что наилучшие результаты удается обеспечить при приеме препаратов один раз в сутки. Для избежания нарушений режимов дозировки и длительности подбора эффективных лекарств ВОЗ рекомендует отказаться от моно- и сочетанной терапии и указывает на необходимость создания новых комбинированных противотуберкулезных препаратов, содержащих специально подобранный набор лекарственных веществ с фиксированными дозами в одной таблетке (капсуле, ампуле или флаконе), обеспечивающих оптимальный терапевтический эффект при приеме препарата один раз в сутки. Особое внимание обращается на обеспечение адекватной биодоступности субстанций и, в частности, рифампицина [6].

В этой связи были разработаны соответствующие комбинированные противомикробные препараты, содержащие в качестве действующего начала смеси рифампицина, этамбутола и изониазида [7]; рифампицина, этамбутола, изониазида, пиразинамида и пиридоксина [8]; изониазида и пиразинамида или этамбутола гидрохлорида [9]; изониазида, рифампицина, пиразинамида, этамбутола гидрохлорида и пиридоксина гидрохлорида [10]; ломефлоксацина, протионамида, пиразинамида, этамбутола гидрохлорида и пиридоксина гидрохлорида [11]; ломефлоксацина, изониазида, пиразинамида, этамбутола гидрохлорида и пиридоксина гидрохлорида [12]; пиразинамида, канамицина и (или) этамбутола, максавина и протионамида [13]; рифампицина, этамбутола и циклосерина [14]; изониазида и рифампицина [15], изониазида, рифампицина, пиразинамида и этамбутола в препарате Майрин-П [16]; циклосерина, рифабутина, и циклосерина, протионамида в сочетаниях с глутоксимом [17]. Судя по всему, изыскания новых комбинаций продолжаются все в большем масштабе.

Вместе с тем даже при использовании перечисленных выше современных комбинированных противомикробных препаратов лишь незначительная часть лекарственных веществ попадает в орган/клетку-мишень, а их большая часть подвергается биотрансформации, не оказывая антибактериального действия. В связи с этим возникают серьезные побочные эффекты в виде нарушения гемопоэза, функции печени и почек. Одним из путей преодоления этих негативных последствий является разработка лекарственных препаратов направленного действия на базе иммобилизованных полимеров. Так, для рифампицина известны противотивомикробные препараты, содержащие в качестве полимерной основы целлюлозу [18], для изониазида - крахмал [19] и декстран [20, 21], для ампициллина, гентамицина, рифампицина и их смеси - полиалкилцианоакрилаты [22]. Полимерсодержащие системы обеспечивают внутриклеточную локализацию лекарств в альвеолярных макрофагах в эффективных для терапии количествах и обладают пролонгированным действием за счет регулировки скорости высвобождения субстанции из полимерной матрицы. Происходит уменьшение токсических эффектов. Более того, лекарственные формы с замедленным высвобождением активно действующих веществ позволяют обеспечить однократный прием пациентом всей суточной дозы препарата. Получены данные о высокой клинической эффективности и безопасности фторхинолонов в лекарственных формах с замедленным (пролонгированным) высвобождением ципрофлоксацина и офлоксацина [23], представляющих собой двухслойные таблетки, покрытые полимерной оболочкой.

Известны различные готовые лекарственные формы пролонгированных антибактериальных препаратов с постепенным выделением активного ингредиента, а именно: в виде таблеток [24, 25], в виде гелей [26, 27], в виде растворов для ингаляций [28] и в виде растворов для инъекций [29]. Используют липосомальные формы препаратов [30], недостатком которых является низкая стабильность из-за легкой окисляемости фосфолипидов, составляющих липосомы.

Анализируя приведенные выше данные, становится оправданным и обоснованным стремление к созданию новых лекарственных средств, пригодных для однократного применения и обеспечивающих замедленное высвобождение антибактериальных препаратов. При этом увеличение эффективности лечения может быть достигнуто с помощью биодеградируемых полимеров и комбинирования активно действующих ингредиентов. Поскольку основным объектом лечебного воздействия являются клетки, а зачастую - макромолекулы (рецепторы и ферменты), то и размер частиц препаратов нового поколения должен быть того же порядка, что и размер биомишеней, то есть находиться в нанометровом диапазоне. Нанопрепараты, поступающие в организм, должны действовать только на мишень, не задерживаться и не деградировать по пути. Было установлено, что для эффективного всасывания препаратов в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) нужно, чтобы диаметр частиц был менее 500 нм [31]. Нанообъект должен проходить через поры капилляров и иметь размеры менее 700 нм [32].

Вне сомнений, что для достижения значимых результатов при создании лекарственных препаратов нового поколения важен адекватный выбор биодеградируемых полимеров. В медицине применяется значительное количество наименований полимерных материалов [33]. Так, в качестве хирургического клея применяют полиалкилцианоакрилаты; для шовного материала используют поликапролактоны; для покрытия таблеток - полиметакрилаты (Eudragits); в качестве пищевых добавок - хитозаны (аминоглюканы или полисахариды), питательных веществ - твердые липиды; на основе поливинилпирролидонов производят плазмозаменяющие и дезинтоксикационные растворы; гомополимеры молочной (PLA) и гликолевой кислот (PGA), а также сополимеры молочной и гликолевой кислот (PLGA) являются медицинскими пластиками. Наномедицинские исследования последних лет в основном базируются на биодеградируемых полиалкилцианоакрилатах, гомополимерах PLA, PGA и сополимерах типа PLGA.

В качестве ближайшего аналога заявленного изобретения по п.1 предлагается композиция, описанная в [22]. Следует отметить, что описанная в данном патенте композиция содержит полиалкилцианоакрилаты, которые отличаются весьма высокими скоростями разложения в живом организме, что существенно снижает длительность выделения лекарств из полимерной матрицы. Более того, в Российской Федерации нет примеров разрешений для их применения в качестве компонентов лекарственных средств для внутреннего применения. В то же время препараты декапептил, золатекс, сандостатин и соматулин, содержащие помимо цитостатиков наночастицы сополимеров молочной и гликолевой кислот, разрешены к применению в медицинской практике России [34]. Сополимер PLGA [50/50 Poly(DL-lactide-co-glycolide)] нетоксичен и в организме человека подвергается биодеградации с образованием молочной и гликолевой кислот, катаболизм которых завершается образованием двуокиси углерода и воды [33].

Оптимизировать биораспределение противомикробного препарата, как и субстанций других фармгрупп, можно лишь путем снижения его накопления в печени. Уменьшение активности фагоцитоза в печени достигается за счет применения наночастиц лекарственного препарата с неионогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ), к примеру, полисорбата 80, что позволяет снизить накопление частиц в печени и увеличить время их циркуляции в организме («стелс-эффект») [35]. Деградирование субстанции по пути следования к биомишени резко сокращается.

В ряду водорастворимых противомикробных препаратов простой структурной формулы наиболее известны циклосерин, изониазид и пиразинамид, а рифабутин является нерастворимым в воде веществом сложного молекулярного строения. При лечении с применением этих субстанций наблюдаются нарушения функции печени и почек, аллергические реакции и диспептические явления, а при приеме циклосерина более 500 мг в сутки дополнительно наблюдаются судороги, психозы, повышенная раздражительность и другие нарушения центральной нервной системы [36, 34 - С.766].

Выше были рассмотрены варианты преодоления токсичности лекарственных субстанций. Возникновение почечной недостаточности дополнительно может быть преодолено путем включения в создаваемые лекарственные средства осмотических диуретиков, в частности, D-маннита [37]. Однако во всех случаях для избегания побочных явлений лекарственные средства нового поколения должны иметь геометрические параметры нанопрепарата.

В патентной литературе описано множество способов получения наночастиц, содержащих лекарственные субстанции, биодеградируемые полимеры и ПАВ. К настоящему времени они суммированы в двух основополагающих патентах - это различные варианты эмульгирования с последующим лиофильным высушиванием [38] и механическое дробление в присутствии измельчающей среды [39], который предлагается в качестве прототипа по п.3. Несмотря на явные успехи в области наномедицины, внедрение достижений нанотехнологии в промышленность сопряжено со значительными финансовыми затратами на заказ аппаратов и оборудования нового поколения. Техническим результатом заявленного изобретения является разработка доступного и простого для промышленного внедрения способа получения лекарственных средств на основе известных субстанций, высокоэффективных препаратов, содержащих наночастицы.

Предлагаемый способ базируется на упорядоченной структуре диметилсульфоксида (ДМСО), которая разрушается в интервале температур 40÷60°С и возобновляется при 20÷25°С [40]. При этом ДМСО стабилизирует неустойчивые (лабильные) вещества за счет его способности к координационной сольватации с органическими и неорганическими соединениями [41]. Более того, в медицинской практике ДМСО нашел применение в комплексной терапии болезни Бехтерева, ревматоидного артрита, дискоидной красной волчанки, тромбофлебита, экземы, фурункулеза, амилоидозе и пр. [42, 43]. Целесообразно отметить, что при лечении амилоидоза перорально принимают 100÷200 мл 3÷5% водного раствора ДМСО в сутки в течение многих месяцев. В совокупности с препаратом дисульфирам ДМСО приводит к длительному сенсибилизирующему эффекту у больных алкогольной зависимостью [44]. Радиопротекторная и противоопухолевая активность полиеновых антибиотиков в сочетании с ДМСО многократно увеличивается, способствуя продлению жизни [45].

Молекула ДМСО высокополярна. Согласно рентгеноспектральным исследованиям и квантовохимическим расчетам положительный заряд на атоме серы находится в интервале от +0.5 до +0.7, а отрицательный полюс диполя локализован на атоме кислорода [40]. Различные методы показывают, что в жидком ДМСО имеются агрегаты цепочечного строения, обусловленные кислородными связями. Ассоциаты нативного ДМСО легко разрушаются при добавлении веществ, являющихся донорами протонов, с образованием структур, включающих водородные и кислородные связи. Лекарственные субстанции, содержащие гидрокси- и аминные группы, способны к таким превращениям. Дефицит электронной плотности на атоме углерода и нуклеофильность атома кислорода карбонильных групп PLGA (или PLA, или PGA) способствует образованию в жидком ДМСО агрегатов сложного строения. Получение самоорганизованной и самоупорядоченной матрицы, свойственной наномиру [2], становится определяющим событием при комбинированном использовании ДМСО, PLGA, ПАВ, D-маннита (осмотический диуретик) и других лекарственных субстанций, являющихся донорами протонов. Такие системы стабильны при хранении и могут быть использованы по назначению.

Базируясь на изменениях упорядоченности структуры ДМСО в интервале температур от 20 до 60°С и его высокой активности в координационной сольватации, экспериментальным путем были найдены такие соотношения известной лекарственной субстанции (или комбинации субстанций), PLGA (50/50), полисорбат 80 и ДМСО, при которых образуются жидкие, однородные, прозрачные и стабильные при комнатных условиях средства (пример 1). В этих концентратах объемом до 5 мл содержится терапевтическая доза (или дозы) субстанции (или комбинации субстанций), необходимые для приема один раз в сутки [51]. При разбавлении полученных средств водой в соотношениях от 1:20 до 1:10 (или на 5 мл концентрата 50÷100 мл воды) образуются устойчивые опалесцирующие суспензии, содержащие наночастицы выше указанных [31, 32] эффективных размеров (пример 2). Возможность разбавления средств водой может быть использована для регулировки дозирования препаратов в зависимости от индивидуальных особенностей больного.

В опытах на лабораторных животных (мыши и крысы обоих полов, пероральное и внутримышечное введение) было показано, что полученные препараты практически нетоксичны (пример 3). Если выживаемость животных по прототипу [22] оценивалась в течение 7 суток, то в данном случае - 14 суток и даже в дозах в 5 и 10 раз превосходящих терапевтические значения побочных явлений или летальных исходов не было зафиксировано. Исследования препаратов на противомикробную активность в отношении грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий (пример 4) подтверждают факт значимого превосходства новых нанопрепаратов в сравнении с прототипом [22] и с контролем, представляющим собой стандартную (обычную) форму известной субстанции (D-циклосерин). При этом стандартная лекарственная форма антибиотика в концентрации 5% воздействует только на одну из семи тест-культур микроорганизмов, а препарат по прототипу [22] вводится в бактериальную среду трижды для получения противомикробного эффекта. Новые нанопрепараты воздействуют на все использованные тест-культуры при однократном введении в биосреду.

Экспериментальные данные этих двух примеров убедительно свидетельствуют о замедленном выделении в организме активно действующих веществ, об уменьшении их деградации на пути следования к биомишени и достаточно высоком быстродействии в отношении микроорганизмов разных типов.

Последующие примеры иллюстрируют различные аспекты изобретения. Однако эти примеры никоим образом не ограничивают данное изобретение или перечисления конкретных лекарственных субстанций, величин дозировки, тестовых процедур или других параметров, которые должны использоваться исключительно для осуществления изобретения.

Пример 1

Способ получения новых средств на основе известных субстанций

В трехгорлую стеклянную колбу, снабженную мешалкой, приводимую в действие электромотором, термометром и воздушным (обратным) холодильником, при 20÷25°С последовательно загружают ингредиенты, приведенные в таблицах 1, 2 и 3 в указанных процентных соотношениях. Смесь перемешивают и нагревают на колбонагревателе при 50÷60°С до полного растворения твердой фазы, после чего охлаждают до комнатной температуры в течение 20-30 мин. Готовые средства хранят в герметичной таре оранжевого стекла.

Примечание. Соотношение компонентов в средствах №1, №2, №3 подбиралось с учетом

- терапевтических доз лекарственных веществ;

- однородности средств в интервале температур 20÷25°С;

- стабильности основных показателей качества средств при хранении.

Указанные выше средства №1, №2, №3 представляют собой прозрачные однородные жидкости, устойчивые при хранении свыше года. При добавлении к ним воды в соотношении 1:20 до 1:10 образуются устойчивые опалесцирующие суспензии (препараты №1, №2, №3), определение размеров частиц которых приведено в примере 2.

Таким образом, заявленный способ получения препарата по сравнению с прототипом является более простым за счет уменьшения количества стадий и отсутствия стадии механического дробления.

Пример 2

Определение размеров частиц новых препаратов в водной среде

Определение размеров частиц и распределение размеров частиц по фракциям осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (Франция-США). Алгоритм измерений основан на программе CONTIN.

Предварительно смешанные с водой средства №1, №2 и №3 в соотношении 1:20 вносили в кювету с дистиллированной водой (3 мл) в количестве 10÷20 мкл и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 1 мин с помощью ультразвуковой ванны (Weswood Ultrasonics Ltd, Model 90S). Затем производили измерения. Результаты представлены в таблице 4.

Из таблицы 4 видно, что частицы препаратов имеют базовый размер 200-400 нм (для препарата №1 - 100%), при этом в препаратах 2 и 3 зафиксированы фракции с размером частиц 2,5-5 нм.

Пример 3

Оценка токсичности новых препаратов

Оценка токсичности полученных препаратов, указанных в примере 2, осуществлялась согласно принятых в РФ правил и методик проведения экспериментов на лабораторных животных [46, 47].

Острую токсичность определяли на мышах линии Balb-C и крысах Wistar обоего пола. Исследования токсического действия каждой дозы проводили на 10 животных (5 самцов и 5 самок). Для изучения острой токсичности препараты вводили внутримышечно с помощью шприца, а перорально - через атравматический металлический зонд, постепенно погружая его до желудка. Большие дозы достигались путем многократной аппликации препаратов с интервалом 30÷60 минут в течение 3÷4 ч. Оценивалось действие доз эквивалентных эффективным разовым терапевтическим дозам известных лекарственных субстанций (рифабутин, изониазид, пиразинамид, D-циклосерин, D-маннит [34, 36, 37, 51]), а также в 5 и 10 раз их превосходящих.

Установлено, что для полученных препаратов (пример 2) LD₅₀ для мышей и крыс при внутримышечном введении составляет 2÷3 г/кг, а при пероральной аппликации - более 12÷15 г/кг. Иными словами, новые препараты практически нетоксичны. При вскрытии подопытных и контрольных животных патологических изменений органов и тканей зафиксировано не было.

Пример 4

Оценка противомикробной активности новых препаратов

Оценку чувствительности грамположительных, грамотрицательных и атипичных бактерий в отношении новых препаратов (пример 2) проводили в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) [48] и действующих в РФ методических указаний [49].

Минимальные подавляющие концентрации препаратов в отношении тест-культур определяли методом серийных микроразведений в жидкой среде согласно рекомендаций NCCLS [50]. Кроме того, скорость роста микроорганизмов в присутствии суб- и суперингибирующих концентраций исследуемых препаратов оценивали по динамике оптической плотности бактериальных суспензий. Динамическое измерение оптической плотности проводили с помощью многоканального спектрофотометра Bioscren (Labsystems) при длине волны 610 нм с интервалом 20 мин. Планшеты с бактериальными суспензиями инкубировали при 37°С в термостатируемом модуле прибора. Исходная концентрация микроорганизмов составляла 5×10⁴ КОЕ/мл. Полученные результаты суммированы в таблице 5 и на чертеже.

В связи с изложенным заявленное изобретение позволяет получать доступным способом высокоэффективные препараты с противомикробным действием в виде наночастиц, которые предлагается применять для лечения различных заболеваний.

Источники информации

1. Производство продукции медицинского назначения. Терминологический словарь. Методические указания. МУ 64-01-001-2002. - 2003 г.

2. Пул Ч., Оуэне Ф. Мир материалов и технологий. Нанотехнологии. - М.: Техносфера. - 2006. - С.319-327.

3. Сидоренко С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия. // Русск. мед. журн. - 1998. - Т.6. - №1. - С.717-725.

4. Шайхавв Г.О. Туберкулез - проблема не только социальная. // Природа. - 1999. - №10. - С.5-8.

5. Cockburn J., Reid A.L., Bowman J.A., Sanson-Fischer R.W. Effects of intervention on antibiotic compliance in patients in general practice. // Med. J. Ast. - 1987. - V.147. - P.324-328.

6. Consilium Medicum. - 1999. - Т.2. - С.170-171. Ремедиум. - 2000.

7. Справочник Видаль. М.: - 2001. - С. Б-336.

8 Патент РФ №2195937. C1 - 2002 г.

9. Патент РФ №2182483. C1 - 2002 г.

10. Патент РФ №2247561. C1 - 2003 г.

11. Патент РФ №2247560. C1 - 2003 г.

12. Патент РФ №2247559. C1 - 2003 г.

13. Патент РФ №2197965. C1 - 2003 г.

14. Патент РФ №2185162. С2 - 2002 г.

15. Патент РФ №2240795. C1 - 2004 г.

16. Соколова Г.Б., Семенова О.В., Богадельникова И.В. и др. Майрин-П в комплексной терапии туберкулеза. // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - Т.47. - №6. - С.18-21.

17. Куничан А.Д., Соколова Г.Б., Перельман М.И. Влияние глутоксима на рост лекарственнорезистентных микобактерий туберкулеза при его сочетании с противотуберкулезными препаратами второго ряда в культуре легочной ткани мышей. // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - Т.47. - №6. - С.18-21.

18. Патент Великобритании №2135879.

19. Патент РФ №2146130.

20. Патент РФ №2087146. А61К 31/455 - 1997 г.

21. Патент РФ №2143900. А61К 31/455 - 2000 г.

22. Патент РФ №2185818. C1 - 2002 г.

23. Сидоренко С.В. Лекарственные формы фторхинолонов с замедленным высвобождением. // Антибиотики и химиотерапия. - 2004. - Т.49. - №12. - С.18-21.

24. Патент РФ №2146130. А61К 9/20 - 2000 г.

25. Патент РФ №2246946. А61К 31/47 - 2005 г.

26. Патент РФ №2241455. А61К 31/4164 - 2004 г.

27. Патент РФ №2226383. А61К 6/00 - 2004 г.

28. Патент РФ №2235537. А61К 9/08 - 2004 г.

29. Патент США №6264991. А61К 9/50 - 2001 г.

30. Патент РФ №2264827. А61К 45/08 - 2005 г.

31. Патент РФ №2145498. C1 - 1994 г.

32. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Красносельский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. // Вопросы медицинской химии. - 1999. - №1.

33. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. - М.: Академкнига. - 2006. - 400 с.

34. РЛС-Энциклопедия лекарств. Изд. 8-е, перераб. и доп. / Гл. ред. Ю.Ф.Крылов. - М.: "РЛС-2001" - 2000. - С.258.

35. Moghimi S.М., Hunter А.С; Murrey J.C. Long-circulating and targetspecific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol. Rev. - 2001. - V.53. - P.283-318.

36. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В двух частях. Ч.1. / 12-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина. - 1993. - С.381-382.

37. Там же. Ч.1 - С.586-597.

38. Патент РФ №2257198. С2 - 2005 г.

39. Патент РФ №2124886. C1 - 1999 г.

40. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №9. - С.54-59.

41. Оаэ С. Химия органических соединений серы. / Пер. с японск. - М.: Мир. - 1975. - С.223-278.

42. Инструкция по медицинскому применению препарата ДИМЕКСИД. Регистрационный номер: PN 003411/01 от 22.04.2005.

43. Yu Z.W., Quinn P.J. Dimethyl sulphoxide: a rewiew of its applications in cell biology. // Biosci. Rep. - 1994. - V.14. - P.259-281.

44. Патент РФ №2013090. C1 - 1994 г.

45. Ибрагимова В.X., Алиев Д.И. Радиопротекторная и противоопухолевая активность полиеновых антибиотиков в сочетании с диметилсульфоксидом. // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. - Т.47. - №9. - С.3-8.

46. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред. В.П.Фисенко. - М.: - 2000. - С.18-24, 107-113, 349-356.

47. Лабораторные животные: Положение и руководство. / Под ред. Н.Н.Каркищенко. - М.: - 2003. - 138 с.

48. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for antimicrobial susceptibility testing 13th and 14th informational supplement. NCCLS document M100-S13.2003 and document M100-S14.2004. Wayne, PA.

49. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04.2004. - 2004 г.

50. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Method for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically. Approved Standard M-7-A4. / 4th ed. Villanova.

51. Drug-resistand Tuberculosis: a survival guide for clinicias. / San Francisco, Francis J. Curry National Tuberculosis Center and California Department of Health Services. 2004.