Результат интеллектуальной деятельности: КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА mel Z, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности к получению клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцинотерапия является одним из иммунологических подходов в лечении онкологических заболеваний. Принцип данного метода основан на индукции противоопухолевого иммунитета после введения в организм опухолевого антигена.

Центральным событием в процессе Т-клеточной иммунной реакции против опухолевых клеток является стимуляция распознавания Т-рецепторами антигенных детерминант, избирательно экспрессированных на опухолевых клетках. Опухолевые антигены, как правило, подвергаются процессингу перед их презентацией в контексте молекул гистосовместимости на клеточной поверхности. Различные категории опухолеассоциированных антигенов можно разделить на три главные группы: раково/тестикулярные антигены (MAGE, BAGE, PRAME, NY-ESO-1, HOM-MEL-40), дифференцировочные антигены меланоцитов (тирозиназа, Melan-A/MART-1, gp100, TRP-1, TRP-2) и мутированные антигены (MUC-1, CDK4, β-катенин gp100-in4, p15, N-ацетилглюкозоаминтрансфераза V). С иммунологической точки зрения раково/тестикулярные антигены могут быть хорошими мишенями для иммунотерапии опухолей, поскольку в нормальных тканях эта группа антигенов (MAGE и PRAME) не экспрессируется, за исключением ткани яичек, которые не доступны для клеток иммунной системы из-за отсутствия их прямого контакта с иммунокомпетентными клетками [1] и отсутствия на них экспрессии HLA антигенов I класса [2]. В отличие от раково/тестикулярных антигенов, иммуногенность дифференцировочных антигенов меланоцитов невысока из-за иммунологической толерантности к этим "своим" антигенам. Однако такой антиген, как Melan-A/MART-1, содержит несколько эпитопов для узнавания ЦТЛ (питотоксические лимфоциты) и способен индуцировать генерацию меланомаспецифичных ЦТЛ.

Таким образом, экспрессия различных опухолевых маркеров играет одну из ключевых ролей в индукции противоопухолевого иммунитета. Разнообразие соответствующих антигенов позволяет более «комплементарно» подбирать клеточные линии для создания противоопухолевых вакцин.

Вакцины, приготовленные на основе опухолевых клеток, являются цельноклеточными вакцинами и представляют собой живые аллогенные или аутологичные опухолевые клетки.

Аутологичные/сингенные цельные опухолевые клетки заключают в себе практически все антигены, экспрессированные опухолью хозяина, что снижает риск появления аллергических реакций на чужеродные неопухолеспецифичные антигены, а также снижается риск контаминации патогенными вирусами и внутриклеточными паразитами. Вакцина, состоящая из нескольких клеточных линий (поливалентная вакцина), содержит широкий спектр опухолевых антигенов и используется как аллогенная. Такая поливалентная вакцина, как вакцина Mortona и соавт.[3], состоит из трех аллогенных меланомных клеточных линий с высокой экспрессией поверхностных иммуногенных глико- и липопротеинов и ганглиозидов. Клинические испытания такой вакцины показали, что развитие иммунного ответа как клеточного, так и гуморального типа на эти антигены коррелировало с повышением выживаемости пациентов. Другая вакцина, «Melacine» [4] (Corixa corp., Canada), состоящая из лизата аллогенных меланомных клеточных линий, вызывает противоопухолевый эффект у 5-10% больных меланомой.

Задачей настоящего изобретения является получение новой опухолевой клеточной линии меланомы человека, несущей определенный набор антигенов, что позволит использовать ее в создании противоопухолевых вакцин.

Технический результат, получаемый при использовании изобретения, выражается в расширении арсенала клеточных линий, используемых для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличения продолжительности жизни при лечении злокачественных новообразований.

Поставленная задача решается тем, что получена новая клеточная линия mel Z из опухолевого образца диссеминированной меланомы кожи человека.

Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Хранится в коллекции клеточных культур института цитологии РАН под номером РККК(П) 711Д.

Родословная клеточной линии melZ

Линия клеток получена из опухолевого образца пациентки З.З.С., женского пола, 55 лет, и/б 03/12300, находившейся на лечении в 2003 г. с диагнозом диссеминированная меланома кожи спины. Материал получен при хирургическом удалении метастатического узла из мягких тканей межлопаточной области. Предыдущее лечение: хирургическое, химиотерапия, иммунотерапия.

Получение клеточной линии melZ

Опухолевая ткань получена при хирургическом удалении метастазов кожи. Полученную суспензию клеток засевали во флаконы и культивировали в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 20 пассаже.

Морфологические признаки mel Z

Цитограмма культуры mel Z состоит из клеток веретенообразной, вытянутой удлиненной, отросчатой формы и немногочисленных клеток округлой формы. Ядра клеток овальной, округлой и неправильной формы, нормо- и гиперхромные с зернистым и грубоглыбчатым строением хроматина. Ядра содержат одно или несколько мелких ядрышек. Цитоплазма клеток негомогенная, умеренно базофильная с розоватым оттенком. Имеются двух ядерные клетки и небольшое количество гигантских многоядерных клеток с 4-6 ядрами. Часто выявляются фигуры деления клеток.

Кариологическая характеристика клеточной линии melZ

Дата фиксации клеток: 27.04.06

Культура равномерна по диаметрам ядер, плотности окраски и состоянию хроматина. Проанализировано 43 метафазы. Число хромосом колеблется от 44 до 46. Модальное число хромосом соответствует диплоидному набору (2n). Наблюдается трисомия по хромосоме 7; моносомия по хромосоме 11; дериватная хромосома, состоящая из короткого плеча хромосомы 1, длинного плеча хромосомы 9 и сегмента хромосомы 1 проксимальнее 1р31, транспонированного на конец короткого плеча хромосомы 1; транслокация двух длинных плеч хромосомы 1 с образованием изохромосомы; транслокация короткого плеча 6 и длинного плеча 9 хромосом; транслокация части длинного плеча 6 хромосомы на конец длинного плеча 17 хромосомы (сегмент хромосомы 6 дистальнее 6q22 транслоцировался на хромосому 17 в участке 17q24). Таким образом, дисбаланс кариотипа заключается в частичной моносомии по короткому плечу хромосомы 1, трисомии по короткому плечу хромосомы 6, трисомии по хромосоме 7, нуллисомии по короткому плечу хромосомы 9 и моносомии по хромосоме 11.

Kapиотип - 44~46,XX,der(1;1;9)(1pter→1p31::1p36→1p10::9q10→9qter),

i(1)(qter→q10::q10→qter),der(6;9)(6pter→6p10::9q10→9qter),

t(6;17)(6pter→6q22::17q24→17qter;17pter→17q24::6q22→6qter),+7,-11

Культуральные свойства клеточной линии melZ

Клеточная линия met Z культивируется в питательной среде RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, содержащей антибиотики (пенициллин со стрептомицином в концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно). В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевают 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Монослой клеток формируется через 3-4 дня. При посевной концентрации 70-100 тыс./мл монослой формируется на 2-3 сутки без смены среды. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов: 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 1:1. При посевной концентрации 500 тыс./мл индекс пролиферации через 48 часов культивирования составляет 3.6-4.6.

Условия криоконсервации

Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Клетки ресуспендируют в среде для замораживания - питательная среда RPMI (90%), эмбриональная телячья сыворотка 10%, 10%ДМСО. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до минус 25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре минус 196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см³. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трипанового синего. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 90%.

Контаминация

При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.

Примеры использования клеточной линии melZ

Пример 1. Культивирование клеточной линии met Z

Опухолевую ткань, полученную хирургическим путем при удалении метастазов меланомы кожи, разделяли механически на фрагменты величиной 2-3мм³ в среде RPMI-1640, затем, используя «Cell dissociation sieve-tissue kit» (Sigma), получали суспензию клеток. Количество жизнеспособных клеток определяли по стандартной методике в камере Горяева, используя 0,5% раствор трипанового синего в PBS. В культуральные флаконы объемом 25 см³ в 5 мл среды засевали 1×10⁶ клеток. Температура культивирования 37°С. Клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед./мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab.) в культуральных флаконах (Costar). После 20 пассажа получена стабильно растущая клеточная линия.

Пример 2. Определение антигенов, экспрессированных на клеточной линии mel Z

Полученная клеточная линия mel Z, обладающая стабильными культуральными и морфологическими характеристиками, с помощью методов иммунофлюоресценции была исследована на экспрессируемые антигены (дифференцировочные, гистосовместимости, раково-тестикулярные).

Дифференцировочный меланомный маркер, определяющий отношение данной линии к меланоме, исследован нами с помощью моноклональных антител CD63. Антигены гистосовместимости определены с помощью моноклональных антител в реакции иммунофлюоресценции. Раково-тестикулярные маркеры, которые могут быть экспрессированы на опухолях различного гистогенеза, исследованы в реакции ПЦР. Полученные данные отражены в таблице.

Как следует из таблицы, данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомного маркера CD63, подчеркивающего специфичность данной клеточной линии. Слабо положительная экспрессия раково-тестикулярных маркеров класса MAGE (слабо положит.) соответствует онкологическому профилю и позволяет широко использовать данную линию для создания противоопухолевой вакцины. Антигены гистосовместимости представлены молекулой первого класса (HLA).

Данная клеточная линия характеризуется экспрессией меланомного дифференцировочного маркера CD63, антигена первого класса гистосовместимости и раково-тестикулярных маркеров класса MAGE (слабо положит.). Антиген гистосовместимости второго класса отсутствует.

Таким образом, данная клеточная линия меланомы кожи человека имеет свой индивидуальный фенотип опухолевых маркеров, заключающийся в наличии дифференцировочного антигена CD63; молекулы гистосовместимости первого класса и слабо положительных раковотестикулярных маркеров класса MAGE, что позволяет применять полученную клеточную линию для создания противоопухолевых вакцин (цельноклеточных, генноинженерных), используемых для лечения меланомы и других злокачественных новообразований.

Литература

1. Barker C.F. et al. Immunologically privileged sites. ADV. Immunol. 1977, 25:1-54.

2. Tomita Y. et al. Immunohistochemical detection of intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and major histocompatibility complex class I antigens in seminoma J. Urol. 149:659-663, 1993.

3. Morton DL et al. Ann N Y Acad Sci 1993; 690:120.

4. Sondak V.K. Sosman J.A. Results of clinical trials with an allogenic melanoma tumor cell lysate vaccine: Melacine/ Semin cancer Biol. 2003. Dec.13(6):409-15.