СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ ПАЦИЕНТА К НАСЛЕДСТВЕННОЙ МАКУЛОДИСТРОФИИ ШТАРГАРДТА

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Из существующего уровня техники известно, что генетические мутации могут существенным образом влиять на проявление генов и приводить к заболеваниям, связанным с потерей зрения. Основными типами тканей, которые подвержены патологиям систем зрения, является эпителий ретины и фоторецепторы сетчатки глаза. Определить структуру генов, проявляющихся в патологических тканях, не представляется возможным в связи с инвазивностью процесса взятия материала глаза и возможно чрезвычайно низким уровнем проявлением генов. Настоящее техническое решение позволяет существенно снизить инвазивность и травматичность диагностических процедур по определению генетических особенностей заболеваний глаза.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является US 2010299765, опубл. 2010-11-25. В патенте приведен способ получения клеток сетчатки глаза, из эмбриональных стволовых клеток человека. В результате использования определенных условий культивирования методами направленной дифференцировки заявленным способом получаются клетки пигментированного эпителия ретины и фоторецепторные предшественники сетчатки глаза пригодные для трансплантации. Однако, первичным источником клеток являются аллогенные эмбриональные стволовые клетки. В связи с этим, основным недостатком данного технического решения, который не позволяет использовать полученную культуру сетчатки глаза для диагностики, является использование эмбриональных стволовых клеток, которые затруднительно получать для живущих людей, страдающих наследственными дефектами зрения. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа диагностики генетических мутаций клеток глаза человека, получаемых из фибробластов кожи.

Новым техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является возможность проведения диагностики мутаций генов, характерных для пигментированных клеток ретины и фоторецепторов, не прибегая к инвазивному взятию материала клеток глаза живого человека.

Для этого предложен способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта, включающий взятие фибробластов кожи у этого пациента, их культивирование и обработку вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера, последующее культивирование для направленной дифференцировки фибробластов в клетки ретины и дальнейшее исследование клеток ретины на наличие мутации в экзоне 39-41 гена АВСА4, и по наличию делеции в этом экзоне диагностируют предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта.

Т.е., в заявленном способе фибробласты кожи репрограммируются генетическими факторами, позволяющими дифференцировать клеточную популяцию в клетки эпителия ретины и фоторецепторы глаза, экспрессирующие нормальные и мутантные гены, специфические для проведения генетических тестов с помощью полимеразной цепной реакции.

Описание способа диагностики

В качестве модельной системы были использованы фибробласты кожи людей с проявлением заболевания Штаргардта. В процессе индивидуального развития у этих людей происходит постепенная потеря зрения вплоть до полной слепоты. В основном, заболевание связано с мутациями в гене АВСА4, однако известно ограниченное количество генетических мутаций (http://www.med-gen.ru/science/staff/dnklab/). Поиск новых мутаций, которые могут не затрагивать структурную часть гена может быть затруднен или невозможен в связи с недоступностью эпителия ретины и фоторецепторов для анализа. ДНК фибробластов кожи пациентов носителей Штаргардта была проанализирована на наличие известных мутаций с негативным результатом. Для обнаружения мутаций необходимо исследовать кодирующую РНК известных генов, например АВСА4, на долю которого приходится до 70% известных мутаций. Однако эта РНК обнаруживается только в специализированных клетках ретины. Для получения специализированных клеток ретины фибробласты кожи культивировали в DMEM (ПанЭко, РФ), 15% фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone, США), 2 мМ глутамин (Hyclone, США), 50 ед./мл пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, РФ). Через 2 недели после культивирования 4×10⁴ клеток обработываются вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера (1). Клетки далее культивируются в среде DMEM/F12 (Hyclone, США), 20% Serum replacement (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамин (Hyclone, США), 0.1 мМ β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich, США), 1% смесь аминокислот (Hyclone, США), bFGF 4 нг/мл (PeproTech, США), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, РФ) до образования колоний (Фиг.1) Через 10 дней образовавшиеся колонии переносятся в дифференцировочную среду: DMEM/F12 с добавлением N2 саплемента, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 150 mM аскорбиновой кислоты, 3% фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone, США) (2) и культивирование продолжается еще 3 недели. Через 3 недели на чашках формируется характерный слой окрашенных клеток (Фиг.2). Тотальная РНК из клеточных культур выделяется с помощью MiniRNA kit (Qiagen, США) согласно прилагающимся инструкциям. Обработку ДНКазой осуществляется непосредственно на колонках, с использованием прилагающихся к набору MiniRNA kit ДНКазы и буфера. Реакцию обратной транскрипции проводится с использованием случайных шестинуклеотидных праймеров (Amersham Biosciences, США), M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, США), Ribonuclease Inhibitor (Promega, США), dNTPs (Fermentas, США) согласно прилагающимся инструкциям. На одну реакцию берется 0.5-1 мкг тотальной РНК. Для проведения ПЦР-амплификации продуктов реакции обратной транскрипции берется 0.05-0.1 часть реакционной смеси. ПЦР-амплификацию проводят с помощью ScreenMix (Евроген, РФ) согласно инструкциям производителя. Список использованных в работе праймеров приведен в таблице.

Амплификацию соответствующих фрагментов проводят в режиме 95°C - 3 мин, затем в течение 35 циклов: 94°C - 1 мин, 55°C - 1 мин, 72°C - 1 мин. После этого определяется полная нуклеотидная последовательность, полученного набора фрагментов и сравнивается с известной последовательностью гена АВСА4 (Фиг.3). Отсутствие комплементарных нуклеотидов свидетельствует о мутации гена.

При клинических испытаниях предлагаемого способа диагностики были обследованы 8 здоровых человека и 3 пациентов с клиническими признаками макулодистрофии Штаргардта. В результате этого среди пациентов с макулодистрофии Штаргардта был обнаружен носитель мутации в гетерозиготе с делецией 39-41 экзонов, среди здоровых ни одного носителя таких генотипов выявлено не было.

Определяющим существенным отличием заявляемого способа по сравнению с прототипом является использование индивидуальных клеток ретины, полученных после обработки фибробластов кожи вирусными векторами и применение дифференцировочной среды для получения клеток ретины.

Список литературы.

1. Shutova M, Chestkov I, Bogomazova A, Lagarkova M, Kiselev S.L., Generation ofiPS cells from human umbilical vein endothelial cells by lentiviral transduction, and their differentiation to neuronal lineage. In: Kaiming Ye and Sha Jin (eds.). Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols, Springer Protocols Handbooks, DOI 10.1007/978-1 -61779-267-OJ 1, © Springer Science+Business Media, LLC 2011

2. M.A. Lagarkova, M.V. Shutova, A.N. Bogomazova, E.M. Vassina, E.A. Glazov, P Zang., A.A Rizvanov., I.V. Chestkov., S.L. Kiselev. Induction ofpluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell Cycle. 2010 Mar; 9(5):937-46.