Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ МЕТАСТАЗОВ В ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ

Изобретение относится к медицине, а именно, к молекулярной онкологии, и касается способа прогнозирования развития метастазов у больных раком толстой кишки (РТК) на основе анализа экспрессии генов MAGEB1, SSX2 и SCP1 в опухолевой и нормальной ткани.

Во всем мире ежегодно регистрируется порядка 1 миллиона случаев рака толстой кишки и около 715000 смертей от этого заболевания, что ставит его на 4-ое место по показателю смертности. В России с 2006 по 2016 гг.значительно увеличилась распространенность рака толстой кишки. По причине поздней диагностики летальность при раке толстой кишки достигает величины 40% в течение года с момента выявления болезни (Кит О.И., Солдатова К.И., Кутилин Д.С., Водолажский Д.И. Раково-тестикулярные антигены в диагностике опухолей толстой кишки // Современные проблемы науки и образования. - 2018. - №2.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27449 (дата обращения: 19.09.2018)). Большинство смертей от рака толстой кишки связаны с метастатическим поражением. Из-за особенностей венозного оттока от кишечника, который осуществляется через систему воротной вены печени, наиболее часто при колоректальном раке метастазы обнаруживаются в печени. По данным некоторых авторов, наличие метастазов в печени при колоректальном раке достигает 50%, а пятилетняя выживаемость без специфического лечения не превышает 2% ( L., Ferrero A., Lo Tesoriere R., Capussotti L. Liver surgery for colorectal metastases: results after 10 years of follow-up.Long-term survivors, late recurrences, and prognostic role of morbidity // Ann Surg Oncol, 2008, 15 (9). - P. 2458-2464).

Раково-тестикулярные антигены (РТА, Cancer Testis Antigens (СТА)), экспрессируются в опухолях различного гистологического происхождения, и практически не экспрессируются в нормальных тканях (за исключением семенников, плаценты и мозга) (см. Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Могушкова Х.А., Кит О.И., Особенности транскрипционной активности раково-тестикулярных антигенов у больных метастатическим и неметастатическим раком молочной железы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018 г., Том 165, №3. - 360-364).

Многочисленные исследования экспрессии РТА в опухолях толстой кишки показали, что отдельные представители разных семейств РТА (LAGE-1, MAGEA3, MAGEA4, MAGE-A6, SPAG9, TSP50 и др.) обладают большим потенциалом как в диагностике и прогнозировании развития, так и иммунотерапии опухолей кишечника (см. Кит О.И., Солдатова К.И., Кутилин Д.С., Водолажский Д.И. Раково-тестикулярные антигены в диагностике опухолей толстой кишки // Современные проблемы науки и образования. -2018. - №2.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27449 (дата обращения: 19.09.2018), Sammut J., Wakeman J.A., Stuart N., McFarlane R.J. Cancer/Testis Antigens and Colorectal Cancer // J. Genet. Syndr. Gene. Ther. -2013. - 4:149. doi:10.4172/2157-7412.1000149).

MAGEB1 (Melanoma Antigen Family B1) относится к семейству MAGEB, информация о прогностическом потенциале отсутствует (см. NCBI).

Продукт гена SSX2 (Sarcoma, Synovial, X-Chromosome-Related 2) относится к семейству высоко-гомологичных белков SSX, выполняющих функцию транскрипционных репрессоров, а также способных вызывать спонтанные гуморальные и клеточные иммунные реакции у больных раком и являются мишенями в иммунотерапии (см. GENECARDS, www.genecards.org, Weizmann Institute of Science). Также известно, что уровень экспрессии генов SSX1-4 может использоваться в прогнозировании течения колоректального рака (см. Голышко П.В., Барышников К.А., Барышников А.Ю. Иммуногенные раково-тестикулярные антигены и их гены при злокачественных новообразованиях // Российский биотерапевтический журнал. - 2015. Т. 2. С. 31-38.)

Продукт гена SCP-1(SYCP1, Synaptonemal Complex Protein 1) является основным компонентом поперечных филаментов синаптонемальных комплексов, образующихся между гомологичными хромосомами во время профазы мейоза. Требуется для нормальной сборки центрального элемента синаптонемальных комплексов и нормального центромерного спаривания во время мейоза (см. GENECARDS, www.genecards.org, Weizmann Institute of Science). В литературе имеются данные о том, что SCP-1 может служить маркером локального метастазирования при раке толстой кишки (см. Li М., Yuan Y.H., Han Y. et al. Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancer tissue and adjacent normal tissue. // Clin Cancer Res. - 2005. - 11(5) - P. 1809-14.).

Анализ патентных источников показал наличие следующих (близких по тематике данному) изобретений:

1. Патент RU №2623119 (опубл. 22.06.2017, Бюл. №18) «Способ определения степени риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки», основан на определении уровня химотрипсинподобной активности протеасом и общей кальпаиновой активности в опухоли, причем в качестве калибратора используют нормальную ткань.

2. Патент RU №2642247 (опубл. 24.01.2018, Бюл. №3) «Способ диагностики метастазов колоректального рака в печень», основан на определении содержания меди в плазме периферической крови.

3. Патент RU №2016115679 (опубл. 26.10.2017, Бюл. №30) «Способ диагностики метастазов рака толстой кишки», основан на анализе метилирования CpG-сайтов генов АРС, CDH13 и MGMT.

4. Патент RU №2647470 (опубл. 15.03.2018, Бюл. №8) «Способ диагностики метастазов рака толстой кишки», основан на анализе метилирования CpG-сайтов гена CDH13.

Описанные изобретения используют более трудоемкие, сложные и дорогостоящие в анализе способы и алгоритмы расчета результатов, при этом обладающие меньшей чувствительностью и специфичностью (из-за анализируемых параметров), чем предлагаемый нами.

Изобретение «Способ прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки» является новым, так как относительная экспрессия данных РТ-генов ранее не использовалась для заявленной в способе цели.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа прогнозирования развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки.

Технический результат достигается тем, что проводят амплификацию в режиме реального времени в присутствии красителя EvaGreen Dye с использованием высокоспецифичных праймеров для генов MAGEB1, SSX2, SCP1, GAPDH и GUSB проводят анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора, рассчитывают относительную экспрессию генетических локусов по формуле l,95^-ΔmCt, где mC_t - среднее по трем повторам для целевого локуса и среднее геометрическое референсных генов GAPDH и GUSB, величина ΔmC_t = mC_t(ген мишень) - mC_t(GAPDH и GUSB), вычисляют коэффициент экспрессии генов - К_MAGEB1, К_SSX2, К_SCP1 по формуле К=rE_cancer/rE_normal, где rE_cancer - относительная экспрессия генов в опухолевой ткани, rE_normal - относительная экспрессия генов нормальной ткани толстой кишки, и при значениях К_MAGEB1>2,2±0,5, К_SSX2>2,2±0,4 и К_SCP1<2,7±0,6 прогнозируют отсутствие метастазов (чувствительность 75%), а при значениях К_MAGEB1<0,4±0,2, К_SSX2<0,7±0,3 и К_SCP1>8,5±0,8 прогнозируют развитие метастазов (чувствительность 75%).

Заявленный способ включает следующие приемы: выделение тотальной РНК из тканевых проб с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции; определение относительной экспрессии генетических локусов методом ПЦР-РВ в присутствии красителя EvaGreen Dye и специфичных праймеров на матрице синтезированной кДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет экспрессии гена на основании соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемых и референсных последовательностей, и обработка данных на соответствие значениям коэффициентов экспрессии, характерным для групп пациентов с метастазами или без метастазов в печень.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе отбирают образцы тканей пациентов - опухолевые и условно здоровые, из операционного материала или биопсии. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения немедленно замораживают в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, дополнительно растирают в фарфоровых ступках (либо в специальном гомогенизаторе, например MagNA Lyser Instrument, Roche) в присутствии лизирующего раствора, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол.

Затем в лизат добавляют 1М цитрат Na рН 4,0, кислый фенол и смесь хлороформ/изоамиловый спирта, перемешивают на вортексе и охлаждают образцы при 0°С в течение 15 мин.

Дальнейшее выделение РНК из тканей проводят по методу по Р. Chomczynski & N. Sacchi (2006) (см. Chomczynski Р, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006; 1(2):581-5).

Выделенная РНК обрабатывается ДНКазой. Перед проведением реакции обратной транскрипции для проверки качества выделенной РНК проводят электрофорез в 2% геле агарозы (см. Кутилин Д.С., Бондаренко Т.И., Корниенко И.В., Михалева И.И. Влияние пептида дельта-сна на экспрессию генов антиоксидантных ферментов в мозге и крови крыс при физиологическом старении организма // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. Т. 157. №5. С. 634-637). Также перед проведением реакции обратной транскрипции необходимо измерить концентрацию полученных препаратов РНК на флюориметре и нормолизовать ее до 2 нг/мкл.

Синтез кДНК можно проводить с использованием коммерческих наборов основанных на применении обратной транскриптазы M-MuLV Reverse Transcriptase и случайных праймеров (random hexamer).

Реакцию обратной транскрипции проводили при 37°С в течение 30 минут.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 25 мкл ШДР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1х-ый ПЦР-буфер и 0,1 еа ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, краситель EVA-Green и по 530 нМ прямого и обратного праймеров

для референсных генов (GAPDH и GUSB) или гена-мишени. Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank (см. таблица 1).

Количественную ПЦР-РВ амплификацию проводили на термоциклере в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе. Первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин. 40 циклов: t=95°C в течение 10с, t=58°C в течение 30с, t=72°C в течение 15с.

В одной постановке в качестве матрицы использовали одновременно кДНК опытной (опухоль) и контрольной (условно здоровая ткань) пробы для определения сигналов, продуцируемых амплификатами РТ-генов и референсных генов GAPDH и GUSB, каждого в трех повторностях.

Относительная экспрессия генетических локусов вычислялась следующим образом:

- рассчитывали среднее C_t по трем повторам для целевого локуса и референсных GAPDH и GUSB,

- далее рассчитывали величину ΔmC_t=mC_t(ген мишень) - mC_t(GAPDH и GUSB)

- относительную экспрессию генетического локуса (rE) рассчитывали по формуле l,95^-ΔmCt.

Вывод об изменении экспрессии гена делали, сравнивая показатели относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой и условно здоровой ткани.

Для этого вычисляли медиану rE_cancer опухолевых образцов и медиану rE_normal контрольных (условно здоровая ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани толстой кишки: К=rE_cancer/rE_normal.

Для доказательства прогностической ценности генов MAGEB1, SSX2, SCP1 приводим выписки из историй болезни.

1) Больная ILL, 68 лет, госпитализирована в апреле 2018 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 РНИОИ с диагнозом рак прямой кишки, St III.

Проведено УЗИ и СРКТ органов брюшной полости, обнаружены диффузные изменения паренхимы печени. При колоноскопии рак прямой кишки.

Результаты молекулярно-генетического анализа образцов биопсии (получены во время колоноскопии) прямой кишки К_MAGEB1=0,33; К_SSX2=0,71 и К_SCP1=9,4 соответствуют прогностическим коэффициентам развития метастазов в печени.

Больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения - передне-верхняя резекция прямой кишки с расширенной лимфаденэктомией. Послеоперационный гистологический анализ: T3aN1M0, G2 аденокарцинома с муцинозным компонентом (менее 5%) с изъязвлением, прорастанием всех слоев стенки кишки, с инвазией в серозную оболочку, сосудистые и периневральные пространства, в лимфатических узлах микрометастаз аденокарциномы, линия резекции без признаков опухолевого роста.

После консультации химиотерапевта показаны курсы АХТ. Состояние при выписке: удовлетворительное.

При повторном обращении через 4 месяца на СРКТ в левой доли печени подозрение на метастаз рака прямой кишки до 1 см, проведена биопсия печени.

Ранее проведенный молекулярно-генетический анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - в печени метастаз аденокарциномы с муцинозным компонентом.

После консультации химиотерапевта показаны курсы АПХТ. Состояние при выписке: удовлетворительное.

2) Больная Д., 61 год, госпитализирована в марте 2017 г. в отделение абдоминальной онкологии №1 РНИОИ с диагнозом рак сигмовидной кишки, St II.

Проведено УЗИ органов брюшной полости, обнаружены признаки кисты левой доли печени, диффузные изменения паренхимы печени. При колоноскопии рак сигмовидной кишки (на 27 см от ануса) и единичные дивертикулы сигмовидной кишки. На СРКТ киста левой доли печени до 1.3 см.

Результаты молекулярно-генетического анализа образцов биопсии (получены во время колоноскопии): К_MAGEB1=2,03; К_SSX2=2,60 и К_SCP1=1,4 соответствуют прогностическим коэффициентам отсутствия метастазов. Проведено хирургическое лечение - операция лапаротомия, резекция сигмовидной кишки с расширенной лимфаденэктомией.

Молекулярно-генетический анализ подтвержден результатами послеоперационного гистологического анализа - T₂N₀M₀. Гистологическое исследование: G2 аденокарцинома, метастазов нет.

После консультации химиотерапевта курсы АХТ не показаны.

Больная наблюдается по настоящее время без признаков рецидива и метастазов.

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование метастазов в печень у 25 пациентов с диагностированным раком толстой кишки.

Заявляемый способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии, без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 8 часов.