СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВОВ РАКА ТЕЛА МАТКИ НА ОСНОВАНИИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ PTEN И CYP1B1

Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной биологии, онкологии, и касается способа прогнозирования вероятности развития рецидивов рака тела матки.

Рецидивы являются одной из ведущих причин неудач в лечении рака тела матки. Частота возникновения рецидивов достигает 40% (см. Урманчеева А.Ф., Ульрих Е.А., Нейштадт Э.Л. и др. Серозно-папиллярный рак эндометрия. Клинико-морфологические особенности. Вопросы онкологии 2002; 48 (6): 679-83). Более 80% рецидивов возникает в первые 2 года после радикального лечения (см. Кузнецов В.В., Нечушкина В.М. Хирургическое лечения рака тела матки. Практ. онкология 2004; (17): 25-32). Причины и сроки возникновения поздних рецидивов не определены и достаточно не изучены, но, скорее всего, зависят от биологических особенностей опухоли.

Главную роль в развитии злокачественных опухолей тела матки, самых распространенных опухолей органов малого таза у женщин, может играть гиперэстрогения эндогенного или экзогенного происхождения (см. World Cancer Report 2014. World Health Organization. Chapter 5.12.; Causes, Risk Factors, and Prevention TOPICS - Do we know what causes endometrial cancer? - cancer.org - American Cancer Society - Retrieved 5 January 2015). Биологический эффект эстрогенов реализуется через их взаимодействие с эстрогеновыми рецепторами, которые, в свою очередь, активируют гены-мишени во многих тканях. Цитохром Р450 1В1 (ген CYP1B1) катализирует гидроксилирование 17-бета-эстрадиола в С-4 положении. 4-гидрокси эстрогены получили особое внимание из-за их важной роли в злокачественной трансформации различных органов.

Продукт гена PTEN-фосфатаза с двойной субстратной специфичностью, является одним из немногих негативных регуляторов PI3K/AKT/mTOR - сигнального пути, что позволяет рассматривать ее в качестве онко-супрессора. Ген PTEN часто бывает мутирован при различных типах злокачественных опухолей. PTEN катализирует отщепление фосфатной группы в положении 3D инозитольного кольца фосфатидилинозитол-3-фосфатов, тормозя передачу сигнала по PI3K/AKT/mTOR-сигнальному пути. Нормальная работа PTEN необходима для контроля за пролиферацией клеток и их внедрением в соседние ткани. В соответствии с антионкогенной функцией PTEN нарушение его нормальной работы приводит к формированию опухолей. Мутации в гене PTEN ассоциированы с несколькими наследственными синдромами, характеризующимися развитием множественных доброкачественных опухолей в различных органах и тканях. Кроме того, инактивирующие мутации или биохимическая инактивация PTEN обуславливают предрасположенность к ряду онкологических заболеваний, таких как рак простаты, эндометрия и глиома (см. Maxwell G.L., Risinger J.I., Gumbs С., Shaw Н., Bentley R.C., Barrett J.С., Berchuck A. Mutation of the PTEN tumor suppressor gene in endometrial hyperplasia′s., Futreal P.A. Cancer Res. 1998, 58: 2500-2503).

Поэтому в качестве маркеров для прогнозирования рецидивов рака тела матки целесообразно использование коэффициента экспрессии генов, ответственных за метаболизм стероидов (CYP1B1) и негативную регуляцию PI3K/AKT/mTOR-сигнального пути (PTEN).

Анализ патентных источников показал наличие близких по тематике данному изобретений:

1) «Способ определения эффективности лечения рака тела матки» (см. патент RU 2424806 С1, МПК А61K 31/513, А61Р 35/00, А61В 17/00, A61N 5/10, опубл. 27.07.2011). Авторами на основе определения коэффициента соотношения тетрагидро-11-дезоксикортизола к кортизолу через 1,5-2 недели после окончания лечения в суточной моче был возможен прогноз длительности безрецидивного периода.

2) «Способ прогнозирования развития рецидива при раке тела матки» (см. патент RU 2250077 С2, А61В 10/00, G01N 33/573, G01N 33/574, опубл. 20.04.2005) включает биохимическое исследование в ткани злокачественной опухоли и эндометрия, при этом до и после проведения комплексного лечения определяют активности катепсина Д и кислото-стабильных ингибиторов, рассчитывают коэффициент соотношения катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов и при уровне коэффициента, превышающем показатели, характерные для ткани интактного эндометрия, более чем в 2,4-2,8 раза, прогнозируют развитие рецидива рака эндометрия в срок до 6 месяцев.

Описанные изобретения используют в анализе способы, обладающие меньшей чувствительностью и специфичностью, чем предлагаемый авторами изобретения.

Изобретение «Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов PTEN и CYP1B1» является новым, так как данная панель генов ранее не использовалась для заявленной в способе цели.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, простого в исполнении, не дорогостоящего и более точного способа прогнозирования развития рецидивов у больных раком тела матки.

Заявляемый способ является экономически оправданным, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии методом RT-PCR, без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, регистрацию результатов производят однократно в конце исследования, способ занимает менее 10 рабочих часов.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что используют высокоспецифичные праймеры для генов PTEN, CYP1B1 и АСТВ, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии К, сравнивают полученные значения К с прогностическим коэффициентом экспрессии и при значениях К_PTEN=1,55±0,16 и К_CYP1B1=0,94±0,12 прогнозируют отсутствие рецидивов, а при значениях К_PTEN=0,76±0,14 и К_CYP1B1=1,34±0,20 прогнозируют развитие рецидивов.

Заявленный анализ основан на определении экспрессии перечисленных выше генов, предварительно нормализованных относительно значений референтного локуса АСТВ, и последующем вычислении соотношения экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани: К=E_cancer/E_normal.

Заявленный способ включает следующие этапы: выделение тотальной РНК из тканевых проб с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции; определение относительной экспрессии генетических локусов методом RT-PCR в присутствии красителя EVAGreen и специфичных праймеров на матрице синтезированной кДНК; анализ первичных данных с помощью программного продукта амплификатора; расчет экспрессии гена на основании соотношения сигналов, продуцируемых ампликонами изучаемой и референсной последовательностей, и статистическая обработка данных на соответствие значениям прогностических коэффициентов экспрессии, характерным для групп пациенток с рецидивом или без рецидива заболевания.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

На первом этапе отбирают образцы тканей пациенток - опухолевые и условно здоровые, из операционного или биопсийного материала. Образцы для транспортировки в лабораторию и хранения замораживают в жидком азоте.

Фрагменты ткани измельчают скальпелем и/или ножницами, дополнительно растирают в фарфоровых ступках на холоду в присутствии лизирующего раствора, содержащего 4М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол. Затем в лизат добавляют 1М цитрат Na pH 4,0, кислый фенол и смесь хлороформ/изоамиловый спирт, перемешивают на вортексе и охлаждают образцы при 0°С в течение 15 мин. Дальнейшее выделение РНК из тканей проводят по методу по P. Chomczynski & N. Sacchi (2006) (Chomczynski Р, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006, 1 (2): 581-5). Выделенная РНК обрабатывается ДНКазой. Перед проведением реакции обратной транскрипции для проверки качества выделенной РНК проводят электрофорез в 2% геле агарозы по методу Masek Т. et al. (см. Masek Т., Vopalensky V., Suchomelova P., Pospisek M. Denaturing RNA electrophoresis in TAE agarose gels. //Anal Biochem. 2005, 336 (1), P. 46-50). Также перед проведением реакции обратной транскрипции необходимо измерить концентрацию полученных препаратов РНК на флюориметре и нормализовать ее до 2 нг/мкл. Синтез кДНК можно проводить с использованием коммерческих наборов, основанных на применении обратной транскриптазы M-MuLV Reverse Transcriptase и случайных праймеров (random hexamer). Реакцию обратной транскрипции проводили при 37°С в течение 30 минут.

Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицировали в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl₂, 1x-ый ПЦР-буфер и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, краситель EVAGreen и по 230 нМ прямого и обратного праймеров для референтного гена (актина, АСТВ) или гена-мишени. Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием референсных последовательностей NCBI GenBank (таблица 1).

Количественную RT-PCR амплификацию проводили на термоциклере Bio-Rad CFX96 в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе:

- первичная денатурация: t=95°C в течение 3 мин.

- Затем 40 циклов:

- t=95°C в течение 10 с,

- t=60°C в течение 30 с,

- t=72°C в течение 15 с.

В одной постановке в качестве матрицы использовали одновременно кДНК опытной (опухоль) и контрольной (условно здоровая ткань) пробы для определения сигналов, продуцируемых амплификатами локусов PTEN, CYP1B1 и референсного АСТВ. Каждое измерение проводили в трех повторностях.

Относительная экспрессия генетических локусов вычислялась следующим образом:

- рассчитывали медиану C_t по трем повторам для целевого локуса и референсного АСТВ,

- далее рассчитывали величину ΔC_t=C_t(PTEN или CYP1B1)-С_t(АСТВ)

- относительную экспрессию генетического локуса (RE) рассчитывали по формуле 2^-ΔCt (см. Schmittgen T.D., Livak K.J. 2008. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108)

Вывод об изменении экспрессии гена делали, сравнивая показатели относительной экспрессии генетических локусов в опухолевой и условно здоровой ткани. Для этого вычисляли медиану RE_оп опухолевых образцов и медиану RE_к контрольных (условно здоровая ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани матки: К=RE_cancer/RE_normal.

Далее сравнивают полученные значения К с прогностическим коэффициентом экспрессии, и при значении К_PTEN=1,55±0,16 и К_CYP1B1=0,94±0,12 прогнозируют отсутствие рецидивов (метастазов), а при значениях К_PTEN=0,76±0,14 и К_CYP1B1=1,34±0,20 прогнозируют развитие рецидивов (метастазов). В таблице 2 представлены коэффициенты экспрессии генов PTEN и CYP1B1 в операционных биоптатах у пациенток без рецидивов и с рецидивом заболевания.

Для доказательства прогностической ценности генов PTEN и CYP1B1 приводится 2 выписки из историй болезни.

1) Больная К. 64 лет, госпитализирована в апреле 2013 г. в онкогинекологическое отделение РНИОИ с верифицированным диагнозом рак тела матки после биопсии эндометрия по месту жительства.

Морфологическое заключение о наличии эндометриоидной аденокарциномы было подтверждено при пересмотре в РНИОИ. На этапе догоспитального обследования при комбинированном сонографическом исследовании гениталий и органов брюшной полости, малого таза было обнаружено минимальное распространение процесса в пределах полости матки, без перехода на цервикальный канал.

В зоне срединного М-эха обнаружились участки повышенной эхогенности с толщиной эндометрия до 6-7 мм.

В тазовых и парааортальных лимфатических узлах при СРКТ признаков метастатического поражения не выявлено, что позволило предположить до операции стадию T1NxM0.

Рак эндометрия у больной развился на фоне метаболического синдрома в менопаузе более 9 лет.

18.04.2013 г. больной было выполнено хирургическое вмешательство согласно стандарту лечения: нервосберегающая экстирпация матки с придатками, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия.

При макроскопической оценке в удаленной матке была обнаружена полиповидная опухоль распространяющаяся на всю полость матки, исключая цервикальный канал. Послеоперационное течение - без осложнений.

По данным патоморфологического исследования после операции №9132-37 в полости матки эндометриоидная аденокарцинома G2 с инвазией в миометрий на глубину 3 мм при толщине стенки матки 3 см; в удаленных лимфоузлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено. Таким образом, степень распространения процесса, согласно классификации TNM соответствовала T1aN0M0.

K_PTEN в биоптате у данной пациентки составил 0,89.

K_CYP1B1 в биоптате у данной пациентки составил 1,50.

Учитывая общую площадь поражения полости матки карциномой эндометрия и умеренную степень дифференцировки опухоли, в мае-июне 2013 г. больная получила курс адъювантной сочетанно-лучевой терапии: ТА=40 Гр, ТВ=40 Гр и эндовагинальную γ-терапию в дозе 40 Гр. В ноябре 2013 г. при очередном диспансерном осмотре в культе влагалища у больной был обнаружен рецидив, подтвержденный цитологически (ц.а. №35567-72 аденокарцинома). В этой связи больной было проведено 6 курсов полиохимиотерапии по схеме САР (циклофосфан-адриамицин-цисплатин).

На фоне проведения последнего курса в апреле 2014 г. в левой паховой области у пациентки обнаружился метастаз. Опухоль верифицирована (ц.а. №3112-22-метастаз аденокарциномы).

Больная консультирована в РОНЦ им. Н.Н. Блохина в мае 2014 года, где во время обследования были обнаружены метастатические лимфоузлы в левой аксиллярной области, верифицированные при пункционной биопсии как аденокарцинома.

В июне 2014 года начата II линия полихимиотерапии по схеме AUC-7, которую больная не закончила из-за продолжающейся неконтролируемой генерализации с метастазами в легкие и головной мозг.

Смерть больной наступила в июле 2014 года, через 15 месяцев после стандартного радикального лечения.

2) Больная У., 62 лет, госпитализирована в онкогинекологическое отделение РНИОИ 16 октября 2013 г. с верифицированным и подтвержденным при пересмотре в РНИОИ диагнозом: рак тела матки в глубокой менопаузе (г.а. №4488-96 - аденокарцинома).

На догоспитальном этапе при сонографическом комбинированном исследовании была обнаружена матка, увеличенная до 8-10 недель условной беременности, с неравномерно утолщенным эндометрием до 6-8 мм, местами повышенной эхогенности в зоне срединного М-эха.

Сопутствующее гинекологическое заболевание - мелкоузловая миома матки.

При СРКТ признаков отдаленного метастазирования и поражения тазовых и парааортальных лимфоузлов не обнаружено.

Сопутствующая соматическая патология - гипертоническая болезнь, сахарный диабет II типа, избыточный вес - признаки метаболического синдрома.

18 октября 2013 г. больной выполнена стандартная операция: нервосберегающая пангистерэктомия, тазовая и селективная парааортальная лимфаденэктомия.

Макроскопически преимущественно в области дна и верхней половины полости матки обнаружена экзофитная опухоль с инфильтрацией в миометрий и очагами деструкции.

Послеоперационный период - без осложнений. Морфологический анализ №73223-38 - G2 эндометриоидная аденокарцинома с инвазией 1/2 стенки матки. В лимфатических узлах и по линии резекции влагалища признаков опухолевого роста не обнаружено, что позволило определить степень распространения процесса, как T1bN0M0.

K_PTEN в биоптате у данной пациентки составил 1,62.

K_CYP1B1 в биоптате у данной пациентки составил 0,85.

Согласно стандарту комбинированного лечения больная получила курс адъювантной сочетано-лучевой терапии общей СОД: ТА=50 Гр, ТВ=40, FP и эндовагинально 40 Гр.

Больная наблюдается по июль 2015 г. без признаков рецидива и метастазов.

Предлагаемым способом было осуществлено прогнозирование вероятности развития рецидивов у 20 пациенток с диагностированным раком тела матки.

«Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов PTEN и CYP1B1» позволяет с высокой точностью прогнозировать течение такого заболевания, как рак тела матки. Заявляемый способ является экономически оправданным для уточнения особенностей течения заболевания и дает возможность скорректировать тактику лечения, осуществляется в условиях стандартной лаборатории молекулярной биологии (ПЦР), без использования специального дорогостоящего оборудования; обладает высокой чувствительностью и специфичностью, универсален, его осуществление возможно с операционными биоптатами, способ занимает менее 10 часов.