Результат интеллектуальной деятельности: РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУСНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ПРОДУКЦИИ В РАСТЕНИЯХ БЕЛКА Е1 ВИРУСА КРАСНУХИ (ВАРИАНТЫ) И СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА Е1 ВИРУСА КРАСНУХИ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)

Область применения

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к методам получения иммуногенных препаратов и вакцин, которые могут быть использованы для профилактики краснухи.

Актуальность

Вирус краснухи является небольшим одноцепочечным (+) РНК-содержащим вирусом и является опасным для человека патогеном. Емкость российского рынка вакцины против краснухи составляет около 8 млн долл. США. На сегодняшний день в РФ отсутствует отечественная вакцина против краснухи. Импортная вакцина против краснухи РУДИВАКС ($ 4.40 за дозу) производится фирмой Авентис.

Вакцинный штамм вируса краснухи RA27/3 применяется в программах вакцинации уже более 30 лет, но наряду с его несомненной эффективностью выявились и достаточно серьезные противопоказания и побочные эффекты. Из них чаще других встречаются поствакцинальные артриты и артралгии. Аттенуированный вакцинный вирус вызывает субклиническую инфекцию и может длительное время персистировать в организме иммунизированных, что, в свою очередь, не исключает непредсказуемых последствий. В целом, живая вакцина краснухи, как и многие другие живые вирусные вакцины, может вызывать побочные явления, в частности, связанные с введением в организм человека чужеродной РНК. Серьезные опасения вызывает применение живой краснушной вакцины для ВИЧ-инфицированных, беременных женщин и новорожденных. Поэтому задача создания рекомбинантной вакцины против краснухи, не проявляющей негативных эффектов, обусловленных использованием живого вируса, продолжает являться актуальной.

Уровень техники

Методы продукции рекомбинантных белков

Одним из наиболее ярких и убедительных достижений современной биотехнологии стало создание и бурное развитие в последние десятилетия новой области мировой экономики - биофармацевтической промышленности и промышленности биоматериалов, направленной на производство принципиально нового класса лекарств - рекомбинантных белков медицинского назначения. Различные вакцинные белки, интерфероны, эритпропоэтины, факторы роста, антитела, доступные ранее лишь в аналитических количествах, входят теперь в перечень жизненно важных медицинских препаратов, производятся в объемах до нескольких тонн в год и прочно вошли в повседневную практику современной медицины, пищевой и фармацевтической промышленности. В подавляющем большинстве случаев источником получения этих продуктов служат клетки бактерий, животных или дрожжей.

Использование растений как «биофабрик» для продукции чужеродных белков имеет ряд преимуществ по сравнению с клетками бактерий, дрожжей и млекопитающих:

(1) Наработка целевых белков в растениях не требует применения дорогостоящей аппаратуры (ферментеры), культуральных сред и системы стерильности. Для роста растений требуется только почва, вода и солнце, поэтому стоимость их выращивания несравнимо ниже стоимости культивирования клеток бактерий, дрожжей или животных. Вследствие этого стоимость белков, получаемых в растениях, уже сегодня в 10-30 раз ниже стоимости аналогичных белков, получаемых из бактерий (Giddings et al., 2000).

(2) Клетки растений биологически безопасны, поскольку растения и человек не имеют общих патогенов. Поэтому получаемые в растениях продукты не содержат опасных для человека вирусов и прионов.

(3) В отличие от бактерий и дрожжей растения и животные имеют сходную систему посттрансляционных модификаций белков. Поэтому в растительных клетках могут быть получены те белки человека и животных, которые не могут быть корректно экспрессированы в микроорганизмах.

Применяемые в настоящее время технологии экспрессии рекомбинантных белков в растениях, как правило, предполагают получение трансгенного растения - продуцента. Уже сегодня имеется ряд примеров коммерчески успешного производства белков в растениях таким способом. Например, получаемые в трансгенных растениях кукурузы трипсин, авидин и глюкуронидаза уже сейчас производятся и продаются фирмой Сигма-Алдрич. Близки к выходу на рынок апротинин (ProdiGene), коллаген (ProdiGene, Medicago, Meristem Therapeautics), липаза (Meristem Therapeautics), лактоферрин (Ventria, Meristem Therapeutics), лизоцим (Ventria), вакцина против вируса гастроэнтерита TGEV (ProdiGene), моноклональные антитела против кариеса и вируса герпеса (Planet Biotechnology, Epicyte Pharmaceutical). Первая полученная в растениях вакцина от болезни Ньюкасла, разработанная компанией Dow Agroscience успешно прошла регистрацию в США в 2006 году, более 20 полученных в растениях биофармацевтиков в настоящее время находятся на различных стадиях клинических испытаний (http://www.molecularfarming.com/news2.html).

Следует отметить, что получение трансгенных растений не является оптимальным способом создания растительных «биофабрик», так как уровень продукции целевых белков трансгенными растениями, как правило, весьма низок (около 0,1% общего белка). Низкий уровень экспрессии определяет высокую стоимость очистки продукта и, в конечном итоге, конкурентоспособность растительной системы экспрессии. Кроме того, культивирование трансгенных растений связано с рядом формальных ограничений.

Повышение экономической эффективности использования растений в качестве «биофабрик» - продуцентов белков требует разработки новых технологий продукции в нетрансгенных растениях на высоком уровне целевых белков. Такие технологии позволят получать в растениях недорогие и безопасные белки и могут стать конкурентоспособной альтернативой традиционным методам, основанным на использовании бактерий, дрожжей или клеток животных.

Альтернативой трансгенным растениям как продуцентам рекомбинантных белков могут являться системы экспрессии, основанной на рекомбинантных вирусах растений (вирусы-векторы). Многие растительные вирусы, например вирус табачной мозаики и X-вирус картофеля, при заражении растения размножаются в больших количествах, а уровень продукции собственных белков вируса достигает 70% белков растительной клетки. Смысл этого метода состоит в интеграции гена, кодирующего необходимый чужеродный белок, в геном вируса и заражении модифицированным вирусом растительных клеток. При инфекции синтезируются не только собственные белки вируса, но и целевой белок, ген которого был специально вставлен в геном вируса. Уровень продукции рекомбинантного белка в этом случае может составлять до 20% общего белка (Marillonnet et al., 2005), что соответствует 1 грамму белка на 1 килограмм растительной биомассы, что более чем в 100 раз выше уровней продукции, обычно достигаемых в трансгенных растениях.

Белки вируса краснухи, которые могут быть использованы для создания кандидатной вакцины

Геном вируса краснухи представляет собой одноцепочечную + нить РНК длиной 9762 нуклеотида, содержащую две открытые рамки считывания (ОРС). Ближайшая к 5'-концу РНК ОРС кодирует два белка, участвующих в репликации вирусной РНК, Р150 и Р90. Вторая ОРС кодирует три белка-компонента вирусной частицы - капсидный белок С, а также поверхностные гликопротеины Е1 и Е2.

В ходе инфекции краснухой образуются антитела к белкам С, Е1 и Е2. В то время как антитела против Е2 исчезают в течение нескольких месяцев после инфекции, антитела против Е1 сохраняются в организме человека десятилетиями и сохраняют свою активность (Nates et al., 1989). В различных работах было показано, что защита от инфекции обеспечивается в основном нейтрализующими антителами против Е1, в то время как системы клеточного иммунитета не вносят заметного вклада в защиту от инфекции. Показано, что гликопротеин Е1 может являться основой рекомбинантной вакцины против краснухи (Perrenoud et al., 2004). Отдельные пептидные фрагменты этого белка также могут быть использованы в качестве основы кандидатной вакцины.

До настоящего времени для продукции Е1 белка использовали системы экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих [Seppänen et al., 1991; Hobman et al., 1994; Johansson et al., 1996]. Эти методы требуют использования специальных сред и оборудования, причем сохраняется риск контаминации продукта патогенными для человека вирусами и др. Нам неизвестны опубликованные данные по продукции в растениях (как в трансгенных растениях, так и с помощью рекомбинантных вирусов-векторов) белков вируса краснухи. Поэтому актуальным остается создание альтернативных методов продукции вакцинных белков вируса краснухи, одним из наиболее перспективных из которых являются растительные системы экспрессии.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении ставилась задача создания вирусного вектора, который может обеспечивать продукцию в растениях Е1 белка вируса краснухи (SeqID01) и полипептида Е12 (далее белок Е12), включающего аминокислоты со 153 по 239 белка Е1.

Фактически задача была решена путем:

а) дизайна и синтеза генов, кодирующих белки Е1 и Е12, модифицированные присоединением к ним аминокислотных последовательностей, повышающих их стабильность в растительной клетке и облегчающих очистку,

б) клонирования синтезированных генов в вирусе-векторе на основе генома Х вируса картофеля,

в) разработки протоколов инфицирования рекомбинантным вирусом-вектором растений Nicotiana benthamiana и последующей продукции в растениях рекомбинантных белков Е1 и Е12 вируса краснухи.

Первый аспект настоящего изобретения связан с конструированием синтетических генов, кодирующих модифицированные белки Е1 и Е12, к которым на N-конце присоединена последовательность из 6 аминокислотных остатков гистидина, а на С-конце - последовательность сигнала локализации в эндоплазматическом ретикулуме SEKDEL.

Вторым аспектом изобретения является получение экспрессионных вирусов-векторов, обеспечивающих продукцию в растениях модифицированных белков Е1 и Е12. Для этого упомянутые выше синтетические гены были клонированы в вирусный вектор pA7248amvT.

Соответственно, третий аспект изобретения относится к оптимизации условий инфицирования растений Nicotiana benthamiana рекомбинантными вирусами-векторами и последующей продукции в растениях рекомбинантных белков Е1 и Е12 вируса краснухи.

Четвертый аспект изобретения связан с подтверждением факта продукции в растениях белков Е1 и Е12 в результате Вестерн-блот анализа белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов. При этом было показано, что оба рекомбинантных белка, Е1 и Е12, действительно синтезируются в листьях растений-продуцентов.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - структура искусственных генов, кодирующих модифицированные белки Е1 и Е12 вируса краснухи.

Приведены нуклеотидные и соответствующие им аминокислотные последовательности генов. Нуклеотидные последовательности, кодирующие исходные Е1 и Е12, выделены серым, указаны номера аминокислот в Е1 белке. Последовательности стартового и терминирующего кодона выделены курсивом, последовательность, кодирующая 6 гистидинов, подчеркнута, последовательность, кодирующая сигнал локализации в эндоплазматическом ретикулуме SEKDEL, выделена прямоугольником.

Фиг.2 - структура вирусных векторов pA7248amvE1 и pA7248amvE12, обеспечивающих продукцию вакцинных белков вируса краснухи в растениях. Показана структура Т-ДНК области вирусного вектора pA7248amvT, участки вектора за пределами Т-ДНК показаны пунктирной линией. Границы Т-ДНК (бордеры, «В») отмечены жирными вертикальными линиями. 35S - промотор, 35S-T - терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. RDRP-ген полимеразы, Sgp1 - первый промотор субгеномной РНК Х вируса картофеля. Tet - ген устойчивости к тетрациклину. AMV - ДНК копия лидерной последовательности РНК вируса мозаики люцерны.

Фиг.3 - Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов Е1.

На гель нанесены белковые препараты:

1. Маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах.

2. Неинокулированные листья N. benthamiana (контроль) - мембранная фракция.

3. Листья N. benthamiana, инокулированные вирусом-вектором pA7248amvE1 - мембранная фракция.

В растворимой фракции белок Е1 не обнаружен.

Фиг.4 - Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из растений-продуцентов Е12.

На гель нанесены белковые препараты:

1. Маркер молекулярного веса, размеры полос указаны в килодальтонах.

2. Неинокулированные листья N. benthamiana (контроль) - мембранная фракция.

3. Листья N. benthamiana, инокулированные вирусом-вектором pA7248amvE12 - мембранная фракция.

В растворимой фракции белок Е12 не обнаружен.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Дизайн и синтез генов, кодирующих модифицированные для экспрессии в растениях белки Е1 и Е12.

Конструирование искусственного гена Е1 проводили в два этапа. На первом этапе последовательность гена Е1 была получена в результате проведения ПЦР с использованием праймеров E1FBg (CGT AGA TCT GAG GAG GCT TTC ACC TAC CT) и E1RSm (ATA GAG CTC СТА AAG TTC ATC TTT CTC AGA GCG AGG CGC TAT AGC G) и ДНК копии генома вируса краснухи в качестве матрицы. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 96°С - 40 сек, (2) 72°С - 180 сек, шаги 1-2 повторяли 40 раз. Отметим, что в последовательность обратного праймера E1RSm была введена (выделено курсивом) последовательность нуклеотидов, кодирующую пептид SEKDEL. После электрофоретического разделения продуктов ПЦР выделяли фрагмент размером 1,5 т.п.н., который обрабатывали рестриктазами BglII и Ecl136II и лигировали с ДНК вектора рQЕ30 (QIAGEN), предварительно обработанной рестриктазами BglII и Есl136II. Полученную плазмиду, которая была отобрана по результатам рестрикционного анализа, обозначали pQE-E1. На втором этапе последовательность модифицированного гена Е1 была получена в результате проведения ПЦР с использованием праймеров pQtagF (AC TGG CGC GCC ААА ATG GCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GG) и pQtagR (ATA GAG CTC СТА AAG TTC АТС ТТТ CTC AGA) и ДНК плазмиды pQE-El в качестве матрицы. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 96°С - 40 сек, (2) 72°С - 180 сек, шаги 1-2 повторяли 40 раз. После электрофоретического разделения продуктов ПЦР выделяли фрагмент размером 1,5 т.п.н., содержащий искусственный ген, кодирующий Е1 белок с присоединенными к нему последовательностями MAHHHHHHGS (на N-конце) и SEKDEL (на С-конце). Структура искусственного гена Е1 показана на Фиг.1, а аминокислотная последовательность его продукта представлена в перечне последовательностей в SeqID02.

Конструирование искусственного гена Е12 проводили аналогичным образом за исключением того, что на первом этапе конструирования вместо праймеров E1FBg и E1RSm были использованы праймеры E12FBg (CGT AGA TCT ACC GTC CGG GTC AAG TTC CA) и E12RSm (A GAG CTC CTA AAG TTC АТС TTT CTC AGA GGA ATG GCG TTG GCA AAC CG) соответственно. Структура искусственного гена Е12 показана на Фиг.1, а аминокислотная последовательность его продукта представлена в перечне последовательностей в SeqID03.

Пример 2. Конструирование экспрессионных вирусов-векторов, обеспечивающих продукцию в растениях модифицированных белков Е1 и Е12.

В качестве основы для создания вектора был использован описанный в работе [Комарова и др., 2006] вирусный вектор рА7248 (PVXdt_GFP), основанный на геноме X-вируса картофеля штамма UK3 [нуклеотидная последовательность генома этого вируса приведена в GenBank под номером М95516]. Этот вектор включает 5'-нетранслирумый участок генома ХВК, ген полимеразы, первый промотор субгеномной РНК, целевой ген GFP, последние 60 нуклеотидов гена белка оболочки и 3'-нетранслируемый участок генома Х-вируса картофеля. Этот вектор был нами модифицирован заменой гена GFP на ген устойчивости к тетрациклину (Tet) введением уникальных сайтов рестрикции AscI и SmaI, фланкирующих ген Tet, а также введением между первым промотором субгеномной РНК и сайтом AscI нуклеотидной последовательности, соответствующей лидерной последовательности РНК вируса мозаики люцерны (вектор pA7248amvT. Вся эта конструкция помещена между 35S промотором и 35S терминатором и клонирована в бинарном векторе pBIN19. При доставке в клетки с помощью агроинфильтрации листьев происходит заражение большей части клеток листа в инфицированной области, репликация вирусного вектора в отдельных клетках и синтез продукта на высоком уровне.

Для создания вирусного вектора-продуцента модифицированного белка Е1, ДНК вектора pA7248amvT обрабатывали рестриктазами AscI и SmaI и лигировали с обработанным этими рестриктазами фрагментом ДНК, содержащим искусственный ген Е1. Полученный рекомбинантные вектор, содержащий ген Е1 на месте гена Tet, который был отобран по результатам рестрикционного анализа, обозначали pA7248amvE1.

Для создания вирусного вектора-продуцента модифицированного белка Е12, ДНК вектора pA7248amvT обрабатывали рестриктазами AscI и SmaI и лигировали с обработанным этими рестриктазами фрагментом ДНК, содержащим искусственный ген Е12. Полученный рекомбинантные вектор, содержащий Е12 на месте гена Tet, который был отобран по результатам рестрикционного анализа, обозначали pA7248amvE12.

Структура вирусных векторов pA7248amvE1 и pA7248amvE12, обеспечивающих продукцию в растениях модифицированных белков Е1 и Е12, показана на Фиг 2.

Пример 3. Инфицирование растений Nicotiana benthamiana рекомбинантными вирусами-векторами и продукция в растениях белков Е1 и Е12 вируса краснухи.

Для экспериментов по экспрессии белка Е1 в растениях N. benthamiana вирусный вектор pA7248amvE1 вводили в штамм Agrobaterium tumefaciens GV3101, рекомбинантные агробактерии были использованы для инфильтрации листьев N. benthamiana. Агробактерии, содержащие рекомбинантные бинарные векторы, выращивали в течение 12 ч на шейкере при 30°С. Клетки (1,5 мл) осаждали центрифугированием (4000g, 5 мин), осадок ресуспендировали в 1,5 мл буфера, содержащего 10 мМ MES (рН 5.5) и 10 мМ MgCl₂, оптическую плотность доводили до OD₆₀₀=0,2. Листья растений N. benthamiana инъецировали суспензией агробактерии при помощи шприца без иглы. Инфильтрированные листья оставляли на растущих растениях.

Известно, что одним из основных факторов, ограничивающих вирусную инфекцию и, в частности, экспрессию целевых белков в вирусных системах экспрессии, является развитие посттранскипционного умолкания генов (PTGS), активированного двунитевыми репликативными формами вирусных РНК [MacDiarmid, 2005]. Для предотвращения этого явления одновременно с агробактериями, содержащими вирус-вектор pA7248amvE1l, в листья растений инфильтрировали агробактерии, содержащие вектор-продуцент белка Р19 вируса кустистой карликовости томатов, известного суппрессора посттранскипционного умолкания генов.

После инфильтрации листьев N. benthamiana агробактериями с вирусом-вектором происходит заражение большей части клеток листа в инфицированной области, перенос Т-ДНК в ядро, транскрипция копии вирусной РНК с 35S промотора. На последующей стадии происходит репликация вирусного вектора и синтез продукта на высоком уровне [Комарова и др., 2006]. Максимум синтеза продукта достигается на 6-10 сутки после инфильтрации.

Продукцию в растениях белка Е12 осуществляли тем же способом с использованием вируса-вектора pA7248amvE12.

Пример 4. Детекция продуцированных в растениях белков Е1 и Е12 методом Вестерн-блот анализа.

Наличие целевого белка в листьях растений-продуцентов регистрировали с помощью Вестерн-блот анализа. На 6-10 день после заражения фрагмент листа растирали в буфере 0.4 М сахароза, 50 мМ Трис рН 8.0, 10 мM KCl, 5 мM MgCl₂, 10% глицерин, 10 мМ β-меркаптотанол. Полученный экстракт центрифугировали 10 минут при 14000g, супернатант («растворимая фракция») и растворенный осадок («мембранная фракция») анализировали методом Вестерн-блота с использованием антител, полученных к рекомбинантному белку Е1 или методом электрофореза в полиакриламидном (ПААГ) градиентном (8-20%) геле по Лэммли и окрашивали Кумасси R-250. Результаты анализа представлены на Фиг.3 (для белка Е1) и Фиг.4 (для белка Е12).

Как видно из результатов, представленных на Фиг.3, в растениях, инфильтрированных вирусом-вектором pA7248amvE1 в мембранной фракции клеток, обнаружен продукт, соответствующий по молекулярной массе 53 кДа и реагирующий с антителами к белку Е1. В контрольном неинфильтрированном растении этот белок отсутствовал. Выход продукта (Е1) составлял около 5% фракции нерастворимых белков.

В растениях-продуцентах Е12 целевой продукт с молекулярной массой приблизительно 11,5 кДа также был детектирован в мембранной фракции с помощью Вестерн-блоттинга (Фиг.4). Размер этого белка совпадал по электрофоретической подвижности с контрольным рекомбинантным полипептидом Е12. Выход продукта (Е12) составил около 1% фракции нерастворимых белков.

Таким образом, рекомбинантные белки Е1 и Е12 синтезируются в соответствующих растениях-продуцентах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Hobman TC, Lundstrom ML, Mauracher CA, Woodward L, Gillam S, Farquhar MG. (1994) Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells. Virology, 202(2):574-85.

2. Johansson T, Enestam A, Kronqvist R, Schmidt M, Tuominen N, Weiss SA, Oker-Blom C. (1996) Synthesis of soluble rubella virus spike proteins in two lepidopteran insect cell lines: large scale production of the E1 protein. J Biotechnol. 50(2-3):171-178.

3. Giddings G, Allison G, Brooks D, Carter A. (2000) Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nat. Biotechnol. 18 (11), 1151-1155.

4. MacDiarmid R. (2005) RNA silencing in productive virus infections. Annu. Rev. Phytopathol., 43, 523-544.

5. Marillonnet S, Thoeringer C, Kandzia R, Klimyuk V, Gleba Y. (2005) Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat. Biotechnol., 23, 718-723.

6. Nates SV, Mersich SE, Damonte EB, Zapata MT. (1989) Comparison of immune response to rubella virus proteins in early and late natural infections. Microbiologica, 12, 335-338.

7. Perrenoud G, Messerli F, Thierry AC, Beltraminelli N, Cousin P, Fasel N, Vallet V, Demotz S, Duchosal MA, Moulon C. (2004) A recombinant rubella virus E1 glycoprotein as a rubella vaccine candidate. Vaccine 23, 480-488.

8. Seppänen H, Huhtala ML, Vaheri A, Summers MD, Oker-Blom C. (1991) Diagnostic potential of baculovirus-expressed rubella virus envelope proteins. J. Clin. Microbiol 29(9):1877-1882.

9. Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Шварц A.M., Дорохов Ю.Л., Атабеков И.Г. (2006) Новый вирус-вектор для эффективной продукции целевых белков в растениях. Биохимия, 71(8), 1043-1049.