Результат интеллектуальной деятельности: РАСТВОР ДЛЯ КРИОПРЕЗЕРВАЦИИ КОЖИ И РОГОВИЦЫ

Изобретение относится к области медицины, а именно к растворам для криопрезервации кожи и роговицы. Изобретение может быть использовано при создании запасов жизнеспособных трансплантатов кожи и роговицы в хирургии и офтальмологии.

Для временного восстановления кожного покрова и стимуляции репаративных процессов в ране может использоваться жизнеспособная аллогенная кожа. Она может быть использована также в качестве источника для получения аллогенных трансплантатов кератиноцитов и фибропластов, в комбинации с аутодермопластикой или как основа для последующей трансплантации аутологичных кератиноцитов. С целью снижения количества операций по забору кожи у больных с ожогами и постоянного восстановления кожного покрова может использоваться жизнеспособная аутологичная кожа.

Известны растворы для хранения кожи, например раствор, содержащий диметилсульфоксид, глицерин, формалин, спирт и дистиллированную воду (RU 2144764 C1, 27.01.2000).

Недостатками указанного способа являются сравнительно низкая эффективность. Это обусловлено, в частности, повреждением клеток, малым сроком хранения кожи.

Наиболее близким к заявленному изобретению по технической сущности является способ криопрезервации жизнеспособных клеток с использованием криопротектора типа диметилсульфоксид, пропиленгликоль или полиэтилена гликоль (WO 96/39812 A3, 19.12.1996).

Общими недостатками указанных растворов являются сравнительно низкая эффективность сохранения клеток живыми, высокая сложность и стоимость хранения.

Целью изобретения является создание эффективной среды для криопрезервации кожи, что способствует созданию единой технологии хранения жизнеспособной аллогенной и аутологичной кожи, повышение эффективности и снижение стоимости лечения больных с различными повреждениями кожного покрова и роговицы.

Поставленная цель достигается тем, что для сохранения жизнеспособности и сохранения специфической функции клеток в течение длительного времени разработан раствор, содержащий 199 среду на базе раствора Хэнкса, криопротектор и эпидермальный фактор роста.

Среда 199 разработана в 1950 г. Ее характеризуют широкий спектр питательных веществ и относительно невысокая их концентрация (Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Сборник научных трудов. - Л.: Наука, 1988, с.56). В настоящее время среда 199 используется без каких-либо добавок как поддерживающая для первичных клеток.

Раствор Хэнкса представляет собой растворенный краситель фенол красный в солевом растворе (Yasuda Y. et al. Jornal of Reproduction and Fertility, 1992, 96, 521-528).

В качестве стимулятора деления клеток можно использовать любой митоген полипептидной природы, в частности эпидермальный фактор роста, инсулин и др.

Криопротектором может служить любые известные своей функцией реагенты, например диметилсульфоксид, пропиленгликоль, глицерин и др. Причем концентрация криопротектора может составлять от 10 до 90% от среды, а предпочтительно 10-20%.

Раствор получают простым смешением компонентов. Например, в готовый раствор среды 199 на базе раствора Хэнкса добавляют глицерин 100-150 мг/мл, гомогенизируют, затем добавляют митоген от 7 до 12 нг/мл.

После помещения кожи в данный раствор она замораживается и хранится в морозильных камерах при температуре -18^oС, -70^oС или в жидком азоте при -196^oС. По мере необходимости кожные трансплантаты размораживают и накладывают на раны цельные или перфорированные лоскуты. После 45 суток хранения при -70^oС количество живых клеток в коже снижается в среднем всего на 29%, что позволяет получать при культивировании кератиноцитов (основного типа клеток эпидермиса) колонии. Раствор для криопрезервации физиологически совместим и его не надо удалять перед наложением пациенту.

Возможность хранения жизнеспособной кожи при отрицательных температурах с целью ее последующего использования в качестве самостоятельного покрытия или для получения клеточных трансплантатов свидетельствует о соответствии заявляемого решения условию патентоспособности "новизна".

Использование совокупности настоящих признаков в их функциональном единстве для достижения поставленной задачи свидетельствует о соответствии заявляемого решения условию "изобретательский уровень".

Использование данных признаков изобретения позволяет получить новый технический результат - повысить качество кожных трансплантатов и получать жизнеспособную кожу, близкую по своим свойствам к нормальной коже, и создать банк трансплантатов кожи с длительным сроком хранения.

Пример 1. Способ апробирован и реализован при выполнении пластики гранулирующей раны у крысы посредством пересадки аутологичного кожного лоскута после хранения на модели с исключением контракции раны.

Протокол опыта 30, крыса 12, самец.

10.05.99 у крысы линии Вистар, весом 250 г под общим наркозом взят полнослойный кожный лоскут площадью 0,7 см². Биоптат помещен в стеклянную тару с разработанным раствором. Замораживание осуществляли со скоростью 1-2^oС в минуту при -70^oС. Через 27 суток хранения (за трое суток до трансплантации) в область верхней трети части спины иссекли полнослойный кожный лоскут. Для предотвращения контракции в рану вшили пластиковое кольцо, имеющее вертикальную и горизонтальную поверхности. Через 30 суток хранения произвели размораживание кожи при постоянной температуре около 42^oС, после чего перенесли на гранулирующую рану. Поверх трансплантата наложили перевязочное средство Jelonel и салфетку, смоченную в физиологическом растворе с гентамицином (0,16 мг/мл).

При осмотре раны через 5 суток отмечено наличие пересаженного лоскута. Прижившиеся трансплантаты были бледно-розового цвета, плотно прилежали к раневой поверхности. Края лоскутов отделить от грануляционной ткани не удавалось. При взятии биопсии в месте разреза прижившейся кожи возникало интенсивное кровотечение. При гистологическом исследовании наблюдалась частичная отслойка эпидермиса. В дерме видимых изменений обнаружено не было. Базальная мембрана сохранена. К 15-м суткам трансплантаты имели те же размеры, плотно прилежали к ране. Поверхность лоскутов была покрыта тонким, гладким, блестящим эпителием. При гистологическом исследовании подлежащая грануляционная ткань имела тесный контакт с дермой пересаженных кожных лоскутов. В глубоких слоях дермы наблюдалась повышенная васкуляризация, лейкоцитарная инфильтрация и увеличение числа фибробластов. В зоне дермо-эпидермального контакта отмечалось нарушение связи дермы и эпидермиса по всей длине кожного лоскута, однако отслоения эпидермиса не наблюдалось. Базальная мембрана эпидермиса была не нарушена. В эпидермисе определялись явления акантоза и гипертрофии кератиноцитов в зернистом слое. При этом в увеличенных в размерах кератиноцитах отсутствовали гранулы кератогиалина. В последующем с краев пересаженной кожи наблюдалась миграция эпителия на грануляционную ткань и рост волос в трансплантате. К 30-м суткам приживший лоскут несколько увеличился в размере за счет краевой эпителизации. Трансплантат имел бледно-розовый цвет, плотно держался на раневом ложе. На грануляционной ткани вокруг трансплантатов была видна тонкая полоска молодого эпителия. В центре наблюдался активный рост волос. При гистологическом исследовании трансплантатов кожных лоскутов грануляционная ткань отсутствовала. Трансплантаты кожных лоскутов по своему строению соответствовали нормальной коже. В верхнем слое дермы увеличено количество фибробластов. В зоне дермо-эпидермального контакта местами отмечалось нарушение связи дермы и эпидермиса, однако отслоения эпидермиса не наблюдалось. Эпидермис был утолщен за счет средних слоев. Процесс ороговения не нарушен. Признаков фенотипической трансформации кератиноцитов обнаружено не было.

Пример 2. Больная С-ва, 69 лет, история болезни 14559, находилась на стационарном лечении в ожоговом центре НИИ СП им. Н.В. Склифосовского с диагнозом: ожог пламенем II-IIIA, Б степени туловища, правой ягодицы и правого бедра общей площадью 20% поверхности тела (ПГБ-9%). В связи с отказом больной от операции аутодермопластика лечение ожоговых ран проводили консервативно. В результате проведенного комплексного лечения на 50-е сутки у больной оставались гранулирующие раны на площади 1,5% поверхности тела. На 51-е сутки с момента получения травмы больной была произведена аллотрансплантация пластов эпидермальных кератиноцитов, выращенных из трупной кожи, хранившейся в разработанном консерванте в течение 20 суток. Первая перевязка произведена через трое суток, при этом отмечена выраженная краевая эпителизация, а также появление нескольких небольших (около 3-5 мм²) островков эпителизации. Площадь ран уменьшилась примерно на 1/3, однако пласт клеток визуально не определялся. Раны были закрыты перевязочным средством "Jelonel"; сверху - повязкой с левомеколем. На последующих перевязках через 6 и 8 суток с момента трансплантациии было отмечено прогрессирующее сокращение ран за счет краевой эпителизации и увеличения площади островков эпителизации. К 10-м суткам у больной оставались раны на площади около 3 см². На 15-е сутки после трансплантации (66-е сутки с момента получения травмы) кожный покров был полностью восстановлен.

Предлагаемый состав обеспечивает сохранение жизнеспособности кожи и роговицы в течение длительного времени и позволяет создать банк трансплантатов, пригодных для закрытия ран и ожогов кожи и роговицы.