Результат интеллектуальной деятельности: БИОЛОГИЧЕСКИЙ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ОРГАНОГЕНЕЗА

Изобретение относится к области медицины, а именно к активным комплексам биологического назначения для использования при получении биологической структуры, которая обладает регенеративными и репаративными свойствами. Данный комплекс может быть использован для восстановления организмом утраченных клеток и частичного возмещения живой ткани органов и кожи при восстановлении глубоких трехмерных дефектов мезенхимо-эпителиального или мезодермального и эктодермального происхождения. В частности, данный комплекс можно использовать для восстановления пищевода, стенки мочевого пузыря, кожных покровов при ожогах, трофических язвах и ранах любой этиологии, восстановления конъюнктивы и орбиты глаза, носовой перегородки, среднего уха, почки, внутренних половых органов и т.п.

Известен активный комплекс биологического назначения, включающий компонент структуры, представляющий собой поддающийся биологическому разложению полимер, компонент активации и формирования, представляющий собой хемотактическое вещество, и компонент роста (GB N 2215209 А, 1989). Известный активный комплекс служит для устранения биологических дефектов и содержит поддающийся биологическому разложению полимер, компонент активации и формирования, представляющий собой хемотактическое вещество, и компонент роста.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является активный биологический комплекс, который используется для органогенеза за счет "иммиграции" клеток из окружающих комплекс тканей в компонент его структуры после трансплантации такого комплекса в организм. Для этого компонент структуры такого комплекса включает компонент роста и компонент адгезии (RU 2093191).

Недостатком всех указанных аналогов является их узкое назначение и невозможность восстановления дефектов биологических структур, имеющих мезенхимо-эпителиальную или мезодермальную и эктодермальную природу. Так же общими недостатками указанных способов являются сравнительно низкая эффективность восстановления дефектов глубиной менее 0,5 см и невозможность восстанавливать трехмерные дефекты кожи глубиной более 0,5 см, а также трудность фиксации трансплантата при сложных конфигурациях тканевых дефектов.

Задачей изобретения является создание активного биологического комплекса, пригодного для регенеративной и репаративной реконструкции любых биологических структур, имеющих мезенхимо-эпителиальное или мезодермальное и эктодермальное происхождение, что способствует созданию унифицированного способа восстановления трехмерных дефектов тканей и повышению эффективности лечения больных с различными дефектами пищевода, стенки мочевого пузыря, кожных покровов, гортани, трахеи, почек, внутренних половых органов, конъюнктивы и орбиты глаза, носовой перегородки, носоглотки и среднего уха и т.п.

Для решения данной задачи разработан активный биологический комплекс на основе макромолекулярной объемной, трехмерной матрицы, включающий, по меньшей мере, один компонент структуры, по меньшей мере, один компонент активации и формирования процесса регенерации и/или репарации ткани, по меньшей мере, один компонент роста и созревания собственных клеток ткани.

Данный биологический активный комплекс можно производить серийно в промышленном масштабе для создания банка эквивалентов донорских тканей.

Сущность изобретения заключается в создании активного биологического комплекса для органогенеза, представляющего собой многокомпонентную, объемную, трехмерную структуру, содержащую аллогенные клетки мезенхимы и эпителия человека и, по крайней мере, один слой из биосовместимого полимера в виде сетчатой матрицы с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм, внутри коллагеновой структуры.

При этом активный биологический комплекс отличается тем, что коллагеновая структура выполнена в виде коллагенового геля или губки, или сетчатой структуры. При этом в качестве коллагенового геля структура содержит 0,1-0,15% раствор коллагена в 0,1% уксусной кислоте, а предпочтительно 0,1-0,12%.

При этом активный биологический комплекс отличается тем, что он дополнительно содержит клетки мезодермального и/или эктодермального происхождения. При этом активный биологический комплекс отличается тем, что дополнительно содержит аутологичные клетки мезенхимы и/или эпителия человека. Клетки мезенхимы человека предварительно культивируются на коллагеновых микроносителях.

Коллагеновый гель содержит десятикратный концентрат культуральной среды «199» в количестве от 7% до 40% от объема, а предпочтительно от 10% до 20%, глутамин в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,4 мг/мл, бикарбонат натрия в количестве от 0,1 до 1 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,25 до 0,4 мг/мл, фосфатный буфер в количестве от 0,01 до 0,1 мг/мл от объема, а предпочтительно от 0,01 до 0,05 мг/мл. При этом активный биологический комплекс отличается тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит матриксные белки. В качестве матриксных белков могут быть использованы фибронектин, и/или ламинин, и/или белок в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл. Коллагеновый гель также дополнительно содержит факторы роста. В качестве факторов роста могут быть использованы эпидермальный фактор роста, и/или фактор роста фибробластов, и/или трансформирующий фактор роста α и β, и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл. Также коллагеновый гель дополнительно содержит антисептики. В качестве антисептика могут быть использованы ионы серебра, меди и золота. Дополнительно коллагеновый гель содержит антибиотики. В качестве антибиотика может быть использован гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл и/или любые другие антибиотики широкого спектра действия. При этом активный биологический комплекс отличается тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит постнатальные или эмбриональные фибробласты человека.

В качестве клеток эпителия человека в состав эквивалента входят постнатальные кератиноциты кожи человека, нанесенные на поверхность коллагенового геля в виде суспензии и/или предварительно культивированные in vitro на коллагеновых микроносителях.

Дополнительно активный биологический комплекс содержит полимерный слой. В качестве полимерного слоя в состав эквивалента входит сетчатый эндопротез и/или перевязочный материал. При этом активный биологический комплекс отличается тем, что в качестве сетчатого эндопротеза используют викриловую сетку или ее равноценный заменитель. При этом активный биологический комплекс отличается тем, что коллагеновый гель дополнительно содержит пластификатор.

Изобретение поясняется чертежом.

Макромолекулярная объемная, трехмерная структура может быть выполнена из коллагена и в зависимости от метода сушки может быть создана в виде геля, губки, сетчатой структуры. Коллаген выполняет также функцию носителя биологически активных компонентов, таких как:

- 0,1-0,15% раствор коллагена

Структурным компонентом может служить полимерная основа, например, в виде перфорированной пленки или сетки из биологически совместимого полимера.

Компонентом активации и формирования процесса регенерации и/или репарации ткани служат донорские аллогенные клетки мезенхимы, которая является соединительной тканью и составной частью кровеносной системы, или клетки мезодермы, из которых образуются поперечно-полосатая мускулатура, например почки, внутренние половые органы и т.п. Клетки мезенхимы человека представляют собой фибробласты человека, выделенные из донорской кожи или плодного (постнатальные и/или эмбриональные фибробласты) материала и культивируемые in vitro, например, на микроносителях (например, коллагеновых микросферах диаметром 150-300 микрон).

Указанная клеточная культура фибробластов вносится в объем коллагена и выполняет функцию эквивалента соединительной ткани. На поверхность трехмерной матрицы коллагена наносят или культивируют эпителиальные клетки.

Другим компонентом активации и формирования процесса регенерации служат клетки эпителия. Клетки эпителия человека представляют собой клетки эпидермиса кожи человека - кератиноциты, выделенные из кожи донора или реципиента или их смесь. Указанные клетки наносятся в виде суспензии на поверхность коллагена и/или предварительно, также как и фибробласты, культивируются in vitro на коллагеновых микроносителях.

Трехмерная матрица коллагена может дополнительно содержать аутологичные клетки мезенхимного и/или мезодермального, и/или эпителиального и/или эктодермального происхождения, а также матриксные белки, например фибронектин и ламинин в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл, которые являются естественным компонентом околоклеточного матрикса для фибробластов in vitro. Указанные белки внеклеточного матрикса способствуют структурированию коллагенового геля и ускорению указанного процесса.

В состав коллагенового матрикса также дополнительно могут быть введены антисептики, такие как ионы серебра, меди или золота, и антибиотики широкого спектра действия, например гентамицин в концентрациях, не токсичных для клеток (от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл), что позволяет значительно уменьшить вероятность возникновения воспалительного процесса в пораженной ткани.

В готовом виде трансплантат имеет макромолекулярную трехмерную структуру, обладающую характеристиками, соответствующими естественному микроокружению фибробластов in vitro, и одновременно представляет собой подложку для культивирования эпителиальных клеток, в частности эпидермальных кератиноцитов. Благодаря оптимальным параметрам, присущим структуре сформированного трансплантата, возникает возможность транспортировать живые клетки в клинику и, не травмируя, переносить их на рану в качестве трансплантата.

При необходимости активный комплекс может включать в себя пластификатор, обычно в количестве от 0,05 до 10 мас.%. Пластификатор выбирают, как правило, из группы полиэтиленгликоля, сорбита, глицерина и т.п.

Активный комплекс (структуру трансплантата) получают вне живого организма, а затем его приводят в контакт с клетками, с которыми образуется желаемая ткань, а именно в пригодном месте, где размещен активный комплекс, или в самом теле живого организма, или же вне тела, например в культуре клеток. При этом предлагаемый активный комплекс в желаемом месте образования ткани приводят в контакт с жизнеспособными, функционально активными и специфическими клетками. Как известно, ткани состоят из специфических, дифференцированных клеток и образуемого клетками внеклеточного материала, однако лишь сами клетки проявляют собственную метаболическую активность. Так как предлагаемый активный комплекс предоставляет все условия, необходимые для производства ткани, изобретение делает возможным собирание и связывание необходимых для этого клеток с желаемой гистологией в месте наличия активного комплекса, их размножение и созревание в зависимости от того, какие функции они должны выполнять, поскольку активный комплекс содержит пригодный компонент для каждой отдельной стадии образования ткани, обеспечивающий их получение в целом.

Структура трансплантата приспосабливается к требованиям восстанавливаемой ткани организма, т.к. имеется определенная специфичность между клеточными и внеклеточными компонентами тканей. Поэтому источниками для получения структуры трансплантата являются в основном клеточные материалы разных тканей и органов.

Для удобства фиксации активного биологического комплекса на раневой поверхности и придания трансплантату необходимой формы заявляемая композиция дополнительно включает, по крайней мере, один слой полимерной основы, размещенный внутри коллагенового геля, или губки, или сетчатой структуры. Полимерная основа может быть выполнена в виде сетчатого эндопротеза или перфорированной пленки, или в виде перевязочного материала. Указанный сетчатый эндопротез может быть выполнен, например, из викриловой сетки с размерами ячеек от 1 до 5 мм, а предпочтительно от 1 до 3 мм или ее равноценного заменителя по свойствам: биосовместимость и эластичность.

Сетчатый эндопротез, размещенный, например, в толще коллагенового геля, выполняет каркасную функцию, препятствует процессу сжатия геля и значительно упрощает процедуру перенесения тканевого эквивалента на рану пациента. Кроме того, преимущества сетчатого эндопротеза состоят в том, что он способен принимать различные геометрические формы. Благодаря этому слой трансплантата, внутри которого расположен сетчатый эндопротез, с одной стороны, приобретает свойство располагаться на раневой поверхности конгруэнтно ее форме, а с другой стороны, позволяет фиксировать эквивалент ткани по краям раны.

При необходимости комплекс может дополнительно иметь сетчатый полимерный слой, расположенный снизу или сверху активного биологического комплекса.

Коллагеновый гель представляет собой раствор коллагена в 0,1% уксусной кислоте. Кроме того, коллагеновый гель содержит десятикратный концентрат культуральной среды «199», глутамин, бикарбонат натрия (Na₂CO₃) и фосфатный буфер. Коллагеновый гель выполняет функцию носителя биологически активных компонентов. В готовом виде коллагеновый гель имеет трехмерную структуру, обладающую характеристиками, соответствующими естественному микроокружению фибробластов in vivo, и одновременно представляет собой подложку для эпителиальных клеток, в частности эпидермальных кератиноцитов, и может иметь различную толщину (от 0,2 см и более), плотность от 0,5 до 5 мг/мл, рН от 7,2 до 7,4. Благодаря структуре сформированного коллагенового геля возникает возможность доставлять и переносить живые клетки на рану любой конфигурации, глубины и размера.

Коллагеновый гель получают простым смешиванием всех его компонентов при температуре 0-(+4)°С. При необходимости к основным компонентам коллагенового геля вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики. По завершении процесса изготовления геля в него вносят суспензию аллогенной клеточной культуры фибробластов на микроносителях. В емкости, предназначенной для изготовления эквивалента, размещают полимерную сетку заданного размера и заливают еще не застывший гель, содержащий фибробласты. Процесс полимеризации происходит при температуре 37°С и занимает 30-40 минут. В дальнейшем застывший гель оставляют при 37°С в течение 2-3 суток, при этом фибробласты активно структурируют фибриллы коллагена. Полученный на этом этапе эквивалент ткани может быть подвержен криоконсервации в жидком азоте и оставлен для сохранения при отрицательных температурах на срок до 1 года. В дальнейшем, при необходимости, на поверхность геля наносят эпителиальные клетки на микроносителях и/или ферментативно дезагригированную клеточную суспензию эпителиальных клеток. Через 48-72 часа культивирования на коллагеновом геле, содержащем фибробласты, кератиноциты формируют колонии клеток.

Таким образом, продолжительность всего технологического процесса изготовления живого тканевого эквивалента составляет от 4 до 6 суток.

В случае, если коллагеновый гель с фибробластами был изъят из криохранилища, необходимо проверить жизнеспособность клеток, прошедших криоконсервирование, например, путем окрашивания пробы клеток трипановым синим или другим красителем, позволяющем отличить жизнеспособные клетки от погибших. При этом количество жизнеспособных клеток должно быть не менее 70% от их общего количества. Перед проведением дальнейших манипуляций гель необходимо в течение 30-40 минут выдержать при 37°С.

В случае лечения раневых поверхностей значительной пощади или наличия сопутствующего заболевания, препятствующего процессу восстановления дефекта, в состав коллагенового геля дополнительно могут быть внесены ростовые факторы, влияющие на активность клеток, в том числе: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста α и β (TGF), фактор роста, выделяемый тромбоцитами (PDGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) или их сочетания в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл.

Коллагеновый гель, губка или сетчатая структура может использоваться в данном случае для трансдермального ввода лекарства. Согласно настоящему изобретению коллагеновый гель дополнительно может содержать другие биоактивные компоненты, например протеины, карбогидраты, нуклеиновые кислоты, а также неорганические и органические биологически активные молекулы: ферменты, антибиотики, антинеопластические агенты, бактериостатические агенты, бактерицидные агенты, противовирусные агенты, гамостатические агенты, локальные анестетики, гормоны, антиангиогенные вещества, антитела, нейропередатчики, психоактивные лекарственные препараты, лекарства, воздействующие на половые органы, и олигонуклеотиды, например, противочувствительные.

Из коллагенового геля методом сублимационной сушки получают губку, содержание воды в которой сохраняют от 2 до 6%.

Сетчатую структуру получают путем заливки коллагенового геля в специальные формы с последующей сушкой при комнатной температуре.

Предлагаемый биологический комплекс в виде губки и сетчатой структуры используют в качестве повязок. Он легко повторяет рельеф травмы, плотно прилегает к ней, и легко фиксируется.

Биологический комплекс в виде геля с включением аллогенных и/или аутологичных клеток мезенхимы и эпителия представляет собой живой тканевой эквивалент.

При трансплантации живого тканевого эквивалента под действием коллагенового геля с фибробластами происходит стимуляция контракции соединительной ткани и синтеза коллагена. Аллогенные фибробласты и кератиноциты продуцируют цитокины, в том числе интерлейкины, факторы роста фибронектин, коллаген IV типа, ламинин, тромбопластин и другие вещества, суммарный эффект действия которых выражается в стимуляции процессов регенерации поврежденных тканей. Аллогенные кератиноциты также создают условия для краевой эпителизации за счет формирования базальной мембраны. В дальнейшем аллогенный эпителий замещается гистотипическим.

Пример 1. Способ апробирован и реализован при восстановлении объемного дефекта полости сосцевидного отростка после операции по поводу хронического гнойного среднего отита.

Больной М., 42 лет, история болезни №1052, находился на стационарном лечении в Городской клинической больнице им. С.П.Боткина с диагнозом хронический гнойный средний отит. На 11 сутки с момента госпитализации больному произведена операция радикальная аттикоантротомия, образовавшаяся полость укрыта кожным лоскутом. На 3 сутки после операции произошло расхождение наложенных операционных швов. В результате образовался дефект площадью около 3 см² и глубиной до 1 см. Дно образовавшегося дефекта представлено костной тканью. Через 5 суток больному произведена трансплантация коллагенового геля, содержащего аллогенные клетки мезенхимы и эпителия, с включением викриловой сетки, размещенной в толще коллагенового геля. К 14 суткам после трансплантации на новообразованной грануляционной ткани визуально определялся эпителий, отмечалась активная краевая эпителизация. К 21 суткам после трансплантации произошло полное закрытие дефекта.

Пример 2. Способ апробирован и реализован при восстановлении кожного покрова после глубокого ожога.

Больной С., 25 лет, история болезни №22063, находился на стационарном лечении в ожоговом центре НИИ СП им. Н.В.Склифосовского с диагнозом ожог пламенем I-II-IIIAБ-IV степени ягодиц, бедер, голеней - 25% поверхности тела (ШАБ-IV степени - 12%). На вторые сутки больному выполнена тангенциальная некрэктомия на площади - 12% пов. тела. На 4-е сутки в связи с углублением ожоговых ран и образованием вторичных струпов произведена повторная некрэктомия. При этом одномоментно произведена трансплантация живого тканевого эквивалента в области глубокого ожога по передней поверхности правой голени на площади 160 см². К 14 суткам в месте трансплантации визуально определялся эпителий. К 23 суткам кожный покров в месте трансплантации был полностью восстановлен. В то же время на участках глубокого ожога, окружающих место трансплантации, раны к 23 суткам были представлены грануляционной тканью. Полное восстановление кожного покрова на этих участках наступило только после операции аутодермопластики на 39 сутки.

Пример 3. Способ апробирован и реализован при восстановлении слизистой оболочки гортани.

Больной Ч., возраст 54 лет, находился на лечении в МНИОИ им П.А.Герцена с диагнозом рак гортани стадии T3N0M0. Была проведена операция - фронтолатеральная резекция гортани слева с одномоментной подсадкой биологического активного комплекса.

Изготовление биологического активного комплекса производилось в соответствии с описанием (стр.7, второй абзац сверху). Дополнительно на этапе перемешивания компонентов при приготовлении коллагенового геля в формируемую структуру биологического активного комплекса были внесены: эпидермальный фактор роста в концентрации 5 нг/мл, гентамицин - 0,16 мг/мл, фибронектин - 2 мкг/мл.

Биологический активный комплекс зафиксирован на надкостнице грудины, использованной для пластики, таким образом, что слой эпителиальных клеток обращен в просвет гортани. Рана послойно ушита с оставлением аспирационного дренажа в донорской зоне. Наложена спиртовая асептическая повязка. В послеоперационном периоде осложнений не было. На 30-е сутки пациенту была проведена ФИБРОЛАРИНГОТРАХЕОСКОПИЯ, при осмотре состояние после резекции гортани без признаков рецидива. Имеется белесоватый налет на площади 7×15 мм по передней стенке подскладочного отдела с переходом на средний отдел. Просвет в среднем и вестибулярном отделе широкий. В месте трансплантации была взята биопсия, гистологический анализ показал многослойный плоский эпителий с гиперкератозом. На 35-е сутки после трансплантации пациент выписан домой, восстановлены свободное дыхание и речь.

Создание этой структуры основывается на следующих основных принципах:

1. Трехмерность конструкции, которая достигается использованием предлагаемой активной биологической матрицы.

2. Использование нескольких типов клеток, что достигается использованием клеток мезенхимы и/или эпителия, и/или мезодермы, и/или эктодермы.

3. Аллогенность, что достигается использованием аллогенных клеток человека.

4. Использование клеток кожи, что достигается использованием клеток эпидермиса - кератиноцитов и клеток дермы - фибробластов.

5. Удобство трансплантации, фиксации и придание имплантату необходимой формы, что достигается включением в его состав полимерной основы, выполненной в виде перфорированной пленки или сетчатого эндопротеза.

Данное изобретение предоставляет возможность закрытия объемных, трехмерных мезенхимо-эпителиальных дефектов единым, унифицированным, многокомпонентным, объемным, трехмерным живым тканевым эквивалентом, что дает право говорить о новом достигаемом техническом результате, неочевидном для специалиста в данной области.

Также использование данного изобретения позволяет повысить эффективность лечения различных дефектов пищевода, стенки мочевого пузыря, кожных покровов при ожогах, трофических язвах и ранах любой этиологии, гортани, трахеи, конъюнктивы, орбиты глаза, носовой перегородки, носоглотки и среднего уха, почек и внутренних половых органов, что соответствует условиям промышленной применимости.