Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ 3 (S)-ГИДРОКСИ-1-МЕТИЛ-4-(2,4,6-ТРИМЕТОКСИФЕНИЛ) - 1,2,3,6 -ТЕТРАГИДРОПИРИДИНА, А ТАКЖЕ R-СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к способу получения оптически чистых соединений формулы (I) путем стереодифференцирующего превращения смесей энантиомеров с помощью фермента.

3(S) или 3(R)-гидрокси-1-метил-4-(2,4,6-триметоксифенил))-1,2,3,6-тетрагидропиридин (соединения формулы (I), где R=H) или их сложноэфирные производные (соединения формулы (I), где R=COR¹) являются центральными составными частями или предварительными ступенями описанного в патентной заявке HMR 98/L 001 (“Способ получения (-) цис-3-гидрокси-1-метил-4(R)-(2,4,6-триметоксифенил)пиперидина”) синтеза флавопиридола (HMR 1275 или L 86 8275), первого сильнодействующего ингибитора циклинзависимой протеинкиназы (см., например, Sedlacek, Hans Harald; Czech, Joerg; Naik, Ramachandra; Kaur, Gurmeet; Worland, Peter; Losewicz, Michael; Parker, Bernhard; Carlson, Bradley; Smith, Adaline; et al. Flavopiridol (L 868275; NSC 649890), a new kinase inhibitor for tumor therapiy. Int.J.Oncol. (1996), 9(6), 1143-1168 или Czech, Joerg; Hoffmann, Dieter; Naik, Ramachandra; Sedlacek, Hans-Harald; Antitumoral activity of flavone L 868275. Int. J.Oncol.(1995), 6(1), 31-36).

Расщепление рацематов или разделение энантиомеров соединений формулы (I) неизвестно.

Показано, что соединения формулы (I) в оптически чистой форме можно получать из энантиомерных смесей путем ферментативного расщепления сложных эфиров (гидролиз или алкоголиз).

Предметом данного изобретения является, таким образом, способ кинетического расщепления рацематов соединений формулы (I).

который отличается тем, что смеси энантиомеров или рацемические смеси соединений формулы (I), в которой R означает COR¹, R¹=(C₁-C₁₆)-алкил, ((C₂-C₁₆)-алкенил или (С₃-С₁₆)-алкинил, С_n-Н_2n-циклоалкил, n=1-16, которые могут быть разветвленными или неразветвленными и которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, Br, J, СF₃, CN, NO₂, гидрокси, метокси, этокси, и COOR², где R²=(C₁-C₄)-алкил и (С₂-С₄)-алкенил, которые могут быть разветвленными и неразветвленными и могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Сl, Вr, СF₃.

В гомогенных или гетерогенных, водных, водно-органических или органических средах в присутствии фермента, например, липазы или эстеразы, например, из печени млекопитающих или поджелудочной железы млекопитающих или микробиологического происхождения, как, например, из Candida, Pseudomonas и Aspergillus, или из протеазы, например, из Bacillus, подвергают стереоселективному гидролизу или алкоголизу при температуре 10-80°С, при необходимости, в присутствии сорастворителей и буфера, причем реакционная смесь содержит предпочтительно 2-50% мас.% сложного эфира, и по ходу реакции разделяют непрореагировавший сложный эфир (соединение формулы (I) с R=COR¹) и образовавшийся спирт (соединение формулы (I) с R=H) и тем самым оба энантиомера.

Способ согласно изобретению экономичен, осуществляется просто и быстро. Реакция не требует эквимолярных количеств оптически чистых вспомогательных веществ, дорогостоящих реактивов, несоразмерно больших количеств растворителя и требующих больших затрат рабочих операций. По окончании реакции разделение продуктов или энантиомеров можно осуществлять с помощью простых приемов, например путем экстракции.

Предпочтительно в соединениях формулы (I)

R означает СОR¹, R¹=(C₁-C₁₂)-алкил, (C₂-C₁₂)-алкенил или (С₃-С₁₂)-алкинил, С_nН_2n - циклоалкил, где n=1-12, которые могут быть разветвленными или неразветвленными и которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, Вr, СF₃, CN, NO₂, гидрокси, метокси, этокси, и COOR², где R² = метил, этил и винил, которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, СF₃.

Особенно предпочтительно в соединениях формулы (I) R означает COR¹, R¹=(C₁-C₁₀)-алкил, (С₂-С₁₀)-алкенил или (С₃-С₁₀)-алкинил, С_nН_2n - циклоалкил, где n=1-10, которые могут быть разветвленными или неразветвленными и которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, Вr, СF₃, CN, NO₂, метокси и COOR², где R² = метил, этил и винил, которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, СF₃.

Особенно предпочтительно в соединениях формулы (I)

R означает COR¹, R¹=(C₁-С₁₀)-алкил, (С₂-С₁₀)-алкенил или (С₃-С₁₀)-алкинил, которые могут быть разветвленными или неразветвленными и которые могут быть замещены 1-3 заместителями из группы F, Cl, Вr, СF₃ и метокси.

В способе предпочтительно сложный эфир формулы (I), например, COR¹, где R¹=С₃Н₁₇ в водном или содержащем спирт растворе смешивают с липазой, эстеразой или протеазой и перемешивают. Может оказаться предпочтительным буферирование указанного раствора, например, фосфатным или TRIS[=трис-(гидроксиметил)-метиламин-буферным раствором. Добавка может быть, к примеру, 0,01-1,0-молярной. Благоприятной областью буфера является рН 5-9.

Далее, может быть предпочтительной добавка сорастворителей. В качестве сорастворителей пригодны, например, диметоксиэтан, ацетон, тринитрофлуоренон (THF), диоксан, гексан, трет.бутилметиловый эфир и трет.бутанол. Доля сорастворителя в растворе составляет предпочтительно 10-80%.

В качестве ферментов применяют предпочтительно липазы и эстеразы, как, например, холестерол-эстераза (ЕС 3.1.1.13) из поджелудочной железы крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co), эстераза свиной печени (PLE (porcine Liver esterase), Sigma Chemikal Co), панкреатин (Fluka und Sigma Chemical Co), обработанный ацетоном, порошок поджелудочной железы крупного рогатого скота (Sigma Chemical Co), обработанный ацетоном порошок печени лошади (Sigma Chemical Со.) и липаза из поджелудочной железы свиньи (PPL (porcine pancreas Lipase), Sigma Chemical Co.), липаза OF из Candida rugosa (Meito Sangyo) и липаза АР-6 из Aspergillus niger (Amano Pharmazeuticals).

Каждый из названных ферментов может использоваться в свободной или в иммобилизированной форме (Immobilized Biocatalysts, W.Hartmeier, Springer Verlag Berlin, 1988). Количество ферментов выбирается свободно в зависимости от скорости реакции или от желаемого времени реакции и от вида фермента (например, свободного или иммобилизированного) и легко определяется путем простых предварительных опытов.

Реакционная смесь содержит предпочтительно 2-50 мас.% сложного эфира, особенно предпочтительно 5-20%. Температура реакции составляет 10-80°C предпочтительно 20-60°С, особенно предпочтительно 20-40°С.

Получение сложного эфира (соединения формулы (I), где R=COR¹) целесообразно проводить из спирта (соединения формулы (I), где R=H) известным способом этерификации (получения сложного эфира) (Haslam, Tetrahedron 1980, 36, 2409; Hoefle, Steglich, Vorbrueggen, Angew. Chem. 1978, 90, 602) или как описано в патентной заявке HMR 98/L001 (“Способ получения (-)цис-3-гидрокси-1-метил-4(R)-(2,4,6-триметоксифенил)пиперидина”.

Образующиеся или остающиеся при осуществлении способа продукты можно выделить простым способом, например путем экстракции или хроматографическими методами. Остающийся сложный эфир получают, например, путем распределения реакционного раствора между водой и Н-гептаном и концентрирования органической фазы. Образующийся спирт можно в этом случае экстрагировать из водной фазы с помощью этилового эфира уксусной кислоты. Обратное получение фермента можно осуществить с помощью сушки замораживанием. Выделение (или при необходимости последующее повторное применение) фермента можно облегчить с помощью иммобилизации.

С помощью пригодных режимов реакции всегда удается получить, по меньшей мере, один энантиомер оптически чистым. Если хотят получить оптически чистый сложный эфир, то степень превращения должна быть выше (или равна) 50%, если хотят получить оптически чистый спирт, то степень превращения должна быть ниже (или равна) 50%. Определение степени превращения ферментативного гидролиза или алкоголиза проводили с помощью ВЭЖХ (RP 18 LiChrosorb®, определение оптической чистоты было проведено ВЭЖХ (Chiprapak AD). Образующиеся или остающиеся при осуществлении способа расщепления рацематов сложные эфиры с помощью известных методов расщепления сложных эфиров (S.J.Salomon, E.G.Mata, O.A. Mascaretti, Tetrahedron 1993, 49, 3691-3748) можно переводить без инверсии и рацемизации в соответствующий спирт. Наоборот, образовавшийся спирт известными методами этерификации (Haslam, Tetrahedron 1980, 36, 2409) можно переводить без инверсии или рацемизации в соответствующий сложный эфир.

Образующиеся при осуществлении способа или остающиеся продукты с помощью известных методов, например с помощью металлокаталитических перегруппировок (L.E.Overman, Angew.Chem. 1984, 96, 565-573 и уже процитированная литература) можно рацемизировать и снова использовать в процессе расщепления рацематов. Это повышает выход более 50%. Например, соединения формулы (I), где R=COR¹, можно рацемизировать непосредственно, а соединения формулы (I), где R=H, можно рацемизировать после перевода в пригодные производные, которые описаны в L.E.Overman, Angew.Chem. 1994, 96, 565-573/. В качестве металлокатализаторов можно применять к примеру Hg(II)-Pd(0) - или Pd(II)-соединения или соли.

Приведенные ниже примеры поясняют данное изобретение более подробно.

Все выделенные продукты или смеси сырых продуктов были идентифицированы с помощью ¹Н-ЯМР- и масс-спектров или с помощью ВЭЖХ.

Оптическую чистоту определяли с помощью ВЭЖХ, например, на Chiralpak AD 250Х4.6(Daicel).

Пример 1:

10 г эфира уксусной кислоты (соединение формулы (I), где R=COR' и R'=CH₃) помещали в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтана (5:1). Добавили 5 мг панкреатина. Перемешивали при 20-25°С, пока не достигли степени превращения примерно 40% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную в результате смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiralpak AD 250х4.6, Н-гексан+EtOH 5+1, поток 1 мл/мин, 25°C, 220/240 hm): ее оставшегося (R) эфира уксусной кислоты 63%; ее (S)-спирта 85%.

Пример 2:

10 мг эфира масляной кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R¹=(СН₂)₂СН₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиметана (5:1). Добавили 5 мг PPL (липазы из поджелудочной железы свиньи, Sigma Chemical Co.). Перемешивали при 30°С до достижения степени превращения примерно 48% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiraipak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С, 220/240 hm): ее (R) эфира масляной кислоты 90%; ее (S)-спирта 97%.

Пример 3:

1,0 г (2,86 ммоль) эфира масляной кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₂СН₃] поместили в 8 мл диметоксиэтана и 40 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0). Добавили 90 мг панкреатина. Перемешивали при 22-25°C, пока не была превышена степень превращения 50%. Затем проводили сгущение в вакууме, смешивали с водой и шесть раз экстрагировали с помощью 50 мл н-гептана. После сушки (NaSO₄) провели сгущение в вакууме. Получили 450 мг (45%) (R)-эфира масляной кислоты; ее (ВЭЖХ) ≥ 99%. После экстракции оставшейся водной фазы этилацетатом сушки (NaSO₄) и сгущения в вакууме получили 190 мг (23,8%) (S)-спирта; ее (ВЭЖХ) 97%.

Пример 4:

10 мг эфира масляной кислоты (соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₂СН₃) в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтана (5:1). Добавляли 5 мг PPL. Перемешивали при 30°С до достижения степени превращения примерно 48% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (chiralpak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С (220/240 нm): ее (R) - эфира масляной кислоты 90%; ее (S)-спирта 97%.

Пример 5:

10 мг эфира масляной кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₂СН₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтан (5:1). Добавили 5 мг PLE (эстераза свиной печени. Sigma Chemical Co.). Перемешивали при 30°С до достижения степени превращения примерно 47% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiralpak AD 250х4.6, н-гексан-EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С, 220/240 нm); ее (R)-эфира масляной кислоты: 88%; ее (S)-спирта: 97%.

Пример 6:

10 мг эфира капроновой кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(CH₂)₄СH₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтана (5:1). Добавили 5 мг PLE, Перемешивали при 30°С до достижения степени превращения примерно 40% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, загустили досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiralpak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С, 220/240 нm); ее (R) - эфира капроновой кислоты 66%), ее (S)-спирта 96%.

Пример 7:

10 мг эфира капроновой кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₄СН₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтана (5:1). Добавили 5 мг холестерол-эстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Перемешивали при 30°C до достижения степени превращения примерно 50% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiralpak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С, 220/240 нm); ее (R) эфира капроновой кислоты ≥99,9%; ее (S)-спирта ≥99,8%.

Пример 8:

10 мг эфира капроновой кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₈СН₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтан (5:1). Добавили 5 мг PPL. Перемешали до достижения степени превращения примерно 10% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ (Chiralpak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°C, 220/240 нm); ее (R)-эфира капроновой кислоты ≥11%; ее (S)-спирта ≥95%.

Пример 9:

10 мг эфира масляной кислоты [соединение формулы (I), где R=COR' и R'=(СН₂)₂СН₃] поместили в 1 мл калийфосфатного буфера (0,1 М, рН 7,0)/диметоксиэтана (5:1). Добавили 5 мг обработанного ацетоном порошка лошадиной печени. Перемешивали при 30°С до достижения степени превращения примерно 46% (ВЭЖХ). Затем отфильтровали, сконцентрировали досуха и полученную смесь исследовали с помощью ВЭЖХ Chiralpak AD 250х4.6, н-гексан+EtOH 6+1, поток 1 мл/мин, 25°С, 220/240 нm); ее (R)-эфира масляной кислоты 82%; ее (S)-спирта ≥96%.