Способ снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, может быть использовано для снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом и найти применение в экспериментальной медицине и клинической практике.

Четыреххлористый углерод (CCl₄) вызывает дозозависимое токсическое поражение печени, при этом значительную роль в развитии патологии играют свободнорадикальные реакции, что обосновывает с целью защиты печени назначение лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантным и мембранопротекторным действием.

Известны способы защиты печени в условиях лекарственных и токсических повреждений органа применением гепатопротекторных средств на основе фосфолипидов: Эссенциале, Эссенциале Н, Фосфоглив [1, Машковский М.Д., Лекарственные средства, 2016]. Недостатком способов является высокая себестоимость лекарственных препаратов, снижающая экономическую эффективность фармакотерапии.

Известно гепатопротекторное средство из морских водорослей [2, Патент РФ №2528898] и способ гепатопротекции апи-фитокомпозицией [3, Патент РФ №2524797]. Известны способ фармакологической коррекции экспериментального токсического гепатита в условиях введения четыреххлористого углерода применением Мексидола [4, Фаращук Н.Ф., Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, №1] и способ снижения повреждения печени крыс противотуберкулезными препаратами введением Ремаксола и Адеметионина [5, Суханов Д.С. и соавт., Антибиотики и химиотерапия, 2011, Вып. 56.]. Недостатками способов является отсутствие исследования влияния лекарственных препаратов, заявляемых как гепатопротекторные средства, на интенсивность процессов пероксидации, активность компонентов АОС печени и продолжительность курса терапии (14 дней, 28 дней).

Известен способ коррекции лекарственного поражения печени введением препарата Реамберин в дозе 25 мл/кг внутрибрюшинно в течение 14 дней [5, Суханов Д.С. и соавт., Антибиотики и химиотерапия, 2011, Вып. 56.]. Данное техническое решение взято нами за прототип.

Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала гепатопротекторных средств для осуществления более эффективного способа снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом в условиях уменьшения суточной и курсовой доз гепатопротектора и, следовательно, повышения фармакоэкономической эффективности.

Проблема решена путем разработки нового способа снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом внутрибрюшинным введением препарата Реамберин (группировочное наименование: меглюмина натрия сукцинат) производства НТФФ «Полисан» г. Санкт-Петербург (Регистрационный номер: Р N001048/01 от 06.09.2007 г.). Препарат Реамберин представляет собой раствор для инфузий (фармакотерапевтическая группа: растворы, влияющие на водно-электролитный баланс), в состав которого входит меглюмина натрия сукцинат - 15,0 г, полученный по следующей прописи: N-метилглюкамин (меглюмин) [C₇H₁₇NO₅] - 8,725 г, янтарная кислота [С₄Н₆О₄] - 5,280 г; и вспомогательные вещества: натрия хлорид - 6,0 г, калия хлорид - 0,30 г, магния хлорид (в пересчете на безводный) - 0,12 г, натрия гипоксид - 1,788 г, вода для инъекций до 1,0 л. Ионный состав на 1 л: натрий-ион - 147,2 ммоль, калий-ион - 4,0 ммоль, магний-ион - 1,2 ммоль, хлорид-ион - 109,0 ммоль, сукцинат-ион - 44,7 ммоль, N-метилглюкаммоний-ион - 44,7 ммоль.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом, включающем воспроизведение модели острого токсического гепатита и ежедневное внутрибрюшинное введение лабораторным животным Реамберина, крысам вводят препарат в дозе 20 мл/кг в течение 6 дней - первые 3 дня за 30 минут до подкожного введения четыреххлористого углерода с дальнейшей депривацией (отменой) гепатотоксина и введением Реамберина в последующие 3 дня.

Осуществление способа. Экспериментальным животным (крысам), находящимся в стандартных условиях вивария, ежедневно внутрибрюшинно вводят Реамберин в дозе 20 мл/кг в течение 6 дней - первые 3 дня за 30 минут до подкожного введения 50% масляного (оливковое масло) раствора четыреххлористого углерода в дозе 2 мл/кг с дальнейшей депривацией (отменой) гепатотоксина и введением Реамберина в последующие 3 дня.

Эксперимент проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180 - 200 г, содержащихся на стандартном рационе питания, в течение 7 дней. Животные были разделены на 3 группы: 1-я - интактная группа, животные находились в стандартных условиях вивария, получали ежедневно внутрибрюшинно эквиобъемное вводимому препарату Реамберин (3-я группа) количество раствора натрия хлорида 0,9% (20 мл/кг); 2-я -контрольная группа, животным в течение 3 дней осуществляли подкожное введение 50% масляного (оливковое масло) раствора CCl₄ в дозе 2 мл/кг с последующей отменой (депривация) в течение 3 дней на фоне внутрибрюшинного введения эквиобъемного вводимому препарату Реамберин количества раствора натрия хлорида 0,9%» (20 мл/кг); 3-я -экспериментальная группа, животным в течение 3 дней вводили препарат Реамберин в дозе 20 мл/кг за 30 минут до подкожного введения 50% масляного (оливковое масло) раствора CCl₄ в дозе 2 мл/кг, с последующим (с 4-го дня эксперимента) введением Реамберина в период депривации в течение 3 дней.

Экспериментальную модель острого токсического гепатита (интоксиация четыреххлористым углеродом) на животных (крысах) и введение сукцинатсодержащего препарата осуществляли согласно руководству для проведения доклинических испытаний [6, Венгеровский А.И. и соавт., 1999]. Для создания острого гепатита животным вводили подкожно (в дорзальную шейную складку) 2 мл/кг CCl₄ в 50% масляном растворе (оливковое масло) в течение 3 дней [2, Патент РФ №2528898]. Трехдневное введение CCl₄ позволяет смоделировать токсическое поражение печени. В процессе моделирования экспериментального гепатита смертности животных не наблюдалось. Вышеуказанная схема и доза CCl₄ считаются достаточными для создания полноценной биохимической картины токсического поражения паренхимы печени, что подтверждается литературными данными [7, Симонова Н.В., 2004; 8, Доровских В.А. и соавт., Бюллетень физиологии и патологии дыхания, 2017].

На 7^й день эксперимента животные забивались путем декапитации. Результаты учитывались по активности ферментов аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансаминазы (АсАТ) как маркеров цитолиза, по уровню щелочной фосфатазы (ЩФ) как маркера холестаза, по соотношению содержания продуктов ПОЛ (гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида), основных компонентов антиоксидантной системы (АОС) - церулоплазмина, витамина Е - в крови и печени крыс экспериментальной группы в сравнении с животными интактной и контрольной групп, обработаны стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента.

Способ позволил обеспечить снижение токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом, базируемое на снижении активности ферментов-маркеров печеночного цитолиза АсАТ и АлАТ, ЩФ, уменьшении содержания продуктов пероксидации в крови и печени животных и увеличении активности компонентов антиоксидантной системы, в условиях снижения суточной и курсовой доз гепатопротекторного средства в сравнении с прототипом.

Исследована активность ферментов АсАТ, АлАТ и ЩФ в крови крыс интактной, контрольной и экспериментальной групп на 7 день эксперимента (таблица 1). В результате проведенных исследований активность АсАТ у животных контрольной группы (CCl₄) достоверно выше на 57,6% относительно особей интактной группы (р<0,001), АлАТ - на 43,6% (р<0,01), ЩФ - на 43,2% (р<0,01), что свидетельствует о развитии у крыс поражения печени по типу цитолиза и холестаза в условиях введения четыреххлористого углерода.

Примечание: * - значения, достоверно отличающиеся от значений интактных животных; ** - значения, достоверно отличающиеся от значений контрольных животных.

Введение Реамберина животным, получавшим CCl₄, способствует нормализации активности ферментов: уровень АсАТ в сравнении с контролем достоверно ниже на 30,0% (р<0,01), АлАТ - на 22,4% (р<0,05), ЩФ - на 18,2% (р<0,05), что свидетельствует о способности сукцинатсодержащего препарата тормозить выход в кровь печеночных ферментов за счет нормализации структуры мембран гепатоцитов.

Исследование содержания продуктов ПОЛ в плазме крови крыс интактной, контрольной и экспериментальной групп на 7 день эксперимента показало (таблица 2), что содержание гидроперекисей липидов в крови контрольных (CCl₄) животных достоверно выше на 23,8% относительно интактных крыс (р<0,01), диеновых конъюгатов - на 18,7% (р<0,01), малонового диальдегида - на 60,5% (р<0,001), что свидетельствует о повышении интенсивности процессов пероксидации в условиях введения четыреххлористого углерода.

Примечание: * - значения, достоверно отличающиеся от значений интактных животных; ** - значения, достоверно отличающиеся от значений контрольных животных.

Уровень гидроперекисей липидов в плазме крови крыс, получавших на фоне введения CCl₄ Реамберин, достоверно ниже на 13,4%, чем в контрольной группе животных (р<0,05), диеновых конъюгатов - на 11,4% (р<0,05), малонового диальдегида - на 29,6% (р<0,01).

Повышение интенсивности процессов ПОЛ биомембран в условиях введения CCl₄ сопровождается снижением активности компонентов АОС в крови контрольных животных в сравнении с интактными крысами (таблица 3): уровень церулоплазмина в крови животных группы контроля ниже на 21,3% (р<0,001), витамина Е - на 18,2% (р<0,001). В крови экспериментальных животных содержание церулоплазмина достоверно выше на 10,0%) по сравнению с контрольной группой крыс (р<0,05), уровень витамина Е - на 16,5% (р<0,01).

Примечание: * - значения, достоверно отличающиеся от значений интактных животных; ** - значения, достоверно отличающиеся от значений контрольных животных.

Примечание: * - значения, достоверно отличающиеся от значений интактных животных; ** - значения, достоверно отличающиеся от значений контрольных животных.

Исследование содержания продуктов ПОЛ в ткани печени крыс интактной, контрольной и экспериментальной групп показало (таблица 4), что содержание гидроперекисей липидов в печени контрольных (CCl₄) животных достоверно выше на 42,6% относительно интактных крыс (р<0,01), диеновых конъюгатов - на 46,7% (р<0,01), малонового диальдегида - на 81,3% (р<0,01), что свидетельствует о повышении интенсивности процессов пероксидации в печени при токсическом повреждении органа гепатотоксином. Введение Реамберина препятствует накоплению продуктов липопероксидации на фоне токсического повреждения печени четыреххлористым углеродом: содержание гидроперекисей липидов в печени крыс экспериментальной группы достоверно ниже на 25,8% относительно контроля (р<0,01), диеновых конъюгатов - на 28,3% (р<0,01), малонового диальдегида - на 33,8% (р<0,05).

Анализ активности компонентов АОС в ткани печени в условиях введения CCl₄ свидетельствует о снижении уровня церулоплазмина в группе контроля на 42,6%) (р<0,01), витамина Е - на 42,2% (р<0,01) в сравнении с интактными крысами (таблица 5). В условиях введения Реамберина экспериментальным животным содержание церулоплазмина достоверно выше на 46,7% по сравнению с контрольной группой крыс (р<0,05), уровень витамина Е - на 41,5% (р<0,05).

Примечание: * - значения, достоверно отличающиеся от значений интактных животных; ** - значения, достоверно отличающиеся от значений контрольных животных

Таким образом, экспериментально установлена возможность снижения токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом введением препарата Реамберин, основанная на снижении уровня аминотрансфераз, уменьшении содержания продуктов пероксидации и увеличении активности основных компонентов АОС в крови и печени животных, что свидетельствует о способности Реамберина препятствовать прогрессированию синдромов цитолиза и холестаза, коррелирующей с антиоксидантной активностью препарата.

В целом, базируясь на полученных экспериментальных результатах, предложенный способ обеспечивает снижение токсического повреждения печени крыс четыреххлористым углеродом в условиях уменьшения суточной и курсовой доз Реамберина в сравнении с прототипом, что свидетельствует о наличии у препарата гепатопротекторной, мембраностабилизирующей и антиоксидантной активности.

Технический результат использования изобретения заключается в уменьшении суточной дозы Реамберина до 20 мл/кг и длительности курса коррекции до 6 дней в сравнении с прототипом при токсическом повреждении печени крыс четыреххлористым углеродом.

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ИСТОЧНИКИ

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей. - М.: Медицина, 2016. - 685 с.

2. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Момот Т.В. Гепатопротекторное средство из морских водорослей. - Патент РФ на изобретение №2528898. - Опубликовано: 20.09.2014, Бюл. №26.

3. Покровский М.В., Грибанов Н.Н., Покровская Т.Г., Арустамова А.А., Затолокина М.А., Кочкаров В.И., Корокин М.В., Гудырев О.С. Способ гепатопротекции апи-фитокомпозицией. - Патент РФ на изобретение №2524797. - Опубликовано: 10.08.2014, Бюл. №22.

4. Фаращук Н.Ф. Мексидол и гепатит: результаты в эксперименте и перспективы в клинике // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - №1.

5. Суханов Д.С., Виноградова Т.И., Заболотных Н.В., Коваленко А.Л., Васильева С.Н., Романцов М.Г. Сравнительное изучение гепатопротективного действия ремаксола, реамберина и адеметионина при повреждении печени противотуберкулезными препаратами (экспериментальное исследование) // Антибиотики и химиотерапия. - 2011. - Вып. 56. - С. 12-16.

6. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. - 1999. - №1. - С. 9-12.

7. Симонова Н.В. Эффективность элеутерококка на фоне ультрафиолетового облучения при адаптации организма к холоду: автореф. дис. канд. мед. наук. - Владивосток, 2004. - 24 с.

8. Доровских В.А., Симонова Н.В., Переверзев Д.И., Юртаева Е.Ю., Штарберг М.А. Сукцинатсодержащий препарат в коррекции процессов липопероксидации, индуцированных введением четыреххлористого углерода // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. - Благовещенск, 2017. - Вып. 63. - С. 75-79.