Результат интеллектуальной деятельности: Способ подавления воспалительной реакции в тканях пародонта в эксперименте

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, клеточным биотехнологиям, и может быть использовано для эффективного ограничения воспаления в тканях пародонта с последующим применением в клинической практике.

В патогенезе пародонтита важную роль играют токсическое действие бактерий и ответная иммунная реакция. Патогенность пародонто-специфических бактерий, таких как Porphiromonas gingivalis, связана с липополисахаридом (ЛПС) мембран этих бактерий. ЛПС активирует реакции системы комплимента и воспалительную активность иммунных клеток, и прежде всего - макрофагов. Кроме того, пародонто-специфические бактерии выделяют разные токсические вещества, такие как H₂S, а также гидролитические и протеолитические ферменты, включая коллагеназы. Эти ферменты разрушают ткани пародонта и благодаря этому, еще больше активируют моноциты и остеокласты (макрофаги костной ткани), которые начинают продуцировать собственные тканевые коллагеназы [1]. Это приводит к формированию порочного круга, который еще больше усиливает воспаление и повреждение окружающих тканей.

Таким образом, бактериальная инфекция и ответная чрезмерная воспалительная реакция иммунных клеток играют ключевую роль в патогенезе пародонтита. В связи с этим, разработка новых способов эффективного ограничения воспаления является одной из приоритетных задач современной стоматологии. В последние годы большое количество исследований посвящено макрофагам, а именно, эффектам их последовательной поляризации в провоспалительный (M1) и антивоспалительный (М2) фенотипы в ходе развития воспаления [2].

Макрофаги являются ключевыми элементами воспалительной реакции. Ml макрофаги продуцируют много провоспалительных цитокинов, протеаз, агрессивных форм кислорода и азота. Эти факторы обладают бактериостатическим действием, но в больших концентрациях могут способствовать деструкции тканей в зоне воспаления. М2 макрофаги продуцируют много антивоспалительных цитокинов и, в отличие от M1 фенотипа, способствуют ограничению воспаления, репарации и ремоделированию поврежденной ткани [2]. На основании многочисленных экспериментальных данных было высказано предположение о возможности разработки технологии управления воспалительной реакцией различной этиологии путем направленного воздействия на процесс поляризации макрофагов. В частности, учитывая антивоспалительный, ремоделирующий и ангиогенный эффекты М2 макрофагов, была сформулирована гипотеза о том, что сдвиг М1/М2 баланса макрофагов в сторону увеличения количества М2 макрофагов в зоне воспаления будет способствовать эффективному подавлению воспалительной реакции [3].

В настоящее время существует несколько стратегий направленного воздействия на М1/М2 баланс макрофагов [3, 4]:

- путем контролируемого высвобождения молекул, воздействующих на поляризацию макрофагов;

- путем подавления экспрессии провоспалительных и усиления экспрессии антивоспалительных генов макрофагов;

- путем использования физических и механических стимулов с целью направленной поляризации макрофагов in situ;

- путем клеточной терапии - при помощи введения макрофагов.

Наиболее близким к заявляемому является способ подавления воспалительной реакции при заживлении ран путем введения суспензии макрофагов [5, 6]. Суспензию макрофагов вводят в рану разными способами: на сухой подложке (бинт, неадгезивная сетка, мембрана и др., на влажной подложке (крем, гель, паста и др.), на твердом биоматериале, пригодном к имплантации, на гелевом биоматериале, пригодном к имплантации, который затвердевает при температуре тела и др. (US 9132154 В2 от 15.09.2015) [7]. Недостатком данного подхода является отсутствие поляризации макрофагов в М2 регуляторный фенотип.

Задачей изобретения является повышение эффективности антивоспалительной терапии при бактериальном инфицировании тканей пародонта.

Технический результат изобретения заключается в достоверном снижении коэффициента миграции лейкоцитов (КМЛ) на поверхность десны при экспериментальном ЛПС-индуцированном воспалении на фоне введения макрофагов регуляторного фенотипа М2 в десну у мышей.

Этот результат достигается за счет того, что в десну вводят макрофаги, поляризованные in vitro в регуляторный фенотип М2, при этом суспензия содержит 250 тыс. макрофагов в 100 мкл среды.

Пародонтит является воспалительным заболеванием, поражающим окружающие зуб ткани десны (пародонт). Лечение пародонтита выполняется терапевтическими или хирургическими методами. Консервативное (терапевтическое) лечение состоит в проведении общих и местных лечебных мероприятий. При проведении местной антивоспалительной терапии лекарственные препараты применяются в виде аппликаций, ирригаций, инъекций, ванночек, лечебных повязок на десну или в пародонтальные карманы. Предложенный способ подавления воспалительной реакции в тканях пародонта является видом местной антивоспалительной терапии и поэтому осуществляется путем введения антивоспалительного препарата в десну.

Как отмечено выше, в ходе развития воспалительной реакции макрофаги последовательно поляризуются в провоспалительный (M1) и антивоспалительный (М2) фенотипы. Как следует из названия данных подтипов макрофагов, способностью к ограничению воспаления, репарации и ремоделированию поврежденной ткани обладают макрофаги регуляторного фенотипа М2. Именно поэтому современные технологии управления воспалительной реакцией различной этиологии основываются на сдвиге М1/М2 баланса макрофагов в сторону увеличения количества М2 макрофагов в зоне воспаления.

Были проведены эксперименты по выявлению эффективной концентрации М2 макрофагов в суспензии, которые показали, что при концентрации М2 макрофагов более 250 тыс.в 100 мкл среды наблюдается агрегация (склеивание) макрофагов и их перепрограммирование на M1 фенотип. Другими словами, 250 тыс. клеток в 100 мкл среды - это максимально возможная концентрация макрофагов, при которой они сохраняют М2 фенотип.

Способ осуществляется следующим образом

Макрофаги выделяют, например, из перитонеальной жидкости мышей по методике Zhang et al. [8]. Мышей наркотизируют, например, хлоралгидратом (32.5 нг/100 г массы тела, в/б). Перитонеальные макрофаги выделяют из перитонеального смыва с помощью центрифугирования при 1000 об/мин, 4 мин. Супернатант отделяют, а осадок ресуспендируют в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой со 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. После выделения макрофаги размещают в плоскодонные лунки 48-милуночных культуральных планшетов в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой (FBS) со 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37С и 5% СО₂. Макрофаги распределяют из расчета 0.5 млн клеток на лунку в 0.5 мл среды.

Для in vitro поляризации макрофагов в М2 фенотип используют, например, «цитокиновую» биотехнологию [9]. При поляризации макрофагов в М2 фенотип с помощью «цитокиновой» модели, макрофаги культивируют в течение 36 часов в среде с нормальным содержанием сыворотки (10%) и добавлением в среду интерлейкина-4 (IL-4) 20 нг/мл.

Для снятия макрофагов со дна культуральной лунки используют, например, трипсин [10]. Из лунок с макрофагами удаляют старую среду и затем добавляют по 1 мл 0.25% раствора трипсина с 0.03% ЭДТА. Плашки инкубируют при 37°С в течение 3 мин. Затем плашки встряхивают. Дальше в каждую лунку добавляют по 1 мл среды и плашку встряхивают. Далее жидкость из лунки сливают в пробирку и добавляют в лунку 1 мл среды, еще раз встряхивают и сливают жидкость в ту же пробирку. Пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту. После этого надосадочную жидкость удаляют из пробирки, а к осадку макрофагов добавляют 1 мл среды и осадок пипетируют до получения гомогенной суспензии макрофагов. С помощью среды RPMI-1640 доводят концентрацию макрофагов до 1 млн клеток/1 мл среды (Раствор А). Из раствора А готовят суспензию 250 тысяч макрофагов в 100 мкл PBS (Раствор Б). Суспензию макрофагов вводят в ткани пародонта, например, путем инъекции. Количество введенных макрофагов должно быть 250 тыс. в 100 мкл PBS.

Пример

Экспериментальные животные. Работа была проведена на 3-х месячных мышах самцах линии C57BL/6J весом 22-24 г. Мыши были получены в питомнике животных «Андреевка».

ЛПС-индуцированное воспаление. Воспалительный компонент пародонтита воспроизводили с помощью ЛПС, выделенного от Porphiromonas gingivalis (Sigma, США) [11]. Животных наркотизировали эфиром и вкалывали ЛПС в дозе 40 мкг справа в верхнюю челюсть между первым и вторым малярами. Для контроля слева в верхнюю челюсть между первым и вторым малярами вкалывали PBS (физиологический раствор). Через 96 часов оценивали локальное воспаление с помощью функционального маркера - миграции лейкоцитов на поверхность десны [12]. Для этого мышь наркотизировали эфиром. Ватным тампоном брали мазок с десны и наносили на стекло. Дальше стекло помещали в закрепитель (спирт) на 5 минут и после высушивали. Затем стекло помещали в краситель Романовского-Гимзе на 30 мин. После окрашивания препарат промывали и высушивали. Подсчитывали количество лейкоцитов и эпителиальных клеток в 5 разных полях зрения. КМЛ выражали как отношение лейкоцитов к числу эпителиальных клеток.

Выделение и культивирование макрофагов. Макрофаги выделяли из перитонеальной жидкости мышей по методике Zhang et al. [8]. Мышей наркотизировали хлоралгидратом (32.5 нг/100 г массы тела, в/б). Перитонеальные макрофаги выделяли из перитонеального смыва с помощью центрифугирования при 1000 об/мин, 4 мин. Супернатант отделяли, а осадок ресуспендировали в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой с 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. После выделения, макрофаги размещали в плоскодонные лунки 48-ми луночных культуральных планшетов в среде RPMI-1640 с 10% сывороткой (FBS) со 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С и 5% СО₂. Макрофаги распределяли из расчета 0.5 млн. клеток на лунку в 0.5 мл среды.

Поляризация макрофагов в регуляторные фенотипы M1 и М2. Д ля in vitro репрограммирования макрофагов была использована «цитокиновая» биотехнология [9]. При репрограммировании макрофагов с помощью «цитокиновой» модели, макрофаги культивировали в течение 36 часов в среде с нормальным содержанием сыворотки (10%) и добавлением в среду 20 нг/мл IFN-γ для получения M1 фенотипа или интерлейкина-4 (IL-4) 20 нг/мл для получения М2 фенотипа. Нерепрограммированные макрофаги имели М0 фенотип, они культивировались 36 часов в нормальных условиях 10% сыворотки без добавления репрограммирующих факторов (IL-4 или IFN-γ).

Были сформированы 3 группы макрофагов:

- группа «М0» - макрофаги, которые культивировались в стандартных условиях с 10% FBS в течение 36 часов. Макрофаги этой группы использовали в качестве контроля.

- группа «М1-цит» - макрофаги, которые культивировались 36 часов при 10% FBS с добавлением IFN-γ в концентрации 20 нг/мл.

- группа «М2-цит» - макрофаги, которые культивировались 36 часов при 10% FBS с добавлением IL-4 в концентрации 20 нг/мл.

Снятие макрофагов с лунки и введение в десну. Для снятия макрофагов с дна культуральной лунки использовали трипсин [10]. Из лунок с макрофагами удаляли старую среду и затем добавляли по 1 мл 0.25% раствора трипсина с 0.03% ЭДТА. Плашки инкубировали при 37°С в течение 3 мин. Затем плашки встряхивали. Дальше в каждую лунку, добавляли по 1 мл среды и плашку встряхивали. Далее жидкость из лунки сливали в пробирку и добавляли в лунку 1 мл среды, еще раз встряхивали и сливали жидкость в ту же пробирку. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту. После этого надосадочную жидкость удаляли из пробирки, а к осадку макрофагов добавляли 1 мл среды и пипетировали до получения гомогенной суспензии макрофагов. С помощью среды RPMI-1640 доводили концентрацию макрофагов до 1 млн. клеток/1 мл среды (Раствор А). Из раствора А готовили суспензию 250 тысяч макрофагов в 100 мкл PBS (Раствор Б). После введения в левую десну ЛПС 40 мкг (для инициации воспаления), через 24 ч вкалывалось 250 тысяч макрофагов в 100 мкл PBS. Были сформированы 6 групп мышей по 10 мышей в каждой:

- «Контроль» - мыши, которым не вводили ни ЛПС, ни макрофаги (интактные мыши).

- «ЛПС» - мыши, которым вводили ЛПС.

- «PBS» - мыши, которым вводили PBS.

- «ЛПС+М0» - мыши, которым вводили ЛПС, а через 24 часа М0 макрофаги.

- «ЛПС+M1-цит» - мыши, которым вводили ЛПС, а через 24 часа М1-цит макрофаги.

- «ЛПС+М2-цит» - мыши, которым вводили ЛПС, а через 24 часа М2-цит макрофаги.

Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 8.0 (Statsoft). Данные представлены в виде средних значений полученных показателей (М) и их ошибок (±m). Вероятность ошибки р<0.05 оценивалась как значимая, р<0.01 - очень значимая и р<0.001 - максимально значимая.

Результаты оценки миграции лейкоцитов на поверхность десны в контроле, при экспериментальном пародонтите и при введении экзогенных макрофагов в зону воспаления представлены в Таблице 1.

КМЛ - отношение лейкоцитов к эпителиальным клеткам в отпечатке с десны.

Значимость различий:

а - р<0.01 между группами «контроль» и «ЛПС»,

б - р<0.01 между группами «ЛПС» и «ЛПС+М0»,

в - р<0.01 между группами «ЛПС+М1-цит» и «ЛПС+М0»,

г - р<0.01 между группами «ЛПС+М2-цит» и «ЛПС+М0».

Видно, что до введения ЛПС в десну, лейкоциты практически не обнаруживались на поверхности десны и коэффициент миграции был близок к нулю. Такая же картина наблюдалась через 96 часов в месте введения PBS (данные в таблице не представлены). Это означает, что сама процедура прокола десны и введения «носителя» не вызывают воспаления.

Через 96 часов после введения пародонто-специфического ЛПС, отмечалась миграция лейкоцитов на поверхность десны мышей с коэффициентом миграции 0.21+0.02. Этот процесс характеризует воспалительную реакцию при экспериментальном пародонтите.

Дальше данные таблицы показывают, что после введения в область воспаления перепрограммированных М0 макрофагов КМЛ увеличился. С большой вероятностью это связано с тем, что в этом случае на поверхность десны также выходят и введенные М0 макрофаги, которые под микроскопом подсчитываются так же, как лейкоциты. Другими словами, при световой микроскопии при подсчете мигрировавших лейкоцитов для определения КМЛ нет возможности различить вышедшие в область воспаления собственные лейкоциты мыши и экзогенные макрофаги, введенные в десну. Это обстоятельство делает целесообразным использовать группу «ЛПС+М0» в качестве группы сравнения при оценке эффектов M1 и М2 макрофагов. Такой подход является допустимым, поскольку во всех группах с введенными макрофагами вводилось одно и тоже количество макрофагов, и соответственно на показатель воспаления могла влиять лишь функциональная активность введенных макрофагов. КМЛ в группе «ЛПС+М0» составлял 0.53+0.04. Именно это значение мы использовали как значение сравнения при оценке про/анти-воспалительного действия M1 и М2 макрофагов, соответственно.

Макрофаги, репрограммированные на M1 фенотип с помощью «цитокиновой» технологии, достоверно увеличивали воспаление в десне по КМЛ. Напротив, макрофаги, репрограммированные на М2 фенотип с помощью «цитокиновой» технологии, достоверно снижали воспаление в десне (Таблица 1).

Полученные результаты позволяют сделать два важных вывода:

- репрограммированные на M1 фенотип макрофаги увеличивали воспаление, индуцированное пародонто-специфическим ЛПС.

- репрограммированные на М2 фенотип макрофаги снижали воспаление, индуцированное пародонто-специфическим ЛПС.

Эти выводы хорошо согласуются с представлениями, о том, что M1 фенотип проявляет выраженные провоспалительные свойства, а М2 - ограничивает воспаление и участвует в репарации и ремоделировании поврежденных тканей.

Литература

1. Hansen Н.В. Role of Matrix Metalloproteinases in human periodontal diseases. J. Periodontol. 1993. Vol. 3: pp. 474-483.

2. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008. Vol. 1(13): pp. 453-461.

3. Alvarez M.M. et al. Delivery strategies to control inflammatory response: Modulating M1-M2 polarization in tissue engineering applications. J. Control. Release. 2016. Vol. 240: pp. 349-363.

4. Lee S. et al. Macrophage-based cell therapies: The long and winding road. J. Control. Release. 2016. Vol. 240: pp. 527-540.

5. Zuloff-Shani A. et al. Hard to heal pressure ulcers (stage III-IV): Efficacy of injected activated macrophage suspension (AMS) as compared with standard of care (SOC) treatment controlled trial. Arch. Gerontol. Geriatr. 2010. Vol. 51(3): pp. 268-272

6. Zuloff-Shani, A. et al. Macrophage suspensions prepared from a blood unit for treatment of refractory human ulcers. Transfusion and Apheresis Science. 2004. Vol. 30: pp. 163-167

7. Патент США "Activated Leukocyte Composition And Uses For Wound Healing" (русс. «Активированные лейкоциты и их использование для заживления ран»), US 9132154 В2 от 15.09.2015

8. Zhang Xia, Goncalves Ricardo, Mosser David M. The Isolation and Characterization of Murine Macrophages. Curr Protoc Immunol. 2008; CHAPTER: Unit-14.1.

9. Лямина С.В., Круглов С.В., Веденикин Т.Ю. Бородовицына О.А., Суворова И.А., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю. Альтернативное репрограммирование М1/М2 фенотипа перитонеальных макрофагов мышей in vitro с помощью интерферона гамма и интерлейкина 4. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2011, №4 (декабрь), стр. 235-242.

10. Rey-Giraud F., Hafher М., Ries С.Н. In Vitro Generation of Monocyte-Derived Macrophages under Serum-Free Conditions Improves Their Tumor Promoting Functions. PLOSone. 2012; 7(8): e42656.

11. Jiang H., Chen W., Zhu G., Zhang L., Tucker В., Hao L., Feng S., Ci H., Ma J., Wang L., Stashenko P., Li Y.P. RNAi-mediated silencing of Atp6i and Atp6i haploinsufficiency prevents both bone loss and inflammation in a mouse model of periodontal disease. PLoS One. 2013. Vol. 8(4): e58599.

12. Кузнецов E.B., Царев B.H. Микробная флора полости рта и ее роль в развитии патологических процессов. Терапевт. стоматол. Учебное пособие. - М.: МЕДпресс-информ. - 2003.