Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ЭКО ПРИ ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНОМ БЕСПЛОДИИ, АССОЦИИРОВАННОМ С ХРОНИЧЕСКИМ ЭНДОМЕТРИТОМ

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, а также к репродуктологии и может быть использовано для прогнозирования эффективности программ ЭКО при проведении предварительного курса иммунокорригирующей терапии препаратом Ликопид.

Среди больных хроническим эндометритом (ХЭ), первичное бесплодие диагностируется в 25% случаев, вторичное - в 36%, неудачные попытки экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбриона - в 60% (Данусевич И.Н. Частота встречаемости хронического эндометрита у женщин с различными вариантами репродуктивных нарушений. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013; 4(92): 18-20). При этом данное заболевание отличается скудностью и неспецифичностью симптоматики (тазовые боли, маточные кровотечения, лейкоцитарная реакция крови), а также низкой чувствительностью и специфичностью клинических методов диагностики, что нередко приводит к учету ложноположительных и ложноотрицательных результатов при статистическом подсчете данных (Park H.J., Kim Y.S., Yoon Т.К., Lee W.S. Chronic endometritis and infertility. Clin Exp Reprod Med. 2016; 43(4): 185-192). Самой очевидной причиной хронизации воспаления при эндометрите является несостоятельность иммунной системы - недостаточно эффективный ответ, а также персистенция устойчивых к терапии штаммов бактерий и вирусов способствуют поддержанию «провоспалительного» фона, значительно снижающего рецептивность эндометрия.

Для коррекции иммунного статуса при гинекологических заболеваниях активно внедряются в практику иммуномодуляторы, иммуностимуляторы и иммуносупрессоры. В частности, таблетированный глюкозаминилмурамилдипептид [4 - О - (2 - ацетиламино - 2 - дезокси - β - D - глюкопиранозил) - N - ацетилмурамил] - L - аланил - D - α -глутамиламид, выпускаемый под торговой маркой ЛИКОПИД, применяется для стимуляции бактерицидной и цитотоксической активности фагоцитов и естественных киллерных клеток, усиления пролиферации лимфоцитов, активизации синтеза специфических антител, а также цитокинов (интерлейкинов, факторов роста и некроза опухоли, интерферона-гамма).

Установлено, что интравагинальное применение препарата Ликопид при хронических инфекционно-воспалительных и дисбиотических заболеваниях нижнего отдела женской репродуктивной сферы в 40% приводит к клиническому выздоровлению и в 60% - к более выраженному иммунному ответу, способствующему выявлению не диагностируемых ранее инфекций (хламидиоз, микоплазма и уреаплазма, вирус простого герпеса). При анализе вагинального секрета обнаружено повышение концентрации интерлейкина-6 (ИЛ-6) и снижение G-GSF на фоне нормализации вагинального микробиоценоза, а также одновременное повышение ИЛ-6, G-GSF и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) при обострении на фоне лечения ликопидом (Аракелян М.А., Галкина О.В., Нестеров И.М., Сысоев К.А., Айламазян Э.К., Тотолян А.А. Дефекты местного иммунитета при хронических инфекционных заболеваниях нижних отделов женского репродуктивного тракта и возможности коррекции ликопидом // Российский иммунологический журнал Т. 1, №10, 2007, с. 56-61).

Известен способ повышения эффективности лечения бесплодия при наружном генитальном эндометриозе I-II стадии с применением Ликопида. После хирургического лечения назначается терапия Ликопидом per os в дозе 10 мг 1 раз в сутки в течение 10 дней послеоперационного периода. Обследование женщин проводят дважды: при поступлении в стационар для проведения хирургического лечения (перед выполнением лапароскопии) и через 1 месяц после операции. Проводят анализ периферической крови у бесплодных женщин с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии, характерным при этом является повышенное содержание TLR2+TNFa+клеток, усиленная экспрессия мРНК RAGE и сниженная внутриклеточная продукция ИЛ-1β. Затем назначается Ликопид и через месяц повторно проводится анализ. Включение Ликопида в комплексную терапию оперированных инфертильных пациенток с наружным генитальным эндометриозом приводит к еще более выраженному повышению количества TLR2+ моноцитов и снижению экспрессии моноцитами мРНК RAGE, а экспрессия мРНК NOD2 - не изменяется. При нормализации продукции ИЛ-1β и положительной реакции моноцитов на лечение: повышение уровня TLR2+ клеток, экспрессии мРНК NOD2 и снижение экспрессии мРНК RAGE, прогнозируется высокая вероятность наступления беременности у пациенток с наружным генитальным эндометриозом I-II стадии (Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И., Красильникова А.К. Нарушения системных реакций врожденного иммунитета у пациенток с бесплодием и эндометриозом I-II стадии и возможность их коррекции препаратом Ликопид // Иммунология, Т. 37, №1, 2016, с. 17-21).

Однако методы работы с клетками дорогостоящи, трудоемки и на сегодняшний день малоприменимы в широкой врачебной практике.

Наиболее близким к заявленному является способ прогноза эффективности использования однократного курса ультразвукового кавитационного орошения матки у женщин с хроническим эндометритом (Чистякова Г.Н., Башмакова Н.В., Погорелко Д.В., Ремизова И.И., Тарасова М.Н., Газиева И.А. патент RU 2506593, МПК G01N 33/48, опубл. 10.02.2014, Бюл. №4). Определяют в сыворотке крови концентрацию интерферона-гамма (ИФН-γ) и ИЛ-6 до проведения курса лечения. Вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,04X₁+0,40X₂-1,89, где Х₁ - концентрация ИФН-γ, пг/мл; Х₂ - концентрация ИЛ-6, пг/мл. При значении PI более 0 делают заключение об эффективном лечении, а при значении PI менее 0 прогнозируют малоэффективное использование. Использование данного способа позволяет своевременно выявить группу женщин, у которых применение однократного курса ультразвукового кавитационного орошения полости матки малоэффективно, что дает возможность определить тактику ведения этих пациенток и за счет дифференцированного подхода повысить результативность лечения до 91%.

Однако концентрации цитокинов в крови относительно нестабильны, в некоторых случаях могут меняться даже в течение суток, поэтому использование одних цитокинов без мониторинга связанных с их синтезом белков представляется недостаточно эффективным в случае приготовления к дорогостоящей и сложной программе ЭКО тем более, что с увеличением количества попыток, снижается вероятность развития беременности.

Назначением изобретения является разработка способа прогнозирования эффективности программ ЭКО с проведением предварительного курса иммунокорригирующей терапии при трубно-перитонеальном бесплодии, ассоциированным с хроническим эндометритом, непосредственно перед началом вступления в программу ЭКО, определением лактоферрина (ЛФ) и интерлейкина-8 (ИЛ-8) в день пункции фолликулов и, в зависимости от результатов, корректировка сроков переноса эмбриона в полость матки для увеличения количества положительных исходов программ ЭКО.

Поставленное назначение достигается способом прогнозирования эффективности программ ЭКО при трубно-перитонеальном бесплодии, ассоциированным с хроническим эндометритом. Способ включает курс лечения и лабораторное исследование сыворотки крови. В рамках подготовки к программе ЭКО проводят комплексную терапию хронического эндометрита, включающую иммунокоррекцию препаратом Ликопид по 10 мг в сутки per os в течение 10 дней. В день пункции фолликулов в программе ЭКО получают образец сыворотки крови, в котором методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют содержание лактоферрина (ЛФ) и интерлейкина-8 (ИЛ-8).

При концентрации ЛФ до 1,8 мкг/мл и ИЛ-8 до 10 пкг/мл, или изолированном повышении концентрации ЛФ до 2,5 мкг/мл при уровне ИЛ-8 до 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность положительного результата программы ЭКО с переносом свежего эмбриона в полость матки; при одновременном повышении концентрации ЛФ более 2 мкг/мл и ИЛ-8 более 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность негативного результата программы ЭКО, в таком случае рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбрионов с целью проведения дополнительной антибактериальной, а также противовоспалительной терапии; при концентрации ЛФ менее 1 мкг/мл при одновременном отсутствии в крови ИЛ-8, прогнозируют высокий риск негативного результата ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбрионов для проведения курса дополнительной противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

Новизна изобретения:

- Проводят комплексную терапию хронического эндометрита, включающую иммунокоррекцию препаратом Ликопид по 10 мг в сутки per os в течение 10 дней в рамках подготовки к программе ЭКО. Ликопид эффективно применяется для профилактики осложнений при острых воспалительных заболеваниях придатков матки - отмечается нормализация базальной и стимулированной активности нейтрофилов (по данным НСТ-теста) и снижение частоты гнойных осложнений.

- В день пункции фолликулов в программе ЭКО получают образец сыворотки крови, в котором методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют содержание ЛФ и ИЛ-8. Анализ выполняется в течение 3 дней, то есть до планирования переноса эмбриона.

- При концентрации ЛФ до 1,8 мкг/мл и ИЛ-8 до 10 пкг/мл, или изолированном повышении концентрации ЛФ до 2,5 мкг/мл при уровне ИЛ-8 до 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность положительного результата ЭКО и переносят в полость матки свежий эмбрион.

- При одновременном повышении концентрации ЛФ более 2 мкг/мл и ИЛ-8 более 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность негативного результата ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона для проведения дополнительного курса антибактериальной, а также противовоспалительной терапии.

- При концентрации ЛФ менее 1 мкг/мл при одновременном отсутствии в крови ИЛ-8, прогнозируют высокий риск негативного результата ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона для проведения курса дополнительной противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

Совокупность существенных признаков позволяет получить новый технический результат, заключающийся в более обоснованном прогнозировании исхода проведенной программы ЭКО, за счет дополнительного определения эффективности применяемого иммунокорректора до переноса эмбриона в программе ЭКО и последующей индивидуализации подготовки к переносу эмбриона в программе ЭКО, что повышает в дальнейшем эффективность программ ЭКО при трубно-перитонеальном бесплодии, ассоциированным с хроническим эндометритом.

Способ отличается малоинвазивностью, обладает достаточной чувствительностью, специфичностью, и позволяет оценить готовность женщины к переносу эмбриона в полость матки, основываясь не только на субъективной оценке клинических проявлений ХЭ, но и на объективных данных клинико-лабораторных исследований и математических подсчетов. Данный прогноз эффективности программы ЭКО позволяет оптимизировать затраты, путем переноса сроков дорогостоящей программы вплоть до улучшения состояния эндометрия, что позволяет существенно повысить процент эффективных исходов программы ЭКО.

Используемые в предлагаемом методе ЛФ и ИЛ-8 выбраны нами после анализа данных опубликованных в открытой печати исследований, свидетельствующих о значительном влиянии Ликопида на функциональную активность нейтрофилов, являющихся продуцентами данных показателей. При этом синтез ЛФ и ИЛ-8 взаимозависим (Legrand D., Elass Е., Carpenter М., Mazurer J. Lactoferrin: a modulator of immune and inflammatory responses. Cell. Mol. Life Sci. 2005; 62: 2549-2559.), и параллельное изучение их концентраций повышает достоверность получаемых прогностических данных.

Ликопид (глюкозаминилмурамилдипептид) представляет собой синтетический аналог структурного фрагмента оболочки (пептидогликана) бактериальных клеток, является активатором врожденного и приобретенного иммунитета, усиливает защиту организма от вирусных, бактериальных и грибковых инфекций; оказывает адъювантный эффект в развитии иммунологических реакций. Биологическая активность препарата реализуется посредством связывания Ликопида с внутриклеточным белком NOD2, локализованным в цитоплазме фагоцитов (нейтрофилов, макрофагов, дентритных клеток). Препарат стимулирует функциональную (бактерицидную, цитотоксическую) активность фагоцитов, усиливает презентацию ими антигенов, пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, повышает синтез специфических антител, способствует нормализации баланса Th1/Th2-лимфоцитов в сторону преобладания Th1. Фармакологическое действие осуществляется посредством усиления выработки ключевых интерлейкинов, фактора некроза опухолей альфа, гамма-интеферона, колониестимулирующих факторов, повышения активности естественных киллеров. При этом Ликопид обладает низкой токсичностью, не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия, не вызывает хромосомных и генных мутаций.

Способ осуществляется следующим образом.

У женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, ассоциированным с ХЭ, обратившимся в клинику для участия в программе ЭКО после первичного клинико-лабораторного обследования, верификации диагноза ХЭ проводят противовоспалительную, антибактериальную терапию с учетом чувствительности выделенной из полости матки микрофлоры в сочетании с иммунокоррекцией препаратом Ликопид по схеме 10 мг в сутки per os на протяжении 10 дней. Затем в день пункции фолликулов в программе ЭКО получают образец венозной крови из локтевой вены, отделяют сыворотку крови и в ней определяют концентрации ЛФ и ИЛ-8 методом твердофазного иммуноферментного анализа. При концентрации ЛФ до 1,8 мкг/мл и ИЛ-8 до 10 пкг/мл, или изолированном повышении концентрации ЛФ до 2,5 мкг/мл при уровне ИЛ-8 до 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность положительного результата ЭКО, и переносят в полость матки свежий эмбрион.

В случае одновременного повышения концентрации в сыворотке крови ЛФ более 2 мкг/мл и ИЛ-8 более 10 пкг/мл, прогнозируют высокую вероятность негативного результата ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона для проведения дополнительного курса антибактериальной, а также противовоспалительной терапии.

Также неблагоприятным в плане прогноза является выявление ЛФ в концентрации менее 1 мкг/мл при одновременном отсутствии в крови ИЛ-8, в таком случае прогнозируют высокий риск негативного результата программы ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона для проведения дополнительного курса противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

При анализе среднестатистических значений содержания ЛФ и ИЛ-8 после применения препарата Ликопид в зависимости от исхода программы ЭКО были получены следующие данные (Табл. 1).

В целом, при последующем позитивном исходе ЭКО в 25% случаев содержание ЛФ было выше 2 мкг/мл. При этом одновременное повышение ИЛ-8 зафиксировано только в 1 случае (8%). При негативном исходе программы ЭКО у 41% женщин было повышено содержание ЛФ и у 22% одновременно повышено содержание ЛФ и ИЛ-8 в крови. При этом еще у 11% женщин, несмотря на применение Ликопида, не обнаруживался в крови ИЛ-8, содержание ЛФ также было ниже 1 мкг/мл.

Мы полагаем, что активация синтеза лактоферрина во многом обусловлена свойствами Ликопида - доказано, что данный белок способен активно подавлять патологическую пролиферацию, является важнейшим фактором мукозального иммунитета, препятствующего патогенной (бактериальной, вирусной) инвазии, модулирует воспалительные реакции.

Однако, учитывая два источника ЛФ в организме: постоянная физиологическая секреция эпителием, а также высвобождение депонированного при дегрануляции нейтрофилов во время воспалительной реакции, эффект данной стимуляции Ликопидом также может быть двойственным:

У одних подобная стимуляция иммунной системы приводит к нормализации физиологических функций и успешной имплантации.

У других - хроническое подострое воспаление переходит в более активную форму и сформированный провоспалительный фон с одной стороны способствует последующему выздоровлению, а с другой - снижает рецептивность эндометрия на период развития адекватного ответа на патогены и условно-патогенные агенты.

Необходимо учитывать и изменения уровня ИЛ-8, синтез которого взаимосвязан с ЛФ - если концентрация белка сама по себе может быть высокой вследствие врожденных особенностей секреции, то одновременное выявление концентраций ЛФ более 2 мкг/мл и ИЛ-8 более 10 пкг/мл свидетельствуют о воспалении, снижающем рецептивность эндометрия и высоком риске негативного результата программы ЭКО.

Отсутствие ИЛ-8 в крови при уровне ЛФ менее 1 мкг/мл на фоне применения иммунокорректора также ассоциировано с негативным исходом и свидетельствует о наличии иммуносупрессии - частое явление при хронической рецидивирующей вирусной инфекции. Прогнозируют высокий риск негативного результата ЭКО, рекомендуют криоконсервацию и отсроченный перенос эмбриона в полость матки для проведения дополнительного курса противовирусной и иммунокорригирующей терапии.

Таким образом, Ликопид при хроническом эндометрите, в рамках комплексной подготовки к программам экстракорпорального оплодотворения значительно влияет на содержание ЛФ и, в несколько меньшей степени на ИЛ-8 и их совместный мониторинг, с последующей индивидуализацией подхода к процессу заключительных мероприятий в подготовке к программе ЭКО позволяет повысить ее эффективность.

Клинические примеры.

Пример 1. Больная Б. 36 лет, с трубно-перитонеальным бесплодием, отсутствие маточных труб. В анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО и один криоперенос, все переносимые эмбрионы были высокого класса качества. При УЗИ органов малого таза выявлены признаки хронического эндометрита в виде неоднородности эхоструктуры и повышенной эхогенности базального слоя эндометрия. Диагноз ХЭ подтвержден данными гистероскопии и морфологического исследования эндометрия. При бактериологическом исследовании аспирата эндометрия выявлен рост хламидии трахоматис, проведен курс антибактериальной терапии с учетом чувствительности выделенной микрофлоры и контролем эрадикации возбудителя в сочетании с лечением Ликопидом по схеме 10 мг в сутки per os в течение 10 дней. После чего пациентка взята в программу ЭКО. При анализе сыворотки крови в день пункции фолликулов выявлена концентрация ЛФ 1,49 мкг/мл и ИЛ-8 3,3 пкг/мл. Соответственно прогноз благоприятный, выполнен перенос свежего эмбриона в полость матки на 5-е сутки культивирования на стадии бластоцисты. Через 3 недели установлено наличие клинической беременности.

Пример 2. Больная К. 32 лет, с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, непроходимостью маточных труб, лечение по поводу генитального хламидиоза в анамнезе. 2 года назад была неудачная попытка ЭКО при переносе в полость матки эмбрионов высокого класса качества. По данным УЗИ, диагностической гистероскопии и морфологического исследования эндометрия диагностирован ХЭ. В посеве эндометрия патологической микрофлоры не выявлено, однако на основании наличия активного ХЭ по данным морфологического исследования перед программой ЭКО проведена антибактериальная терапия препаратом широкого спектра действия в сочетании с лечением Ликопидом по схеме 10 мг в сутки per os на протяжении 10 дней. После проведенного лечения пациентка взята в программу ЭКО. При анализе сыворотки крови в день пункции фолликулов концентрация ЛФ 2,46 мкг/мл ИЛ-8 25,8 пкг/мл. Соответственно прогноз неблагоприятный, эмбрионы криоконсервированы, срок эмбриотрансфера перенесен. В повторном посеве эндометрия выявлен слабый рост хламидии трахоматис, проведен курс дополнительной антибактериальной терапии с учетом чувствительности выделенной микрофлоры, а также противовоспалительная терапия в виде ректальных свечей индометацина 100 мг на протяжении 7 дней. Затем через 1 месяц после повторного лечения выполнен перенос в полость матки размороженного эмбриона. Через 3 недели установлено наличие клинической беременности.

Пример 3. Больная X. 25 лет, причина бесплодия - отсутствие маточных труб после операций по поводу трубных беременностей. В анамнезе - 1 попытка ЭКО с переносом свежего и 2 попытки переноса размороженных эмбрионов высокого класса качества, все три эмбриопереноса неудачные. Рецидивы генитального герпеса 2-4 раза в год. Перед проведением программы ЭКО ремиссия данного заболевания составляла 3 месяца, по данным ИФА титр Ig М к Herpes simplex 1 и 2 типа не обнаруживался, титр высокоавидных Ig G - 1:5, что соответствовало отсутствию активности герпетической инфекции. По данным УЗИ органов малого таза, диагностической гистероскопии, а также морфологического исследования эндометрия верифицирован диагноз ХЭ. В посеве эндометрия выявлен рост микоплазмы гениталис, проведен курс антибактериальной терапии с учетом антибиотикограммы и контролем эрадикации возбудителя в сочетании с лечением Ликопидом по схеме 10 мг в сутки per os в течение 10 дней. После проведенного лечения пациентка взята в программу ЭКО. При анализе сыворотки крови в день пункции фолликулов концентрация ЛФ 0,77 мкг/мл, ИЛ-8 не обнаруживался. Соответственно прогноз неблагоприятный, принято решение об отсроченном переносе эмбрионов, эмбрионы криоконсервированы. Повторный ИФА к Herpes simplex 1 и 2 типов выявил увеличение Ig G в титре до 1:3200, назначен курс противовирусной терапии ацикловиром 250 мг на 500 мл 0,9% физиологического раствора в/в капельно 1 раз в день в течение 5 дней, а также иммунокорригирующая терапия в виде ректальных свечей интеферона в дозе 1 млн. ед. на ночь в течение 10 дней. Затем через 1 месяц после окончания лечения выполнен перенос размороженного эмбриона. Через 3 недели установлен факт клинической беременности.