Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики многососудистого атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца при абдоминальном ожирении

Изобретение относится к области медицины, а именно, к кардиологии и генетике, и может быть использовано для диагностики многососудистого атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) при абдоминальном ожирении (АО).

Известно, что больные ИБС в сочетании с АО характеризуются значительно более тяжелым поражением коронарных артерий и плохим прогнозом, что диктует необходимость более ранней диагностики и своевременного лечения (Fuster J., Ouchi N., Gokce N., Walsh K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 2016 May 27; 118(11): 1786-807).

Кроме того, не всегда можно объяснить, почему одни пациенты при равных условиях имеют однососудистое поражение, в то время как у других выявляются стенозы двух и более коронарных сосудов, что является причиной тяжелого течения и неблагоприятного исхода заболевания. Направленность на персонифицированный подход в современной медицине диктует необходимость изучения и поиска новых высокочувствительных и специфичных факторов риска.

Результаты недавних исследований указывают на участие микроРНК в патогенезе различных заболеваний, в том числе коронарного атеросклероза и его клинического проявления - ИБС (Chao Chen, Murugavel Ponnusamy, Cuiyun Liu, Jinning Gao, Kun Wang, and Peifeng Li. MicroRNA as a Therapeutic Target in Cardiac Remodeling. BioMed Research International. Volume 2017, Article ID 1278436).

Доказана роль микроРНК на всех этапах атерогенеза, включая эндотелиальную дисфункцию (микроРНК-23/27/24, микроРНК-130а, микроРНК-133 и др.), клеточную адгезию (микроРНК-27а/b, микроРНК-221 и др.), формирование и разрыв атеросклеротической бляшки (микроРНК-130а, микроРНК-221, микроРНК-144 и др.), хроническое воспаление, миграцию и активацию моноцитов в стенке сосудов (микроРНК-27а, микроРНК-203 и др.), образование липопротеинов (микроРНК-122, микроРНК-133а/b и др.), активность тромбоцитов (микроРНК-27а, микроРНК-633 и др.), функцию гладкомышечных клеток (микроРНК-26, микроРНК-195 и др.). МикроРНК могут оказывать как протективное, так и повреждающее воздействие (N. Papageorgiou, D. Tousoulis, М. Charakida, et al., Prognostic role of miRNAs in coronary artery disease, Curr. Top. Med. Chem. 13 (2013) 1540e1547; Hamed Mirzaei, Gordon A. Ferns, Amir Avan, Majid G. Mobarhan. Cytokines and MicroRNA in Coronary Artery Disease. Advances in Clinical Chemistry, 2017, Volume 82, 47-70).

МикроРНК контролируют пролиферацию, дифференцировку, метаболизм и апоптоз клеток на посттранскрипционном уровне. МикроРНК не подвержены разрушению РНКазами, и их концентрация может быть измерена в различных биологических жидкостях, в том числе сыворотке крови (Nishiguchi Т, Imanishi Т, Akasaka Т. MicroRNAs and Cardiovascular Diseases. BioMed Research International. 2015; 2015:1-14). Некоторые микроРНК рассматриваются как потенциальные чувствительные диагностические маркеры ИБС, а также инфаркта миокарда.

Очевидно, что микроРНК вовлечены в каждую фазу развития атеросклеротической бляшки. Следовательно, вопрос, может ли определение уровня циркулирующих микроРНК в периферической крови способствовать диагностике, оценке эффективности терапии или прогнозированию течения ИБС является актуальным и сейчас широко обсуждается.

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании персонифицированного высокочувствительного и специфичного способа диагностики многососудистого атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца при абдоминальном ожирении, основанного на эпигенетических особенностях пациента.

Заявленный технический результат достигается в способе диагностики многососудистого атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ишемической болезнью сердца при абдоминальном ожирении, согласно которому определяют уровень экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови и при уровне экспрессии гена микроРНК-203 равном или более 101,00 условной единице экспрессии диагностируют многососудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий.

В литературе нет данных о взаимосвязи микроРНК-203 с тяжестью коронарного атеросклероза, а именно - с числом пораженных коронарных артерий при ИБС у больных с абдоминальным ожирением.

Способ был разработан по результатам обследования 80 больных ИБС без какой-либо иной значимой сопутствующей патологии: 49 мужчин и 31 женщина (средний возраст мужчин 60,7±0,8 лет, женщин - 61,1±1,1 года). По данным коронароангиографии 40 человек имели гемодинамически значимое атеросклеротическое поражение (стеноз) одной-двух коронарных артерий и 40 пациентов - многососудистое поражение коронарного русла (стеноз трех и более артерий). Среди больных 51 человек страдал АО: 34 мужчины и 17 женщин.

Группу сравнения-1 составили 20 обследованных без ИБС, но страдающие АО, без значимой сопутствующей патологии (10 мужчин и 10 женщин), сопоставимые по возрасту с исследуемой группой: р>0,05 (средний возраст мужчин и женщин из группы сравнения-1 - 60,1±1,0 года и 59,7±0,8 года, соответственно).

Группу сравнения-2 составили 20 обследованных без ИБС, без АО и также без значимой сопутствующей патологии (10 мужчин и 10 женщин), сопоставимые по возрасту с исследуемой группой: р>0,05 (средний возраст мужчин и женщин из группы сравнения-2 - 57,9±0,9 года и 60,3±0,9 года, соответственно). Во всех группах оценивали экспрессию гена микроРНК-203 в сыворотке крови.

Диагноз ИБС был доказан клинически и подтвержден ангиографически (коронароангиография) в соответствии с критериями Европейского Общества Кардиологов и Европейской Ассоциации Кардиоторакальных Хирургов 2014 года. Значимость поражения артерий определялась степенью стеноза более 60% сужения просвета для левой коронарной артерии и более 70% для всех остальных артерий (2014 ESC/EACTS Guidelines on myocardial revascularization. European Heart Journal, Volume 35, Issue 37, 1 October 2014, Pages 2541-2619, https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehu278).

Диагноз AO был установлен в соответствии с критериями Международной Федерации Диабета 2005 года (International Diabetes Federation. Worldwide definition of the metabolic syndrome. Available at: http://www.idf.org/webdata/docs/IDF_Metasyndrome_diflnition.pdf. Accessed August 24, 2005) по величине окружности талии для мужчин равной или более 94 см, для женщин - равной или более 80 см.

Экспрессию гена микроРНК-203 в сыворотке крови определяли известным методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2008, 64 с.).

Результаты определения экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови у больных ишемической болезнью сердца и в группах сравнения представлены в таблице.

Значимыми оказались различия экспрессии микроРНК-203 в сыворотке крови между больными ИБС в сочетании с АО и группами сравнения (таблица).

Также различия экспрессии изучаемого гена в сыворотке крови были выявлены у больных ИБС в сочетании с АО в зависимости от количества пораженных атеросклерозом коронарных артерий: при многососудистом поражении коронарных артерий уровень экспрессии составил 145,71±15,73 УЕЭ, при одно-двухсосудистом - 43,70±9,67 УЕЭ, р<0,0001. У больных ИБС без АО подобной закономерности выявлено не было: при многососудистом поражении - 95,58±8,16 УЕЭ и при одно-двухсосудистом - 88,42±7,83, р>0,05.

Для определения порогового значения экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови, при котором у больных ИБС в сочетании с АО достоверно определяется многососудистое поражение коронарных артерий, был использован метод построения классификационных деревьев. Статистическую обработку данных проводили с использованием программной системы STATISTICА для Windows (версия 5.5). Сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводили с помощью непараметрических методов χ². Сравнение количественных параметров осуществляли с использованием модуля ANOVA. Для выяснения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции по Пирсону.

Было установлено, что у пациентов с ИБС в сочетании с АО при уровне экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови равном или более 101,00 УЕЭ многососудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий определяется в 100% случаев (чувствительность - 94,1%, специфичность - 3,5%). Полученное пороговое значение экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови пациентов с ИБС в сочетании с АО в заявленном изобретении взято в качестве диагностического критерия.

Способ осуществляют, например, следующим образом.

Из 300 мкл сыворотки крови пациента с ИБС в сочетании с АО выделяют тотальную РНК стандартным фенол-хлороформным методом с использованием реагента ExtractRNA (Евроген, Москва). Проводят обратную транскрипцию по технологии StemLoop с праймерами, специфичными для микроРНК-203 и референц малой РНК U6. Далее проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени с использованием набора «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ в присутствии красителя EVA Green» (Синтол, Москва). Полуколичественную оценку уровня экспрессии гена микроРНК-203 рассчитывают в УЕЭ по методу 2^-ΔСt, используя для нормализации уровень экспрессии малой РНК U6 (Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2008, 64 с.). При значении уровня экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови равном или более 101,00 УЕЭ диагностируют многососудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

1. Пациентка М., 59 лет. Диагноз: Ишемическая болезнь сердца. Постинфарктный кардиосклероз. Стенокардия напряжения II функционального класса. Абдоминальное ожирение (ОТ - 89 см).

Уровень экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови 117,48 УЕЭ, что по заявленному способу позволяет достоверно определить многососудистое поражение коронарных артерий. Диагноз был подтвержден данными коронароангиографии: атеросклеротические бляшки со значимым стенозом просвета выявлены в четырех коронарных артериях.

2. Пациент Т., 61 год. Диагноз: Ишемическая болезнь сердца. Постинфарктный кардиосклероз. Стенокардия напряжения II функционального класса. Абдоминальное ожирение (ОТ - 112 см).

Уровень экспрессии гена микроРНК-203 в сыворотке крови 68,83 УЕЭ, что по заявленному способу не позволяет достоверно определить многососудистое поражение коронарных артерий, что подтверждено данными коронароангиографии: атеросклеротическая бляшка со значимым стенозом просвета выявлена в одной коронарной артерии.

Заявленный способ основан на эпигенетических особенностях пациента, является высокочувствительным, специфичным, простым в использовании, расширяет представления о факторах неблагоприятного течения ИБС у больных с АО, позволяет с высокой точностью диагностировать многососудистое атеросклеротическое поражение коронарных артерий, что влияет на выбор тактики лечения этих больных и их прогноз.