Способ цветометрического и тест-определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах

Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах.

Расширение спектра объектов химического анализа (пищевые продукты, лекарственные препараты, биологические жидкости, объекты окружающей среды и т.д.), а также многообразие определяемых в них аналитов приводит к значительному увеличению числа анализируемых проб. В связи с этим актуальным является проведение скрининга -предварительного анализа проб экспрессным, доступным, дешевым и простым методом, с возможностью проведения дальнейшего химического анализа при положительном результате определения аналита. Скрининг приобретает особое значение при контроле содержания антибактериальных препаратов, которые нашли широкое применения в пищевой промышленности, в животноводстве и ветеринарии в качестве ингибиторов патогенной микрофлоры. Данная группа веществ вызывает ряд негативных эффектов при поступлении в организм человека в дозах близких или превышающих ПДК: аллергические реакции, дисбактериоз, подавление активности некоторых ферментов, изменение микрофлоры кишечника и т.д. Среди препаратов данной группы ведущую роль занимают тетрациклиновые антибиотики: тетрациклин и доксициклин.

Известен фотометрический способ определения тетрациклина и доксициклина, основанный на внесении в анализируемую пробу раствора хлорамина с последующим фотометрированием полученного раствора (Соловей Н.В., Сааведра Н.Ф. Фотометрическое определение тетрациклина гидрохлорида. - Фармация. 1974. Т. 23. №4. С. 72-73).

Недостатками способа являются низкая чувствительность (0,05 мг/см³) и селективность, что связано с невозможностью проведения определения в окрашенных растворах, а также в присутствии антибиотиков других групп.

Известен способ определения данных аналитов путем обработки анализируемой пробы раствором гидроксида натрия при рН 9,0-10,5 с последующим фотометрированием полученного раствора (А.С. SU 1081487; МПК G01N 21/78; опубл. в 1983).

Недостатком данного способа является то, что в щелочной среде антибиотики тетрациклиновой группы неустойчивы. В зависимости от их концентрации скорость деструкции настолько различна, что количественное определение с установленным доверительным интервалом на уровне 10% практически невозможно. Найденная концентрация антибиотика в одной и той же пробе может быть завышена или занижена на порядок. Это обстоятельство является препятствием к применению данной методики.

Известен способ определения остаточных количеств тетрациклина и доксициклина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ГОСТ 31694-2012. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором), недостатком которого является высокая себестоимость анализа, связанная с использованием дорогостоящих сорбционных патронов и оборудования.

Наиболее надежным из известных способов определения антибиотиков тетрациклинового ряда является иммуноферментный анализ (ГОСТ 32219-2013. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков). Недостатками данного метода являются сложность проведения анализа, трудности оценки специфичности полученных результатов и высокая стоимость.

Наиболее близким по технической сущности (прототип) является способ сорбционно-цветометрического определения тетрациклина, основанный на сорбционном концентрировании тетрациклина на минеральном сорбенте и формировании на сорбенте окрашенного соединения при участии тетрациклина, хлорида железа(III) и [Fe(CN)₆]^4- (Патент РФ №2350950; МПК G01N 33/15, G01N 33/493, G01N 21/78; опубл. в 2009).

Недостатками данного способа является: а) усложнение химического анализа за счет включения в него стадии химического модифицирования поверхности сорбента; б) только визуальное детектирование аналитического сигнала путем его сравнения с колориметрической тест-шкалой. Данный метод является полуколичественным, а регистрация сигнала субъективной, что ограничивает применение данной методики.

Технической задачей изобретения является создание способа количественного (цветометрия) или тест-определения содержания тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах.

Техническая задача достигается путем предварительного сорбционного концентрирования антибиотиков на поверхности синтетического алюмосиликата типа NaX, химически модифицированного Fe(III) с образованием окрашенного комплекса, и дальнейшем цветометрическим или тест-определением тетрациклина и доксициклина.

Технический результат заключается в возможности количественного или тест-определения содержания тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах с достаточно высокой чувствительностью, селективностью, экспрессностью при низкой себестоимости анализа.

Метод основан на предварительном сорбционном концентрировании тетрациклина и доксициклина на поверхности синтетического алюмосиликата типа NaX, химически модифицированного Fe(III), с образованием окрашенного комплекса и последующего количественного цветометрического (детектирование цифровым фотодетектирующим устройством - ЦФУ) или визуального (сравнение с колориметрической тест-шкалой) определения.

Изобретение включает стадии: а) пробоподготовка - удаление из молока или молочного продукта белков и молочного жира, б) сорбция тетрациклина и доксициклина модифицированным Fe(III) алюмосиликатом, в) цветометрическое или тест-определение тетрациклина и доксициклина.

Пример 1. Первая стадия определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах включает пробоподготовку - удаление из пробы белков и молочного жира. Для этого в 100-250 см³ анализируемого продукта вносят 2-3 см³ концентрированной уксусной кислоты и термостатируют при 40-45°С в течение 5-10 мин. Не рекомендуется вести процесс при температуре выше 55-60°С, т.к. это может вызвать частичную деструкцию антибиотиков. Далее пробу перемешивают и центрифугируют 5-7 мин при 3000-5000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу, доводят рН среды до ≈2,5 азотной кислотой (5М) и добавляют 25 см³ универсальной буферной смеси (рН=2,50).

Вторая стадия: сорбция тетрациклина и доксициклина. Полученный центрифугат пропускают через сорбционный патрон, наполненный синтетическим алюмосиликатом типа NaX химически модифицированным железом(III) (0,25⋅10^-3 моль металла на грамм сорбента) со скоростью 1,5-2,0 мл/минуту.

Третья стадия: цветометрическое или тест-определение тетрациклина и доксициклина. Поверхность материала в сорбционном патроне анализируют сразу после пропускания пробы: а) визуально, сравнивая с заранее построенной колориметрической тест-шкалой; б) цветометрически, путем обработки сигнала цифрового фотодетектирующего устройства, например, цифрового фотоаппарата.

Цветометрическая тест-шкала. В 5 колб на 100 см³ вносят 0,1; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 см³ 16 мкг/мл раствора тетрациклина, 20 см³ универсальной буферной смеси (рН=2,50) и доводят объем до метки дистиллированной водой. Полученный раствор пропускают через сорбционный патрон, наполненный синтетическим алюмосиликатом типа NaX химически модифицированным железом(III) (0,25⋅10^-3 моль металла на грамм сорбента) со скоростью 1,5-2,0 мл/минуту. Визуально или с помощью цифрового фотодетектирующего устройства фиксируют окраску алюмосиликата, которая меняется от желтой до темно красной (см. рисунок).

При обработке аналитического сигнала от ЦФУ используют градуировочную зависимость зеленой компоненты цвета при включенных источниках света (вспышка, лампа) с выдержкой экспонирования 1/10 от концентрации тетрациклина или доксициклина в анализируемой пробе.

Результаты определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах методом «введено-найдено» (n=5, Р=0,95) по предлагаемой методике представлены в таблице.

Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах показывает достаточно высокую чувствительность. Предел определения тетрациклина и доксициклина по предлагаемой методике составляет 8 мкг/проба.

Таким образом, предлагаемый способ количественного (цветометрия) и тест определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах, включающий стадию предварительного сорбционного концентрирования антибиотиков на поверхности синтетического алюмосиликата, химически модифицированного Fe(III), с образованием окрашенного комплекса, позволяет проводить предварительный скрининг проб молока и молочных продуктов. Способ отличается экспрессностью, простотой исполнения и экономичностью, не требует применения дорогостоящего оборудования. Он может быть использован в практике лабораторий, осуществляющих химический анализ пищевых продуктов.