ПРЕПАРАТ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОГО ПРИМЕНЕНИЯ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ, АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ И СТИМУЛИРУЮЩИЙ ОБОНЯНИЕ

Изобретение относится к области ветеринарной фармакологии, а именно, применению химических соединения, относящегося к классу пирролов, обладающих антиоксидантной, антигипоксической активностью и влияющий на обоняние, влияющих на мозговое кровообращение, уменьшающих свободно-радикальные процессы.

Фармакологическую основу препарата, который был назван «Одостим» составляет соединение - 1-(4'-метоксифенил)-2-(4'-метилфенил)-3-бензоил-4-гидрокси-5-фенацилпиррол, имеющее общую формулу I:

где Ar=C₆H₅; R=4-CH₃OC₆H₄; R¹=4-CH₃C₆H₄

Разработка препарата начата с определения острой токсичности.

Исследования проводились на белых лабораторных мышах-самцах с массой тела 20±3 г и возрастом около 2 месяцев, которые содержались на стандартном рационе вивария и имели свободный доступ к воде.

Животным натощак однократно перорально вводили дозы вещества с 500 с шагом в 100 мг, предварительно растворив в эквимолярном объеме (0,1 мл на 10 г массы животного) 0,9% раствора хлорида натрия [1]. Гибель животных регистрируется в течение первых двух суток. В дальнейшем у оставшихся в живых подопытных животных общее состояние нормализуется. Результаты обрабатывались по Прозоровскому с вычислением средней смертельной дозы (ЛД₅₀) при p<0,05.

ЛД₅₀ составило 1720 (1600,0÷110,0) мг/кг, что свидетельствует о принадлежности 1-(4'-метоксифенил)-2-(4'-метилфенил)-3-бензоил-4-гидрокси-5-фенацилпиррола к 4 классу токсичности (малотоксичные соединения) по классификации Сидорова-Измерова-Саноцкого [2].

Прототипами препарата, обладающего антиоксидантной активностью является ресвератрол.

Используется как биологически активная добавка в комплексном лечении сердечно-сосудистых заболеваний [3].

Жирорастворимые биоантиоксиданты, в основном, защищают от перекисного окисления мембраны клеток, что является преимуществом соединения I, поскольку мишенью его фармакологического воздействия являются мембраны клеток с высоким содержанием липидов - клеток мозга.

Антиоксидантная активность соединения была определена кулонометрическим титрованием.

Кулонометрическое определение электрогенерированных радикалов брома в среде диметилсульфоксида (ДМСО) проводили на серийном кулонометре «Эксперт-006-антиоксиданты» НПК «Эконикс-эксперт» (г. Москва) при помощи сертифицированной методики выполнения измерений в пересчете на стандартный образец рутин, концентрация образцов составляла 0,2 г на 1 дм³.

Электрогенерацию осуществляли при постоянной силе тока 55,3 мА из водных 0,2 М растворов KBr в 0,1 М H₂SO₄ с определением конца титрования вольтамперометрической индикацией с двумя поляризованными электродами из инертного металла. Выбор метода был обусловлен его экспрессностью, высокой точностью, хорошей воспроизводимостью результатов, способностью брома вступать в радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям, что позволяет охватить практически все группы биоантиоксидантов [4].

Электрогенерацию брома или хлора осуществляют при постоянной силе тока 50,0 мА или 5,0 мА из водных 0,2 М растворов калия бромистого или калия хлористого в 0,1 М растворе серной кислоты с определением конца титрования вольтметрической индикацией с двумя поляризованными электродами из инертного металла (ΔЕ≤1000 мВ). Для проведения измерения в присутствии активных форм кислорода к 0,2 М раствору калия бромистого или калия хлористого в 0,1 М растворе серной кислоты добавляется перекись водорода из расчета 0,4-2,0 г в 100 см³ раствора.

Рабочий и вспомогательный электроды углеситалловые, стеклоуглеродные стержни диаметром 3-4 мм сделаны из инертного металла, впрессованы в тефлоновые шлифы №14,5 и снабжены соединительным кабелем. Вспомогательный электрод (катод) отделен полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.

Опишем процесс кулонометрического определения. В ячейку объемом 50 см³ вводят 20,0 см³ фонового раствора, опускают электроды и включают генераторную цепь. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносят аликвоту исследуемого образца 0,020-2,0 см³ или твердого измельченного образца 0,020-0,200 г. Конечную точку титрования фиксируют по достижении первоначального значения индикаторного потенциала. При этом прибор показывает время определения в секундах (с) в объеме аликвоты исследуемого образца V_{аликвоты} или в навеске исследуемого образца m, введенной в измерительную ячейку. Точка эквивалентности определяется потенциометрически. Анализируют не менее трех проб.

В течение времени выдержки все вещества, обладающие антиоксидантными свойствами, прореагируют с избытком брома или хлора (при добавлении в фоновый электролит перекиси водорода). Время должно быть значительным и составлять от 10 до 100 с, чтобы все антиоксиданты успели прореагировать с бромом или хлором (при добавлении в фоновый электролит перекиси водорода).

После завершения времени перемешивания прибор автоматически оттитрует избыток брома или хлора (при добавлении в фоновый электролит перекиси водорода), численно равный количеству внесенных в пробе антиоксидантных веществ. Конечную точку титрования прибор фиксирует по достижению первоначального значения индикаторного потенциала. При этом на экране прибора и в таблице в компьютере он показывает время анализа в секундах (с).

Вычисление суммарной антиоксидантной активности (САОА) в анализируемой пробе в количестве электричества (кулонах), затрачиваемом на 100 см³ жидкой пробы, вычисляют по формуле:

Q=(100 I t)/V_{аликвоты},

где I - сила тока, равная 5 или 50 мА (в зависимости от диапазона измерений), t - время достижения конечной точки титрования (с), V_{аликвоты} - объем аликвоты (см³).

Вычисление САОА в анализируемой пробе в количестве электричества (кулонах), затрачиваемого на 100 г твердой пробы, производят по формуле:

Q=(100 I t)/m,

где I - сила тока (в зависимости от диапазона измерений), t - время достижения конечной точки титрования (с), m - масса твердой пробы (г).

САОА в пересчете на г рутина на 100 см³ жидкой пробы вычисляют по формуле:

X=KQ,

где Q - САОА анализируемой пробы в количестве электричества (кулонах), К - коэффициент пересчета, определяемый при калибровке электролитической ячейки кулонометра (в г рутина на 1 кулон).

К (коэффициент пересчета, определяемый при калибровке электролитической ячейки кулонометра) вычисляют по формуле:

K=C/Q₂,

где C - концентрация рутина в стандартном растворе в г на 100 см³ раствора, Q₂ - САОА стандартного раствора рутина в кулонах на 100 см³ раствора, вычисленная по приведенной в данном разделе формуле для определения Q.

По результатам кулонометрического титрования рассчитывали суммарное содержание антиоксидантов (АО) в исследуемом образце (АОА_обр.) в г рутина на 100 г образца. Данные по антиоксидантной активности приведены в пересчете на рутин (стандартный образец), а также в % от величины антиоксидантной активности.

САОА_обр. рассчитывалась по формуле:

Значение KR рассчитывали по отношению концентрации рутина в спиртовом растворе стандарта (РСО рутин) к среднему значению Q. Содержание стандарта составляло 50,9 мг на 100 мл спиртового раствора. САОА в кулонах (Q) рассчитывалась по формуле:

Для определения OA хлорирующих и бромирующего реагентов к навеске рутина добавлялась навеска исследуемого реагента, взятого с точностью до 0,0001 г. Определение САОА непрореагировавшего остатка рутина проводили после полного растворения образцов. Рабочий ток кулонометра I-53,3 мА, диапазон измерения - 100, V аликвоты - 100 мкл. OA в г рутина на 100 г образца рассчитывалась по формулам:

и

Результат изучения САОА соединения I и ресвератрола приведен в таблице 1.

Соединение I показало более высокую САОА в пересчете на 1 моль рутина, чем прототип - ресвератрол.

Антигипоксическая активность соединения I проводили на модели нормобарической гипоксии с гиперкапнией на мышах, а также на модели гемической гипоксии.

Острую нормобарическую гипоксию исследовали на белых беспородных мышах-самцах с массой тела 18-22 г, которые находились на стандартном рационе вивария. Исследуемые соединения вводили за 30 минут до начала эксперимента внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. В качестве контроля использовали 2%-ю крахмальную слизь при внутрибрюшинном введении. Острую экзогенную нормобарическую гипоксию вызывали посредством метода размещения лабораторных животных в банки объемом 250 мл одинаковой формы с герметично закрывающимися крышками. Отсчет времени проводили с момента герметизации банок. Антигипоксический эффект определялся по продолжительности жизни мышей в сравнении с контролем - 2% крахмальной слизью [5]. Ближайшими по технической сущности соединениями, обладающими антигипоксической активностью обладают 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат (раствор для инъекций «Мексидол» производства ООО «Фармасофт» (Россия)), и ресвератрол (ООО «Фитопанацея»), которые вводили в дозе 100 мг/кг за 30 минут до начала эксперимента [1, 6, 7].

Гемическую гипоксию исследовали на белых беспородных мышах-самцах с массой тела 18-22 г, которые находились на стандартном рационе вивария. Исследуемые соединения вводили за 30 минут до начала эксперимента внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. В качестве контроля использовали 2%-ю крахмальную слизь при внутрибрюшинном введении. Острую гемическую гипоксию вызывали введением метгемоглобинобразователя 200 мг/кг нитрита натрия. Отсчет времени жизни начинался сразу после введения метгемоглобинобразователя и заканчивался с гибелью животного. В течение 2-3 минут после введения нитрита натрия у животных развивались малоподвижность, боковое положение тела, общая слабость, одышка, судороги. Затем наступала гибель животных. Оценивали продолжительность жизни мышей, которым вводили соединения, в сравнении с контролем (2%-я крахмальная слизь) [8]. Мексидол и ресвератрол вводили в дозе 100 мг/ кг веса животного.

Результаты прироста времени жизни на модели нормобарической и гемической гипоксии приведены в таблице 2.

Соединение I увеличивало продолжительность жизни мышей при нормобарической гипоксии на 46,3% в сравнении с контролем, а при гемической гипоксии на 50,8%, что значительно превышает прирост времени жизни у прототипов - мексидола и ресвератрола.

Ближайшими по технической сущности и принятые за прототипы стимуляторов обоняния у собак являются алкалоид кофеин и фенамин, обладающие стимулирующим (адренергическим) влиянием на ЦНС, увеличивающие частоту и силу сердечных сокращений, тонус мыщц [А.С. Мозжухин, 1946].

Известно, что после приема веществ, возбуждающих нервную систему (кофеин, эфедрин) повышается чувствительность органа обоняния человека к запаху этилового спирта и уксусной кислоты [9].

Задачей изобретения является способ применения соединения I, как стимулятора обоняния, обладающего более низкой токсичностью, чем лекарственные препараты - кофеин и фенамин.

Изучение влияния фенамина на условные рефлексы у собак и некоторых других животных показало, что этот препарат в оптимальных дозах оказывает благотворное влияние на высшую нервную деятельность, большие же его дозы могут вызвать нарушения высшей нервной деятельности (Воронин, Ширкова, 1948; Фаддеева, 1951; Павлов Б.П., 1950; Наметкина, 1955) [10]. А.И. Бронштейн (1950) выясняя влияние стрихнина, кофеина, фенамина и пирамидона на величину порога восприятия запаха таких веществ, как кумарин, камфора и другие, установил, что кофеин повышает чувствительность человека к запаху на 15-20% и фенамин - на 35-55%.

Фенамин оказывается наиболее действенным средством для повышения чувствительности обонятельного анализатора человека по сравнению с другими изученными веществами (кофеин, стрихнин и др.) (Бронштейн, 1951, Серейский, 1943) [11].

Указания об усилении обоняния у собак под влиянием фенамина, кофеина и брома имеются в работе Д.А. Флесса (1952) и Н.М. Мызникова (1958). Л.В. Крушинский (1946) и Д.А. Флесс (1952) провели ряд исследований, в результате которых были уточнены дозировки применения фенамина в отдельности, а также совместно с бромом и кофеином. Оптимальная разовая доза фенамина оказалась для разных собак в пределах 0,01-0,02 г. Возраст в пределах 1-7 лет и пол не имели определяющего значения для величин оптимальной дозы фенамина, но тип высшей нервной деятельности при этом играл определенную роль. Так, у собак с признаками слабости нервной системы (периодические отказы при следовой работе, боязнь выстрелов) средняя доза фенамина - 0,015 г оказалась чрезмерной. Введение фенамина собакам, плохо или недостаточно выдрессированным по розыскной службе, не приводило к существенному улучшению их следовой работы и, следовательно, не могло компенсировать недостаточность их дрессировки и тренировки.

На нескольких собаках выяснилось влияние фенамина на качество выполнения выборки. Фенамин давался собакам за 40-50 мин до испытания. Фенамин заметно улучшал качество выполнения собакой важного приема розыскной службы - выборки.

В результате воздействия данных веществ повышалась продолжительность поиска, улучшалась следовая работа и качества выборки у служебных собак [11].

Фенамин обладает малой широтой терапевтического действия и, в случае передозировки, которая может возникнуть в случае даже незначительного повышения дозы (на 10% выше терапевтической) животные могут погибнуть от возникающих сердечных нарушений - тахикардии и экстрасистолии. Это серьезно ограничивает возможности применения таких стимуляторов обоняния.

Токсичность кофеина (LD₅₀) - 192 мг/кг (перорально, мыши). [12]. Токсичность фенамина (LD₅₀) составляет 353 мг/кг (перорально, мыши) [12].

В сравнении с прототипами соединение I гораздо менее токсично и имеет большую широту терапевтического действия.

Влияние на обоняние изучали на 40 собаках пород немецкая и бельгийская овчарка (малинуа) методом пар - аналогов по 20 собак каждой породы [13].

В эксперименте участвовали здоровые собаки и только после осмотра ветеринарным специалистом. Группы собак - контрольная и опытная - обладали равными навыками и умениями, различались возрастом и полом.

Основными приемами специального курса дрессировки служебных собак являются выборка вещи и выборка человека. Также был определен обонятельный порог, измеряемый количеством листов фильтровальной бумаги, которыми накрывают банки при осуществлении поиска лакомства. На закрепленной доске находились пять чистых одинаковых банок, которые представляли собой пластиковые трубы одинакового диаметра, внутрь одной из банок помещали кусочек вареной свинины размером 2 см³. Банки сверху накрывались фильтровальной бумагой, которая закреплялась резинкой. Для проведения эксперимента была выбрана фильтровальная бумага «Белая лента», соответствующая ГОСТ 12026-76. Фильтрующая способность бумаги была не более 45 с, массовая доля золы - не более 0,2%. (фиг. 1).

После подготовки рабочего места в кабинет запускались кинолог с собакой. Сначала собака отпускалась с поводка для ознакомления с местностью.

После этого кинолог, стоя в 1,5-2 м от банок, подзывал собаку к себе и жестом правой руки направлял собаку для самостоятельного обнюхивания банок. Пуск осуществлялся всегда с одной стороны.

Как только собака обозначала нужную банку, кинолог поощрял собаку и, прицепив поводок, уводил ее из помещения на выгул. В это время банки тщательно промывались другим человеком в перчатках, протирались, добавлялось количество фильтровальной бумаги, банки с «начинкой» менялись местами, после чего кинолог заводил собаку для очередного пуска.

Повторный пуск собаки продолжался до тех пор, пока собака не переставала улавливать запаховые частицы и не находила лакомство.

Кинолог выводил собаку из помещения, в этот момент менялись местами банки, и собака запускалась снова.

Данная процедура повторялась три контрольных раза. По завершению опыта кинолог выгуливал собаку и ставил ее в место содержания. Во второй и третий день ресвератрол в количестве 10 и 15 мг на каждые 10 кг веса давали собакам за 30 минут до прохождения по банкам.

В таблице 3 представлены результаты изучения влияния используемой дозы препарата «Одостим» на эффективность работы собак по выборке вещи и выборке человека в виде качественного (в %) и количественного (времени, потраченного собакой при выполнении упражнения, в мин.) показателей.

Таким образом, был осуществлен подбор оптимальной дозы, которая составила 15 мг на 10 кг веса собаки за 30 минут до выполнения упражнения. Обонятельный порог при применении препарата «Одостим» повысился на 56%, качество прохождения выборки вещи и выборки человека увеличилось на 30%, а количественный показатель - время, затраченное собакой на выборку вещи и выборку человека - уменьшился на 64%. Эффективность применения препарата «Одостим» доказана в опыте на 40 собаках с не менее чем трехкратной повторяемостью каждого упражнения.

Использование антиоксидантов является целесообразным при нарушениях функций организма, вызванных старением, послеоперационных состояниях, а также для повышения уровня жизнедеятельности при экстремальных воздействиях (гипоксия, интоксикации, травмы, физические нагрузки и др.), острых и хронических нарушениях мозгового кровообращения, заболеваниях сердечно-сосудистой системы, при микроэлементозах.

С целью установления общетоксического действия, кумулятивного эффекта была определена субхроническая токсичность препарата «Одостим».

Соединение I скармливали 20 собакам породы немецкая и бельгийская овчарка в дозе 15 мг на 10 кг живого веса животного во время утреннего кормления на протяжении 90 дней [13].

До применения препарата «Одостим» количество эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина и процентное соотношение клеток белой крови у животных не имели достоверных различий в сравнении с референтными показателями. После применения препарата «Одостим» уровень гемоглобина незначительно вырос, что свидетельствует об оптимизации обмена веществ и анаболической активности (табл. 4, 5).

Примечание: * - статистически значимые показатели при p<0,05.

Примечание: * - статистически значимые показатели при p<0,05.

В результате применения препарата «Одостим» в течение 90 дней наблюдалось изменение биохимических показателей крови, а именно увеличение показателей общего белка, глюкозы и мочевины. Положительная динамика свидетельствует об улучшении обменных процессов, анаболического действия «Одостима». Несколько увеличился, но в пределах физиологической нормы, уровень креатинина и α-амилазы, что свидетельствует об активации работы почек и поджелудочной железы.

С целью определения влияния на обоняние было выбрано выполнение собаками выборки человека. Этот эксперимент состоял в том, что 7-10 человек находятся в строю, а при обнюхивании этих людей собака находит у них запрещенные предметы, либо собакой устанавливается человек, который спрятал запрещенный предмет, обнаруженный при обыске.

Было обнаружено, что время выполнения выборки человека на фоне приема собаками соединения I сократилось на 32%, что свидетельствует об эффективном использовании препарата антиоксиданта как стимулятора обонятельной активности.

Перечень вешей, запрещенных к хранению в исправительных учреждениях устанавливается в соответствии со ст. 82 Уголовно-исполнительного кодекса Российской Федерации от 08.01.1997 №1-ФЗ (ред. от 28.11.2015, с изм. от 15.11.2016) [14].

Как известно, шлюзы, контрольные площадки, где проводится досмотр въезжающего и выезжающего автотранспорта из учреждения уголовно-исполнительной системы представляют собой всего хорошо проветриваемые помещения. Концентрация запаха запрещенного предмета уменьшается, что существенно затрудняет поиск этих предметов или человека.

Также нередко осужденные, заключенные или лица, приравненные к ним, используют различные вещества с сильным раздражающим или отвлекающим запахом (бензин, дезодоранты, мыло) с целью маскировки схронов и тайников с запрещенными предметами.

Зачастую интенсивные физические нагрузки, некоторые заболевания животных с длительным латентным периодом способствуют формированию у собак обонятельной усталости [15|.

Все эти факторы являются существенными затруднениями, которые приводят к невыполнению или неудовлетворительному выполнению собакой служебных задач по поискупредметов или человека.

Поставленная задача достигается тем, что за 30 минут до использования в проведении оперативных или режимных мероприятий по поиску запрещенных предметов, веществ и человека служебной собаке с лакомством дают соединение I в дозе 15 мг / 10 кг веса животного.

Список литературы

1. РД 64-126-91 «Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (GLP)». Доступ из справ.-правовой системы «КонсультантПлюс».

2. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ / И.В. Саноцкий. - М.: Медицина, 1970. - 350 с.

3. Моисеева А.М. Фитоалексин ресвератрол: методы определения, механизмы действия, перспективы клинического применения / А.М. Моисеева [и др.] // Вестник фармации. - 2012. - №1 (55). - С. 63-73.

4. Лапин А.А. Суммарная антиоксидантная активность. Методика выполнения измерений на кулонометрическом анализаторе / А.А. Лапин. - Жердевка: Концерн «Отечественные инновационные технологии», 2007. - 6 с.

5. Миронов А.Н. Руководство по доклиническому исследованию лекарственных средств / А.Н. Миронов, Н.С. Бунатян. - М.: Гриф, 2012. - 440 с.

6. Андреева Н.Н. Экспериментальные и клинические аспекты применения мексидола при гипоксии / Н.Н. Андреева. - URL: http://cyberleninka.ru/article/n/eksperimentalnye-i-klinicheskie-aspekty-primeneniya-meksidola-pri-gipoksii (дата обращения: 15.12.2016).

7. Воронина Т.А. Мексидол. Основные эффекты, механизм действия, применение препарата / Т.А. Воронина // Журнал психиатрии и неврологии. - 2003. - №5. - С. 34-38.

8. Сернов Л.Н. Элементы экспериментальной фармакологии / Л.Н. Сернов, В.В. Гацура. - М.: Слово, 2000. - 352 с.

9. Крушинский Л.В. Искусственное усиление обоняния у служебных собак / Л.В. Крушинский // Журнал высшей нервной деятельности. - 1959. - Т. 9. - Вып. 2. - С. 3-7.

10. Крушинский Л.В. Служебная собака / Л.В. Крушинский, Е.К. Меркурьев, И.Е. Израилевич [и др.] - М.: Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1952. - 412 с.

11. Электронный ресурс: http://chemister.ru/Database/properties php?dbid=1&id=728 (дата обращения: 14.12.2016).

12. Электронный ресурс: www.xumuk.ru/spravochnik/199.html (дата обращения: 14.10.2016).

13. Коптев В.В. Основы научных исследований и патентоведения: для с.-х. вузов инженер, и агроном, специальностей / Коптев В.В., Богомягких В.А., Трифонова М.Ф. - М.: Колос, 1993. - 144 с.

14. Электронный ресурс: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_12940/0a3e0fedf5b3ee4ecfca9a7a7d7b256d2803690f/ (дата обращения 11.10.2016).

15. Райт P.X. Наука о запахах. - М.: Мир, 1966. - 221 с.