Результат интеллектуальной деятельности: Оптический способ измерения концентрации и морфологии частиц в широком диапазоне мутностей и устройство для его реализации

Изобретение относится к области измерительной техники, позволяющей измерять концентрации взвешенных в жидкости частиц, а более конкретно к когерентным флюктуационным нефелометрам (далее - КФН), в частности к сконструированным на их основе микробиологическим анализаторам, позволяющим измерять рост микробиологической флоры в том числе в биологических образцах в широком интервале значений мутности, в том числе с целью диагностики и оценивать морфологический состав взвешенных микробных частиц.

Изобретение относится также к созданию иммунохимических и гематологических анализаторов, использование которых подразумевает получение информации не только об абсолютных значениях концентрации в широком интервале значений, но и о морфологических параметрах рассеивающих свет частиц, в частности об изменениях этих параметров как при малых, так и при высоких концентрациях частиц. Примером таких биомедицинских приложений может служить регистрация иммунологических реакций, связанных с агрегацией и дезагрегацией частиц, например, в процессах латексной агглютинации, трансформации или лизиса клеток.

Существуют три основных способа измерения концентрации взвешенных в жидкости частиц путем регистрации мутности взвеси: турбидиметрия (далее - Т), нефелометрия (далее - Н) и КФН. Все эти методы построены на общем принципе, а именно, на регистрации интенсивности и/или флюктуаций интенсивности прошедшего или рассеянного света, регистрируемого одним или несколькими детекторами, при упругом рассеянии света частицами в исследуемой жидкости.

В Т измеряется интенсивность прошедшего через исследуемый образец света, однако, такое измерение характеризуется низкой чувствительностью.

Главным недостатком Н является то, что для достижения высокой чувствительности необходимо исключить засветки на детекторе от оптических элементов и проходящего пучка. Именно поэтому в многоугловых Н, используемых для измерения распределения интенсивности рассеянного света по углам, переход к малым углам сопряжен с решением задачи отсечения засветок, что возможно только при большом расстоянии от кюветы до детектора и высоком качестве кювет и других элементов оптического тракта. Поэтому многоугловые Н не могут применяться для измерения концентраций в широком диапазоне величин, конструктивно сложны и поэтому на их основе не могут быть построены многоканальные системы. [Clin Chem Lab Med. 2012 Jul; 50(7): 1253-62. Low angle light scattering analysis: a novel quantitative method for functional characterization of human and murine platelet receptors. Mindukshev I et al.]

Динамические диапазоны измерений мутности для каждого из этих методов различаются. Конкретно, для измерения концентраций бактерий в колонии образующих единицах (далее КОЕ) указанные методы имеют соответствующие динамические диапазоны измерений: для Т это 10⁷-10¹⁰ КОЕ/мл, для Н это 10⁵-10⁸ КОЕ/мл, и для КФН это 10³-10⁸ КОЕ/мл. Важным является то, что во многих приложениях измерение концентраций и морфологии взвешенных в жидкостях частиц зачастую необходимо проводить в широком диапазоне мутности, а также в широком интервале морфологических параметров взвешенных частиц.

Нередко процесс измерения приходится прерывать в связи с необходимостью перехода к оптической схеме с уменьшенной или увеличенной длиной оптического пути зондирующего пучка, что достигается, например, изменением геометрического размера оптической кюветы, что в аналитических процессах в лабораторной диагностике затруднительно.

Другим широко применяемым аналитическим подходом, обеспечивающим измерение концентрации взвеси в широком интервале мутностей, служит разбавление взвеси в заданной оптической кювете в заданном оптическом приборе. Однако, при исследовании сложных процессов указанные процедуры разбавления или изменения размера кюветы оказывают влияние на протекание самих исследуемых процессов, эффективность которых (например, скорости протекания), зависят в том числе от концентрации. Кроме того, зачастую исследуемая система оказывается уникальной и трудно воспроизводимой, и любое вмешательство в наблюдаемый процесс приводит к ее разрушению. Кроме того, в микробиологических исследованиях дополнительное вмешательство может привести к контаминации посторонними микроорганизмами и к искажению результатов. Таким образом, расширение динамического диапазона измеряемых концентраций при заданных условиях наблюдения исследуемых многопараметрических систем, несомненно, является актуальным.

Измерение рассеянного под малыми углами света методами Н и КФН, являясь более чувствительными, имеют тот недостаток, что не позволяют измерять мутность при высоких концентрациях рассеивающих частиц, т.к. интенсивность регистрируемого сигнала при росте концентрации перестает зависеть от концентрации рассеивающих частиц из-за эффекта многократного рассеяния, а при дальнейшем увеличении концентрации сигнал начинает уменьшаться. Т.е. зависимость регистрируемого сигнала для Н и КФН является немонотонной в широком диапазоне углов. Метод Т, сводящийся к измерению интенсивности не рассеянной части зондирующего пучка света, позволяет регистрировать высокие мутности в монотонном режиме, однако, он не чувствителен к низким концентрациям рассеивающих частиц, т.е. его сигнал практически не изменяется в этом диапазоне концентраций.

Известны устройства, в которых в том числе с целью расширения динамического диапазона измерений мутности, измерения с помощью Н и Т совмещаются в одном устройстве. Примером может служить анализатор специфических белков IMMAGE 800 (Beckman Coulter), в котором одновременно двумя отдельными детекторами регистрируются сигналы Н под углом 90 градусов и Т. Такого рода устройства удобны, например, для регистрации концентрации белковых коллоидных растворов и частиц нанометровых размеров, т.к. такие частицы, имея размер намного меньше длинны видимого света, рассеивают свет почти равномерно по всем углам, и нефелометрическая регистрация рассеянного света под большим углом позволяет надежно отделить свет, рассеянный этими частицами от паразитных засветок, вызванными рассеянием прямого пучка прежде всего на неоднородностях оптической кюветы.

В то же время регистрация мутности этими устройствами в широком динамическом диапазоне, обусловленной частицами больших размеров, например, бактерий, имеющих размер сравнимый с длиной видимого света, становится мало эффективной, т.к. большие частицы рассеивают свет преимущественно вперед и Н регистрация бод большими углами становится неэффективной. А совмещение Т и Н на малых углах чрезвычайно сложно. Однако, регистрация мутностей для частиц, размеры которых больше или сравнимы с длиной волны рассеивающего света, представляет большой практический интерес.

Известен микробиологический анализатор HB&L (Alifax S.p.a.), в котором для повышения эффективности Н измерения мутности, вызванной бактериальной культурой, осуществляют регистрацию интенсивности рассеянного света на нескольких углах, что позволяет более надежно регистрировать рост бактериальной культуры. Между тем динамический диапазон измеряемых концентраций остается в рамках, указанных выше границ, присущих Н методу. В конечном итоге это приводит в том числе к тому, что загрязнения и дефекты кюветы могут по-разному влиять на оба сигнала, что приводит к ухудшению воспроизводимости измерений.

Таким образом, недостатками рассмотренных методов является либо недостаточная чувствительность, в том числе из-за чувствительности к паразитным засветкам, и/или ограниченный динамический диапазон различных каналов регистрации, что приводит к необходимости использовать различные приборы и условия измерения при необходимости измерения мутности в широком диапазоне значений.

Однако, есть задачи, в которых необходимо наблюдать за процессами, происходящими с изменением мутности в широком диапазоне значений, например, при регистрации кривых роста микроорганизмов в питательной среде, в том числе с антибиотиками, что реализуется, например, в биотехнологических и диагностических системах, связанных с ростом микрофлоры, а также, например, при регистрации латексной агрегации или дезагрегации с участием частиц размером, сравнимым или более длины зондирующего света.

Ни один из рассмотренных методов не позволяет совмещать процессы регистрации мутности (т.е. интенсивности рассеянного и/или прошедшего света) и морфологии частиц в процессах агрегации, дезагрегации, деления, лизиса и т.д., регистрация которых усложняется изменяющейся полидисперсностью исследуемых систем. Возможность контролировать мутность и морфологию частиц одновременно в широком интервале мутностей и морфологий расширяет возможности при изучении и идентификации сложных структур в жидкостях, прежде всего живых систем.

Известен способ измерения концентрации частиц в широком диапазоне мутностей [Научный журнал: Приборы и техника эксперимента. Научная статья по теме: «Когерентная флуктуационная нефелометрия: Высокочувствительный метод детектирования частиц в жидкости». Автор Растопов С.Ф.], в котором зондирующий пучок когерентного излучения проходит через кювету с исследуемым образцом, после чего интенсивности прямого прошедшего излучения и рассеянного излучения регистрируются при помощи фотоприемных устройств (ФПУ), при этом измеряют интенсивность прямого прошедшего через кювету с исследуемым образцом излучения Т (турбидиметрия) и флуктуации интенсивности рассеянного света ФИРС на двух углах рассеяния. Данный способ позволяет достичь чувствительностей измерений до 103-104 частиц/мл при достаточно простой конструкции прибора.

Недостатком прототипа является то, что указанный способ детектирования микронных и субмикронных частиц в жидкости основан на измерении флуктуаций интенсивности рассеянного на частицах когерентного излучения и не позволяет оценивать морфологию частиц. Также в известном способе отсутствует возможность измерения частотных характеристик ФИРС.

Наиболее близким к заявляемому способу является анализатор [DOI: http://dx.doi.org/10.15789/2220-7619-2016-4-395-398], в котором одновременно используются один канал регистрации КФН и один канал Т для расширения динамического диапазона, причем угол наблюдения выбран оптимальным для бактериальных клеток размером около 1 мкм и выбранного диапазона концентраций (10⁴-10⁸ КОЕ/мл для КФН) около 7 градусов.

Недостатками прототипа являются следующее:

- регистрация сигналов в прототипе немонотонна в широком динамическом диапазоне измеряемых мутностей и морфологических параметров частиц, т.е. размеры частиц, которые могут быть проанализированы, ограничены.

- невозможность регистрации рассеянного света под различными углами, что необходимо для оптимизации детектирования частиц в широком диапазоне размеров;

- прототип также не позволяет оценивать морфологию частиц, что важно, например, для агрегации частиц и изменениях структуры клеток крови.

- также затруднительно отделить изменение сигналов КФН и Т, вызванное либо изменением количества частиц, либо изменением их морфологии.

Целью заявляемого изобретения является расширение динамического диапазона измеряемой мутности и оценки морфологического состава частиц в исследуемом образце, что достигается за счет одновременной регистрации Т, флуктуаций интенсивности рассеянного света (ФИРС) на различных углах рассеяния (как минимум на двух), вычисления линейной комбинации исходных сигналов ФИРС на различных углах рассеяния и сигнала турбидиметра Т предпочтительно в степени от 2 до 4 с различными весовыми коэффициентами, которые определяют по калибровке для суспензии анализируемых частиц каждого типа, а по вычисленной линейной комбинации сигналов судят о концентрации частиц, по соотношению сигналов ФИРС на различных углах судят о морфологии частиц в образце. Зависимость такого результирующего сигнала от концентрации частиц монотонна в широком диапазоне концентраций и морфологий частиц. Регистрация сигналов ФИРС одновременно под несколькими углами позволяет обнаруживать частицы различных размеров с максимальной чувствительностью. Регистрация соотношения сигналов ФИРС позволяет оценивать морфологию частиц, например, в процессах агрегации частиц.

Дополнительно измеряются частотные спектры частотные спектры ФИРС предпочтительно в полосе более 1 Гц и частотные спектры Т предпочтительно в полосе менее 1 Гц с целью отделить изменения в морфологии частиц от изменений их количества, а также для обнаружения влияния крупных загрязняющий частиц на результирующий сигнал. Указанные пределы частот оптимизированы на основании экспериментальных данных.

Устройство по заявляемому способу (пример реализации) содержит источник когерентного излучения, выполненный в виде лазера, кювету с исследуемым образцом и регистратор интенсивностей прямого прошедшего и рассеянного излучения, выполненный в виде фотоприемных устройств (ФПУ), отличающийся тем, что три или более ФПУ расположены на различных углах относительно оси пучка излучения лазера, причем первый ФПУ расположен на оси пучка излучения (нулевой угол), а его выход соединен со входом измерителя интенсивности, выходы остальных ФПУ соединены с входами измерителей флуктуаций интенсивности через подавители постоянной составляющей сигнала, при этом выход измерителя интенсивности и выходы измерителей флуктуаций интенсивности соединены с вычислительным устройством, которое вычисляет линейную комбинацию сигналов ФИРС и сигнала Т предпочтительно в степени от 2 до 4.

Также с целью отделения изменения в морфологии частиц от изменений их количества, а также для обнаружения влияния крупных загрязняющий частиц на результирующий сигнал устройство дополнительно включает измеритель частотных спектров Т предпочтительно в полосе менее 1 Гц и измеритель частотных спектров ФИРС предпочтительно в полосе более 1 Гц.

Также с целью повышения устойчивости к флуктуациям интенсивности источника излучения ФПУ, регистрирующие ФИРС, выполнены предпочтительно в виде двух фоточувствительных элементов (ФЧЭ) для каждого угла рассеяния, расположенных симметрично относительно оси лазерного пучка, и выходы этих ФЧЭ соединены с различными входами соответствующих дифференциальных усилителей.

Также для детектирования частиц различных размеров с целью оптимизации углов детектирования кювета и/или ФПУ расположены с возможностью движения вдоль оси пучка излучения.

Изобретение поясняется семью фигурами.

На фиг. 1 представлена блок-схема устройства по заявляемому способу, где 1 - лазер; 2 - кювета с исследуемым образцом; 3 - ось лазерного пучка, 4 - ФПУ сигнала Т; 5, 6 - ФПУ сигналов ФИРС; 7 - вычислительное устройство (ВУ); 8 - измеритель интенсивности сигнала Т; 9, 10 - измерители интенсивности сигналов ФИРС; 11, 12 - подавители постоянной составляющей сигналов.

На фиг. 2 представлена блок - схема вычитания сигналов ФИРС в данном угле рассеяния (вид устройства сверху), где 5а и 5в - различные фоточувствительные элементы (ФЧЭ) ФПУ.

На фиг. 3 представлены экспериментальные данные регистрации роста бактерий Е. coli, где 13 - сигнал Т; 14 - сигнал ФИРС в одном угле рассеяния; 15 - результирующий сигнал по формуле (1) ниже для этого угла.

На фиг. 4 схематически представлены результирующие сигналы (1) при различных углах рассеяния без изменения размеров частиц в процессе роста (сплошные линии) и при их агрегации (штриховые линии).

На фиг. 5 представлены экспериментальные данные регистрации роста и «клампинга» бактерий Staphylococcus aureus, 16 - сигнал Т; 17 - сигнал ФИРС на одном угле рассеяния.

На фиг. 6 представлены экспериментальные частотные спектры ФИРС на одном угле рассеяния для измерения мутности суспензии частиц без загрязнений (слева) и при прохождении крупной посторонней частицы через пучок излучения (справа).

На фиг. 7 представлены экспериментальные сигналы ФИРС на четырех различных углах рассеяния для суспензии эритроцитов, которые оседают и агрегируют со временем.

Сущность заявляемого способа измерения концентрации и морфологии частиц в широком диапазоне мутностей состоит в прохождении зондирующего пучка когерентного излучения через кювету с исследуемым образцом, регистрации интенсивностей прямого прошедшего и рассеянного излучения при помощи фотоприемных устройств (ФПУ), при этом одновременно измеряют интенсивность прошедшего через кювету с исследуемым образцом света Т и ФИРС на нескольких углах рассеяния. По соотношению интенсивностей ФИРС различных углах можно судить о размерах исследуемых частиц по индикатрисе рассеяния. Например, при увеличении размера частиц во времени (агглютинация) рассеянный свет концентрируется в основном в меньших углах, что определяется по соотношению сигналов на различных углах.

Для обеспечения монотонности выходного сигнала вычисляется линейная комбинация исходных сигналов ФИРС на различных углах и сигнала турбидиметра Т, взятого в степени от 2 до 4, с различными весовыми коэффициентами, которые определяются по калибровке для суспензий анализируемых частиц каждого типа.

Исходные сигналы ФИРС на различных углах и Т можно суммировать по формуле:

где, - среднеквадратичное отклонение сигнала ФИРС на i-м ФПУ, I_T - интенсивность сигала Т, α_i - весовые коэффициенты, k - степенной коэффициент, находящийся в диапазоне значений от 2 до 4.

Таким образом, сформированная комбинация сигналов позволяет расширить динамический диапазон измеряемых концентраций за счет того, что результирующий сигнал монотонно зависит от концентрации частиц. Такое суммирование сигналов ФИРС также приводит к увеличению чувствительности измерений при низких концентрациях. Кроме того, по результирующему сигналу судят о концентрации рассеивающих частиц данного типа, а по соотношению сигналов ФИРС на различных углах судят о размерах частиц.

Для определения абсолютной концентрации частиц проводят предварительную калибровку результирующего сигнала от концентрации для конкретных Образцовы частиц различной морфологии.

В реальном образце помимо исследуемых частиц могут встречаться различные загрязнения относительно большого размера, а также воздушные пузырьки, которые искажают сигналы Т и ФИРС. Для уменьшения влияния таких посторонних частиц на измеряемую концентрацию исследуемых частиц вычисляют также частотные спектры сигналов. Регистрация спектров сигнала ФИРС позволяет увеличить надежность и точность измерения. Например, при пересечении пучка крупномасштабными загрязнениями, или при образовании микропузырьков воздуха на стенках кюветы, нарушается стандартная форма спектра Фурье сигнала ФИРС. Экспериментально показано, что такие нарушения для Т проявляются предпочтительно на частотах менее 1 Гц, а для ФИРС - предпочтительно на частотах более 1 Гц. Причем, как правило, в этих случаях нарушается сигнал не от всех ФПУ, расположенных на различных углах. В таких измерениях сигналы с нарушенным спектром Фурье могут быть исключены из результирующего сигнала, тем самым уменьшается влияние загрязнений и пузырьков. Кроме того в некоторых процессах, например при регистрации роста бактерий Staphylococcus aureus, общее количество бактерий непрерывно возрастает, однако сигналы ФИРС и Т начинают уменьшаться. Это связно с массивной агрегаций бактерий, известной под названием «клампинг». Возрастание низкочастотных флуктуаций сигнала Т позволяет зарегистрировать этот процесс и отличить его от гибели бактериальной культуры, которая также приводит к падению сигналов ФИРС и Т, но без возрастания низкочастотных флуктуаций сигнала Т. Таким образом, предлагаемый способ и устройство позволяет собирать многопараметрическую информацию о процессах, протекающих в исследуемой взвеси частиц. Эта информация связана с количеством частиц (что определяется сигналами ФИРС и Т), с их морфологией (что определяется соотношением сигналов ФИРС на разных углах), и динамикой движения частиц в кювете (что определяется спектральными Фурье распределениями сигнала ФИРС и Т). Указанная многопараметричность дает возможность контролировать процессы, протекающие в исследуемой взвеси частиц, в формате распознавания образов, формируемых нейросетью и позволяющих идентифицировать тип частиц, участвующих в исследуемых процессах, и их количество.

Устройство по способу реализуется следующим образом (пример конкретной предпочтительной реализации, рис. 1). Устройство состоит из источника когерентного излучения, выполненного в виде лазера, 1, кюветы с исследуемым образцом 2, расположенной на оси пучка лазерного излучения 3, нескольких фотоприемных устройств (ФПУ) для регистрации сигнала Т 4 и сигналов ФИРС 5, 6 (изображены первые два, общее число (типично 8) зависит от необходимой детальности измерений в различных углах), и вычислительного устройства (ВУ) 7. При этом выход ФПУ 4 соединен со входом измерителея интенсивности 8 (например, операционного усилителя (ОУ)), а выходы остальных ФПУ (5 и 6) соединены с входами измерителей флуктуаций интенсивности 9 и 10 (также ОУ) через подавители постоянной составляющей сигнала 11 и 12 (в простейшем случае это просто разделительные конденсаторы). Выходы всех ОУ соединены со входами ВУ 7. В качестве ВУ может быть использован многоканальный аналого-цифровой преобразователь (АЦП) и компьютер либо микроконтроллер, осуществляющий необходимые вычисления, измерения спектров сигналов и отображение результатов измерений.

Для увеличения чувствительности измерений сигналов ФИРС, в частности для вычитания флуктуаций интенсивности излучения источника, соответствующие ФПУ могут быть выполнены в виде пары фоточувствительных элементов (ФЧЭ), например, 5а и 5в (рис. 2, вид устройства сверху), выходы которых соединены с различными входами ОУ 9. При этом синфазные сигналы ФЧЭ вычитаются, а сигналы ФИРС суммируются со случайными фазами, поскольку эти фазы независимы на каждом ФЧЭ, что приводит к увеличению результирующего сигнала ФИРС на выходе ОУ 9 примерно в 1,4 раза.

Поскольку для частиц различных размеров предпочтительно использовать различные углы рассеяния, для изменения регистрируемых углов рассеяния кювету 2 и/или все ФПУ можно закрепить с возможностью перемещения вдоль оси пучка излучения, т.е. с возможностью изменения расстояния от кюветы 2 до ФПУ 5, 6, 7. При этом диапазон регистрируемых углов изменяется при неизменном расположении ФПУ относительно друг друга, а условия протекания процессов в исследуемой системе сохраняются.

В качестве иллюстрации реализации способа и устройства на фиг. 3 приведены экспериментальные данные регистрации кривых роста бактерии Е. coli в диапазоне концентраций 10³-10¹⁰ КОЕ/мл, где 13 - изменение сигнала Т, 14 - изменение сигнала ФИРС (для одного угла рассеяния, около 5 градусов), 15 - результирующий сигнал для одного набора весовых коэффициентов и степени 2 сигнала Т в измеряемом сигнале.

При многоугловой регистрации, чем больше угол рассеяния, тем меньше соответствующий сигнал 15, при этом при неизменной морфологии (размере частиц) относительная разность сигналов в разных углах не изменяется от времени, что схематично представлено на рис. 4 (сплошные кривые), однако, если, например, в процессе роста происходит агрегация частиц (объединение в крупные агрегаты), это проявляется в увеличении относительной разницы сигналов от времени (штриховые кривые).

В микробиологической практике регистрируются кривые роста микроорганизмов в жидком питательном бульоне. Например, бактериальный рост происходит за счет деления бактерий, тем самым их количество увеличивается со временем. При этом если бактерии не агрегируют, то мутность суспензии также будет увеличиваться со временем. В силу определенных обстоятельств, например, при добавлении антибактериальных препаратов в жидкость, бактерии могут начать разрушаться, в этом случае мутность суспензии начнет уменьшаться. Однако, если бактерии начнут агрегировать, при этом продолжая размножаться, мутность суспензии будет падать, и это может быть ошибочно интерпретировано как разрушение бактерий как по сигналу ФИРС, так и по сигналу Т. При этом появление относительно больших агрегатов бактерий приводит к появлению низкочастотных флуктуаций Т, по которым можно отличить гибель бактерий от их агрегации. На фиг. 5 представлены экспериментальные данные регистрации роста и «клампинга» бактерий Staphylococcus aureus, когда агрегации бактерий приводит к ложному уменьшению сигналов ФИРС и Т, и одновременно приводит к появлению низкочастотных флуктуаций сигнала Т, 16 - сигнал Т; 17 - сигнал ФИРС на одном угле рассеяния.

При прохождении крупных загрязнений через пучок излучения, типичная форма частотного спектра сигналов ФИРС искажается. На фиг. 6 представлены экспериментальные частотные спектры ФИРС на одном угле рассеяния для измерения мутности суспензии частиц без загрязнений (6а) и при прохождении крупной посторонней частицы через пучок излучения (6б). Регистрация частотного спектра ФИРС позволяет игнорировать влияние крупных загрязнений на результирующий сигнал.

На фиг. 7 представлены сигналы ФИРС на 4-х различных углах рассеяния (18-21, углы увеличиваются с ростом номера) для суспензии эритроцитов. Клетки оседают и агрегируют со временем, динамика сигналов ФИРС на различных углах отличается, их соотношение может быть использовано для калибровки по размерам агрегатов исследуемых клеток.