Результат интеллектуальной деятельности: ОПТИЧЕСКИЙ СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ КИНЕТИКИ АГРЕГАЦИИ ЧАСТИЦ В МУТНЫХ СУСПЕНЗИЯХ

Изобретение относится к измерительной технике, а точнее к оптическим методам регистрации агрегации частиц при проведении иммунохимических реакций, в том числе для целей клинической диагностики. Такие методы широко применяются в биологии и медицине, как при проведении рутинных измерений в клинико-диагностических лабораториях, так и при разработке и совершенствовании биомедицинских технологий. При этом во многих задачах представляет интерес определение кинетики агрегации (агглютинации, преципитации) микронных и субмикронных частиц. Под кинетикой агрегации понимается зависимость от времени относительной степени агрегации и относительной скорости агрегации от времени. Под относительной степенью агрегации понимается отношение в определенный момент времени оптических сигналов для анализируемого и контрольного образцов (контрольный образец входит в состав диагностического набора). Под относительной скоростью агрегации понимается производная относительной степени агрегации по времени. При иммунологических исследованиях, например, используется метод выявления антител и антигенов, основанный на агглютинации частиц латекса, сенсибилизированных антигенами или антителами (т.е. содержащие антигены или антитела на своей поверхности). На этом принципе основано действие многих современных диагностических наборов реагентов (тест-систем), предназначенных для диагностики различных заболеваний и патологий.

Характерные размеры частиц, участвующих в процессах агрегации, могут находиться в достаточно широких пределах от десятков нанометров до нескольких микрон, в значительных пределах может меняться концентрация этих частиц. Поэтому во многих случаях приходится исследовать агрегацию в достаточно мутных средах.

При исследовании процессов агрегации частиц в жидких средах применяются оптические методы, основанные на измерении изменений интенсивности прошедшего через кювету света (т.н. турбидиметрия), либо рассеянного частицами под некоторым углом (нефелометрия), а также измерении флуктуации интенсивности рассеянного света [2, с.80-88], величина которых также изменяется в процессе агрегации (флуктуационная нефелометрия).

Также широко применяются визуальные методы регистрации, использование которых обусловлено прежде всего простотой постановки реакции агрегации, а также трудностями аппаратурной регистрации оптических параметров в мутных и неоднородных суспензиях.

Размер и концентрация сенсибилизированных частиц должны быть согласованы со способом регистрации. В настоящее время в наборах реагентов, рассчитанных на турбидиметрический или нефелометрический учет результатов, используют агрегацию малых частиц (размер частиц α~0.1λ). Такие частицы относительно слабо рассеивают свет; при концентрации частиц 1-10 мг/мл, типичной для диагностических наборов, длина свободного пробега света L=1/nσ, где n - счетная концентрация частиц, σ - сечение рассеяния одной частицы в таких суспензиях составляет, как правило, порядка 10 мм. Это сравнимо с длиной I оптического пути света в стандартных кюветах (как правило, L≳l). Поэтому суспензии одиночных частиц размером α~0.1λ имеют относительно небольшую мутность и при образовании небольших агрегатов (например, размером в два-три диаметра частиц) мутность (т.е. рассеяние света смесью) сильно возрастает [3]. Маленькие частицы диффундируют достаточно быстро, поэтому скорость протекания реакции их агрегации слабо зависит от наличия и параметров перемешивания реакционной смеси; диффузия обеспечивает равномерное распределение агрегатов и, как следствие, равномерное протекание реакции по всему объему смеси. Таким образом, агрегация малых частиц может быть зарегистрирована методами турбидиметрии и(или) нефелометрии.

Тем не менее, с точки зрения информативности иммунохимического анализа использование больших частиц (α~λ) имеет следующие преимущества по сравнению с использованием частиц малых размеров (α~0.1λ).

Предел обнаружения реакции агрегации по аналиту для больших частиц значительно ниже, чем для частиц малых размеров. Известно, что наиболее эффективное образование агрегатов достигается при определенном соотношении счетных концентраций сенсибилизированных частиц и молекул аналита [4], поэтому для понижения порога обнаружения аналита требуется уменьшение счетной концентрации частиц. При этом уменьшение массовой концентрации частиц приводит к уменьшению скорости реакции и, следовательно, к увеличению времени регистрации. В случае использования больших частиц их счетная концентрация ниже, чем при использовании малых частиц той же массовой концентрации, соответственно ниже порог обнаружения аналита без потери экспрессности диагностического теста. Использование больших частиц позволяет проводить реакцию агрегации в неразбавленных биологических жидкостях, зачастую обладающих значительной мутностью. Для того, чтобы надежно зарегистрировать агрегацию, необходимо, чтобы рассеяние света частицами значительно превышало собственное рассеяние мутной жидкостью. Поскольку частицы большого размера (α~λ) эффективно рассеивают свет [3], их агрегация может быть надежно зафиксирована даже в неразбавленной или в слабо разбавленной биологической жидкости в отличие от маленьких частиц (α~0.1λ), которые слабо рассеивают свет [3], в результате чего для надежной регистрации их агрегации часто требуется сильное разбавление биологической жидкости большой мутности. Использование частиц большого размера позволяет проводить реакции агрегации, например, в цельной крови, что имеет важное диагностическое значение.

Однако реализация названных преимуществ больших частиц в диагностических наборах сопряжена с существенными трудностями, которые перечислены ниже.

Большие частицы медленно диффундируют, поэтому скорость их агрегации сравнительно мала, кроме того, из-за слабости диффузионных потоков образование агрегатов происходит неравномерно по объему реакционной смеси, особенно при малой счетной концентрации аналита. Еще одна проблема состоит в том, что при образовании небольших агрегатов (например, размером в два-три диаметра частиц) интенсивность рассеяния света меняется относительно слабо [3]. Поэтому надежно зафиксировать такую агрегацию можно только на поздних стадиях, когда образуются агрегаты, состоящие из относительно большого числа частиц. Кроме того, суспензии одиночных частиц размером α~λ имеют относительно большую мутность (как правило, L≲0.1 мм, т.е. для стандартных кювет L<<l), что ограничивает применение оптических методов, работающих в предположении однократного рассеяния света. Из-за этих трудностей для диагностических наборов с большими частицами в настоящее время агрегацию фиксируют главным образом по конечной точке визуально, в том числе с помощью фоторегистрирующего устройства. Для такой регистрации большая мутность реакционной смеси и неравномерное распределение агрегатов по объему смеси не является препятствием, в отличие от регистрации с помощью нефелометров и турбидиметров.

Визуальная регистрация степени агрегации, несмотря на простоту и доступность, имеет следующие недостатки.

Визуальное определение степени агрегации характеризуется низкой точностью, являясь по сути качественным или, в лучшем случае, полуколичественным методом. Визуальный учет реакции затрудняет автоматизацию измерений. Необходимое участие персонала почти во всех стадиях проведения реакции повышает частоту ошибок. Визуальный учет реакции производится только по конечной точке реакции агрегации, поскольку образование видимых агрегатов возможно лишь на поздней стадии реакции, когда агрегаты достигнут размера, разрешаемого человеческим глазом (~0,1 мм).

Поэтому предпринимаются попытки оптической регистрации агрегации крупных частиц.

Известен оптический метод измерения размера частиц с помощью многоуглового рассеяния света (MALS), который позволяет измерять размеры частиц в широком диапазоне (от 50 нм до 100 мкм) [5]. Недостатком данного метода, препятствующим его применению к суспензиям большой мутности, является требование сильного разбавления анализируемых суспензий, поскольку метод принципиально работает только при регистрации однократно рассеянного света. Предварительное разбавление суспензии сенсибилизированных частиц привело бы к соответствующему уменьшению скорости агрегации и к многократному увеличению времени ее регистрации, т.е. к уменьшению экспрессности диагностического набора, что крайне нежелательно. Разбавление для целей регистрации после проведения реакции для частиц большого размера также является нежелательной процедурой, т.к. может привести к разрушению агрегатов [2, с.83].

Известен оптический метод динамического рассеяния света (ДРС), позволяющий измерять размер частиц в широком диапазоне (от 1 нм до 6 мкм), допускающий анализ суспензий большой мутности [6]. Недостатком данного метода является большое время получения одного отсчета на кинетической кривой (порядка минуты). Кроме того в ДРС регистрируется рассеянный свет от области смеси относительно небольшого объема (порядка 0,1 мм³), т.н. «когерентного объема», что приводит к увеличению амплитуды низкочастотных флуктуации регистрируемого сигнала из-за неоднородности распределения образующихся агрегатов по объему реакционной смеси. Существенным недостатком метода ДРС для определения агрегации частиц является также принципиальная невозможность организации перемешивания образца в кювете для увеличения скорости реакции и однородного распределения образующихся агрегатов по объему реакционной смеси. Еще один недостаток метода ДРС - высокая стоимость приборов.

Известен оптический метод регистрации агрегации частиц по изменению интенсивности рассеяния света в тонком слое суспензии в многолуночном слайде (Multi-well slide) [7, 8]. Недостатком данного метода является техническая сложность обеспечения перемешивания образца в тонком (толщиной доли мм) слое в лунке слайда для увеличения скорости реакции (такому перемешиванию препятствуют, в частности, силы поверхностного натяжения). Другим недостатком метода является сложность создания стандартной пленки образца в области зондирования пучком света, воспроизводимой от эксперимента к эксперименту.

Известен оптический метод счета и измерения размера частиц и их агрегатов [9] или степени агрегации частиц [7, 8] путем регистрации света, рассеянного частицами и(или) их агрегатами в микрофлюидной кювете. Недостатком метода является невозможность регистрации кинетики агрегации - регистрируется образование агрегатов только на одной определенной стадии реакции, поскольку реакция проводится вне зоны оптической регистрации до помещения смеси в микроканал. Это связано в том числе со сложностью организации перемешивания в микроканале для ускорения агрегации. Также недостатком данного метода является высокая техническая сложность его реализации.

Наиболее близким к заявляемому является «Способ анализа агрегации тромбоцитов и устройство для его осуществления» [10, прототип]. В этом способе световой поток проходит через образец, содержащий тромбоциты и(или) их агрегаты, при этом обеспечивается их перемещение через формируемый оптический канал, что позволяет измерять среднюю интенсивность и одновременно среднеквадратичное отклонение интенсивности прошедшего через образец светового потока от средней интенсивности, вызванное флуктуациями количества тромбоцитов или их агрегатов в оптическом канале, по которым устанавливают средний радиус и концентрацию количества тромбоцитов или их агрегатов в оптическом канале.

Указанный прототип имеет следующие недостатки. Применение данного способа для регистрации агрегации сенсибилизированных частиц большого размера (α~λ) затруднительно, поскольку перемещение частиц или их агрегатов через оптический канал в указанном способе осуществляется за счет перемешивания жидкости в кювете при помощи магнитной мешалки. Однако при таком перемешивании в реакционной смеси устанавливаются только круговые ламинарные потоки, поскольку в кювете агрегометра [10] при максимальной частоте вращения магнитной мешалки число Рейнольдса Re_макс≈500, а турбулентные потоки в системе кювета-магнитная мешалка развиваются при числах Рейнольдса порядка Re_кр≈10000 [11]. Из-за отсутствия турбулентных потоков не происходит значительного увеличения скорости относительного движения частиц жидкости по сравнению со скоростью диффузионных потоков. В результате не происходит значительного увеличения числа столкновений и скорости реакции, поэтому требуется большое время для регистрации агрегации частиц. Например, в случае применения диагностического набора реагентов МАЧ-Endotox spp. [12] время проведения анализа превышает 20 мин. Набор МАЧ-Endotox spp. используется для экспресс-диагностики хирургических инфекций и инфекционных осложнений, и поэтому экспрессность имеет первостепенное значение при его применении. Также при использовании такого способа сигнал, по изменению которого судят о кинетике реакции, сильно флуктуирует из-за слабого перемешивания агрегатов, что снижает точность регистрации кинетики реакции из-за возникающих неоднородностей. При этом интенсификация перемешивания за счет увеличения скорости вращения мешалки не допустима, поскольку приводит к разрушению образующихся агрегатов в зоне взаимодействия с вращающимся стержнем магнитной мешалки.

Целью заявляемого изобретения является преодоление указанных недостатков, а именно сокращение времени регистрации реакций агрегаций и увеличение точности наблюдения кинетики реакций. Это достигается за счет обеспечения интенсивного турбулентного перемешивания объема реакционной смеси, что способствует относительному движению реагирующих частиц даже при их относительно больших размерах со скоростями, значительно превышающими броуновские, поскольку турбулентные течения обладают повышенной способностью к ускоренному распространению химических реакций и способностью нести и передавать взвешенные частицы [13]. Это значительно увеличивает скорость реакции и точность наблюдения ее кинетики за счет ускорения перераспределения образующихся агрегатов по объему смеси. При этом не происходит разрушения образующихся агрегатов, поскольку основная энергия потоков содержится в микротурбулентностях и нет значительного относительного движения слоев жидкости в масштабах макроагрегатов.

Способ иллюстрируется 6 фигурами.

На фиг.1 приведена реализация способа в конической кювете, где 1 - источник зондирующего излучения, например лазер, 2 - кювета с исследуемым образцом, 3 - детектор интенсивности прошедшего излучения, 4 - детектор интенсивности рассеянного излучения, 5 - канал регистрации флуктуации интенсивности рассеянного излучения, 6 - возвратно-поступательный насос.

На фиг.2 приведена реализация способа с применением затопленной струи, где 7 - тонкая трубка.

На фиг.3 приведена реализация способа с применением магнитных частиц, где 8 - механизм создания периодического магнитного поля, например, вращающийся магнит.

На фиг.4 приведены экспериментальные данные по измерению кинетики реакции агрегации в конической кювете при различных способах перемешивания, где 9 - регистрируемый сигнал без механического перемешивания среды, 10 - перемешивание среды магнитными частицами, 11 - перемешивание среды насосом, 12 - одновременное перемешивание насосом и магнитными частицами. Здесь и далее по оси абсцисс - время в секундах, по оси ординат - логарифм интенсивности регистрируемого сигнала.

На фиг.5 приведены экспериментальные данные для кюветы постоянного сечения, где 13 - перемешивание среды насосом в режиме затопленной струи.

На фиг.6 приведены экспериментальные данные по измерению кинетики той же реакции при перемешивании среды существующим способом - магнитной мешалкой.

Предлагаемый способ может быть реализован разными путями; возможные варианты реализации поясняются на примерах ниже описываемых устройств.

Предлагаемый способ может быть реализован при помощи конической кюветы (фиг.1). Излучение, например, лазерного источника 1, пропускают через кювету 2 и регистрируют фотоприемником 3 интенсивность прошедшего излучения и/или рассеянного излучения фотоприемником 4 и/или флуктуации этого излучения по каналу 5 с помощью одного или более фотоприемников. По изменению (увеличению всех трех сигналов в случае исходных больших мутностей) сигналов с фотоприемников судят о протекании реакции. Увеличение сигналов связано с уменьшением мутности среды в процессе образования агрегатов за счет уменьшения многократного рассеяния на частицах среды и уменьшения полного сечения рассеяния всех частиц при образовании больших агрегатов (≳10α) [3]. В случае больших начальных мутностей схема регистрации излучения не имеет большого значения и может выбираться исходя из конкретной конструкции устройства. Например, в случае малопрозрачных кювет (конический пластиковый наконечник пипеточного дозатора) удобно использовать флуктуационную нефелометрию (канал 5), поскольку она не чувствительна к постоянным засветкам.

Исследуемую смесь перемещают вдоль кюветы, например, поршнем 6, совершающим возвратно-поступательное движение и гидродинамически связанным со смесью. Для предотвращения загрязнения смеси между поршнем и смесью может быть воздушный промежуток и/или разделяющая гибкая мембрана. При протекании реакционной смеси по конической кювете в сторону ее расширения (т.н. течение в диффузоре) возможно образование турбулентных потоков при небольших числах Рейнольдса [14, с.113-118], что приводит к увеличению скорости реакции и ускоряет перераспределение образующихся агрегатов по объему смеси.

Также предлагаемый способ может быть реализован по схеме, в которой турбулентные потоки реализуются с помощью т.н. затопленной струи в реакционном объеме (фиг.2). Схема регистрации при этом аналогична фиг 1. В исследуемую смесь помещают тонкую трубку 7, гидродинамически связанную с поршнем 6, в результате чего часть объема смеси периодически втягивается в трубку/выталкивается из нее. Для предотвращения загрязнения смеси между поршнем и смесью может быть воздушный промежуток и/или разделяющая гибкая мембран. При выталкивании реакционной смеси из трубки в кювету образуется т.н. затопленная струя, которая обеспечивает турбулентные потоки в реакционной смеси [14, с.118-121]. Это приводит к увеличению скорости реакции и ускоряет перераспределение образующихся агрегатов по объему смеси.

Также предлагаемый способ может быть реализован помещением в реакционную смесь магнитных частиц, приводимых в движение периодическим магнитным полем. В исследуемую смесь помещают магнитные частицы, поверхность которых инертна по отношению к компонентам реакционной смеси. Источник периодического магнитного поля 8, например, вращающийся постоянный магнит, вызывает образование цепочек магнитных частиц и их циклическое движение в жидкости, которые действуют как множество микромагнитных мешалок, создавая микротурбулентности, что приводит к увеличению скорости реакции и ускоряет перераспределение образующихся агрегатов по объему смеси [15]. При этом концентрация и/или размер магнитных частиц выбирается много меньшим концентрации и/или размера агрегирующих частиц для того, чтобы рассеяние света на рабочей длине волны добавляемыми частицами было значительно меньше собственного рассеяния реакционной смесью. Вследствие высокой мутности реакционной смеси выполнение этого требования вполне реально.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируются следующими экспериментами. Реакцию агрегации активированных частиц диагностического набора МАЧ-Endotox spp. [12] проводили в коммерческом устройстве для анализа агрегации тромбоцитов [10] (агрегометре) и в установке, реализующий настоящий способ. В случае агрегометра использовали стеклянные цилиндрические кюветы внутреннего диаметра 6 мм, объем пробы составлял 320 мкл. Для реализации настоящего способа использовали 2 вида кювет: стандартные наконечники для пипеточных дозаторов 200 мкл и стандартные фотометрические полистирольные кюветы (10×4×25 мм³), при этом объемы проб составляли 120 и 520 мкл соответственно. 20 мкл диагностикума МАЧ-Endotox spp. [12] разбавляли буферным раствором, входящим в состав диагностического набора (в случае перемешивания магнитными частицами также вносили суспензию частиц), затем добавляли контрольную сыворотку в такой пропорции, что во всех реакциях концентрация липополисахарида грамотрицательных бактерий (ЛПС) составляла 100 пг/мл.

На фиг.4-6 представлены кривые агрегации диагностикума МАЧ-Endotox spp. при добавлении контрольной сыворотки при различных видах перемешивания и оптических методах регистрации. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат - десятичный логарифм сигнала (интенсивности или флуктуации интенсивности в случае нефелометрического метода регистрации или метода флуктуационной нефелометрии [1] соответственно). Реакционная смесь термостатировалась при температуре 37°С, добавление контрольной сыворотки производилось в момент времени 0.

На фиг.2 представлены экспериментальные кривые агрегации частиц диагностикума МАЧ-Endotox spp. в коническом наконечнике для пипеточного дозатора в отсутствие перемешивания (9), при перемешивании магнитными частицами по схеме фиг.3 (10), при перемешивании поршнем 6 по схеме фиг.1 (11), а также при одновременном перемешивании по этим схемам (12). При этом регистрировались флуктуации интенсивности рассеянного реакционной смесью света по схеме 5 фиг.1. Видно различное поведение образования агрегатов по времени при различных способах перемешивания, а также то, что их совместное применение приводит к наиболее эффективному образованию агрегатов на всем протяжении реакции.

На фиг.5 представлены кривые агрегации частиц в фотометрической кювете в отсутствие перемешивания (9), при перемешивании магнитными частицами по схеме фиг.3 (10) и затопленной струей по схеме фиг.2 (13). При этом регистрировалась интенсивность рассеянного реакционной смесью света (нефелометрия).

Для сравнения на фиг.6 представлена кривая агрегации диагностикума МАЧ-Endotox spp. в агрегометре при перемешивании магнитной мешалкой по схеме прототипа, скорость вращения 800 об/мин.

Приведенные примеры реакций демонстрируют преимущества регистрации реакции агрегации больших (α~λ) частиц при турбулентном перемешивании. Показано, что турбулентное перемешивание на один-два порядка увеличивает скорость протекания реакции агрегации и точность регистрации ее кинетики.

Таким образом, предлагаемый способ промышленно реализуем и позволяет достичь заявленных целей, а именно существенного сокращения времени регистрации реакций агрегаций и увеличение точности наблюдения кинетики реакций.

Список литературы

1. US 7209231. Optical detection of particles in liquid medium.

2. Latex immunoagglutination assays. J.A. Molina-Bolivar, F. Galisteo-Gonzalez. Polym. Rev.45 (2005) 59-98.

3. An experiment to measure Mie and Rayleigh total scattering cross sections. Cox, A.J.; Deweerd, Alan J.; Linden, Jennifer. American Journal of Physics, Volume 70, Issue 6, pp.620-625 (2002), p.621.

4. TechNote 304. Light-Scattering Assays. Bangs Laboratories, Inc. Rev. #002, Active: 11/April/2008, p.2.

5. Analysis of Aggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals, Wiley, New Jersey, 2012, p.p.37-60, 305-334.

6. Modulated 3D cross-correlation light scattering: Improving turbid sample Characterization. Ian D. Block and Frank Scheffold. REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS 81, 123107 (2010).

7. Sensitive Mie scattering immunoagglutination assay of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) from lung tissue samples in a microfluidic chip. Jae-Young Songa, Chang-HeeLeea, Eun-Jin Choia, KeesungKimb, Jeong-YeolYoonc. Journal of Virological Methods 178 (2011) 31-38.

8. Nanoparticle immunoagglutination Rayleigh scatter assay to complement microparticleimmunoagglutination Mie scatter assay in a microfluidic device. Brian C.Heinze, Jeong-Yeol Yoon. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 85 (2011) 168-173.

9. Counting and sizing of particles and particle agglomerates in a microfluidic device using laser light scattering: application to a particle-enhanced immunoassay. Pamme N, Koyama R, Manz A. Lab Chip. 2003 Aug; 3(3): 187-92. Epub 2003 May 30.

10. WO 8910562. Способ анализа агрегации тромбоцитов и устройство для его осуществления.

11. Similitude in Stirred-Tank Reactors: Laminar Feed. L.J. Forney. AIChE Journal, Vol.49, No.10, pages 2655-2661, October 2003, p.2661.

12. WO 2009/04835. Diagnosticum for determining the presence of total endotoxin (lipopolysaccharide-LPS) of gram-negative bacteria and also the genus and type of gram-negative bacteria producing endotoxin, method for producing said diagnosticum and a set.

13. Большая советская энциклопедия: [В 30 т.]/ Гл. ред. А.М. Прохоров. Издание 3-е. - М.: Сов. энцикл., 1969-1978, т.26., с 324.

14. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика - Издание 5-е. - 2006 Т.VI. Гидродинамика. §23.

15. Effective mixing in a microfluidic chip using magnetic particles. Lee et al. Lab on a Chip. 2009 Feb 7; 9(3):479-82.