СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ-АНАЛИЗА ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ГЕНУ RPS3A

Изобретение относиться к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке наследственного заболевания цитруллинемия (ВС) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.

Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм дины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A.

Так в способе, предложенном R. и др. (2006) [ R., Georgescu S.E., Kevorkian Steliana, Manea Maria Adina, Rebedea Mariana, Dinischiotu Anca, Tesio C.D., Costache Marieta - "Citrullinemia diagnostication on cattle breed", Zootehnie Biotehnologii, Vol. 39(1), 2006, pp. 127-130.], используются праймеры:

F 5'-GGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGACATC-3';

R 5'-CAAGTATGTGTCTCACGGCGCCGCCACAGGAA-3',

инициирующие амплификацию локуса RPS3A-гена длиной 200 bp, с последующим эндонуклеазным расщеплением рестриктазой Ava II, для генерации и интерпретации образующихся генотип-спецефических фрагментов (генотип NN=112/88 bp).

ПЦР-программа:

x1: 95°С - 5 мин

х35: 95°С - 30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 1 мин

х1: 72°С - 10 мин

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.

Сущность способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A, отличающийся тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:

Используется режим амплификации:

x1: 94°C - 5 мин

х30: 94°C - 30 сек, 55°C - 30 сек, 72°C - 30 сек

x1: 72°C - 10 мин

Условия проведения реакции

Экстракция нуклеиновой кислоты из ушных выщипов крупного рогатого скота, осуществлялась перхлоратным методом с двойной очисткой (Методические рекомендации по проведению ДНК-тестирования племенных животных субъектов племенного животноводства на устойчивость к наследственным заболеваниям, утвержденные на НТС Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь №22 от 20.02.2016 г.).

ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл. №1.

Праймеры:

Режим амплификации

х1: 94°С - 5 мин

х30: 94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 30 сек

х1: 72°С - 10 мин

Хранение 4-8°С

ПЦР-продукт = 200 bp

Инкубация при 37°С в течение ночи

ПЦР-ПДРФ-фрагменты:

Генотип NN = 103/82 bp,

Генотип NF = 185/103/82 bp,

Электрофорез в 3% агарозном геле

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг. 1. - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A

Обозначения:

М - ДНК-маркер 50bp (ОДО «Праймтех», Беларусь)

1-5 - генотип NN,

PCR - амплификация локуса RPS3A-гена длиной 198 bp

Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электорофореза в 3% агарозном геле в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия.

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК-маркерами (ОДО «Праймтех», Беларусь).

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (NN, NF) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-спецефических фрагментов (NN=103/82 bp, NF=185/103/82 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 185 bp, 103 bp и 82 bp являются идентификационными.

Источник информации

1. R., Georgescu S.E., Kevorkian Steliana, Manea Maria Adina, Rebedea Mariana, Dinischiotu Anca, Tesio C.D., Costache Marieta - "Citrullinemia diagnostication on cattle breed", Zootehnie Biotehnologii, Vol. 39(1), 2006, pp. 127-130.