Результат интеллектуальной деятельности: Способ серологической диагностики вирусных болезней лососевых рыб методом иммуноферментного анализа и диагностический набор для осуществления способа

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, вирусологии и может быть использовано для выявления антигенов возбудителей вирусных болезней рыб в биологическом материале, как для диагностики, так и для научных исследований методом иммуноферментного анализа.

Аквакультура в России носит комплексный многоотраслевой характер, за счет использования крупнейшего в мире фонда внутренних водоемов и прибрежных акваторий морей. При этом одна из существенных проблем, сдерживающих развитие отечественной акваиндустрии - вирусные болезни выращиваемых гидробионтов, такие как: инфекционный некроз поджелудочной железы лососевых {Infectious pancreatic necrosis, IPN), инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых {Infectious hematopoietic necrosis, IHN), вирусная геморрагическая септицемия {Viral haemorrhagic septicaemia, VHS).

Сейчас диагностика вирусных болезней рыб в лаборатории требует культивирования вируса на клетках рыб, что занимает достаточно длительное время и выполняется только в крупных научно-исследовательских институтах, имеющих профильные лаборатории. [Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых рыб; Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб; Инструкция о мероприятиях по борьбе с вирусной геморрагической септицемией рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 87-113]. Эти методы долгие, а результат анализа напрямую зависит от таких факторов, как опыт и компетенция специалиста, проводящего работу, физиологического состояния и биологических особенностей используемой линии клеток, поэтому, применение современных методов будет, несомненно, востребовано при диагностике.

Известен способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, преимущественно рота-, коронавирусного энтеритов, вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий взаимодействие антигенов с антителами, с антивидовыми антителами, меченными пероксидазой хрена, добавление субстратной смеси и учет результатов по интенсивности окраски образовавшегося комплекса, характеризующийся тем, что в реакции используют планшеты с предварительно сорбированными на них антигенами. [Патент №2472162]

Единственным известным набором для проведения серологической диагностики вирусных болезней рыб является ТФ ИФА, который содержит специфический герпесвирусный антиген для сенсибилизации планшет, специфическую герпесвирусную и нормальную сыворотки в качестве положительного и отрицательного контроля, антивидовой пероксидазный конъюгат к иммуноглобулину сибирского осетра для выявления комплекса антиген-антитело, используемые для выявления противогерпетических антител в сыворотке осетровых рыб, разработанный во ВНИИВВиМ в 2012 году, который предлагается использовать в научно-исследовательских и ветеринарных лабораториях для ретроспективной диагностики герпесвирусной болезни сибирского осетра (SbSHV). Однако, поиск антител - это ретроспективная диагностика, которая актуальна только при подозрении на герпесвирусную инфекцию осетровых рыб в межэпизоотический период, и непригодна для выявления антигенов возбудителей за счет длительного времени образования антител в живом организме. [Shchelkunov I. et. al. 2012]

При диагностике вирусных инфекций лососевых рыб важна оперативная информация, на ранних этапах развития заболевания и для быстрого подтверждения диагноза во время эпизоотии, поэтому необходимо анализировать наличие в организме рыб антигена возбудителя для своевременного принятия карантинных мер и профилактических мероприятий. Сведения по использованию комбинированного иммуноферментного анализа и существованию диагностических наборов для выявления вирусных болезней рыб в аналогичном формате в современной литературе отсутствуют.

В задачу исследований входило - разработать чувствительный и эффективный способ серодиагностики наиболее распространенных вирусных болезней лососевых рыб: инфекционного некроза поджелудочной железы (IPN), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHN), вирусной геморрагической септицемии (VHS) и сократить время на постановку диагноза за счет одновременного исследования образцов биоматериала на три заболевания.

Сущность предполагаемого изобретения состоит в использовании диагностического набора, включающего все необходимые компоненты для проведения иммуноферментного анализа, позволяющего выявлять антигены IPN, IHN и VHS одновременно в образцах биологического материала от рыб на ранней стадии развития болезни с высокой специфичностью и чувствительностью. Принцип способа заключается в следующем: специфические иммуноглобулины к вирусам-возбудителям IPN, IHN и VHS, иммобилизованные на поверхности лунок одного полистиролового микропланшета, связываются с гомологичными антигенами, если они присутствуют в исследуемом материале, образуя комплекс антиген-антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется путем взаимодействия с иммуноферментным конъюгатом, фермент которого, после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. Интенсивность окраски в лунке микропланшета пропорциональна содержанию специфического антигена в испытуемом образце, результаты учитывают по общепринятой формуле.

Диагностический набор для выявления вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS содержит: планшет полистироловый 96-луночный, сенсибилизированный иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS; положительный контрольный образец IPN, инактивированный (IPN К⁺); положительный контрольный образец IHN, инактивированный (IHN К⁺); положительный контрольный образец VHS, инактивированный (VHS К⁺); отрицательный контрольный образец, инактивированный (К^-); конъюгат 1, представляющий собой анти-IPN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 2, представляющий собой анти-IHN антитела, меченные пероксидазой хрена; конъюгат 3, представляющий собой анти-VHS антитела, меченные пероксидазой хрена; раствор для разведения конъюгата (РК); промыватель - концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином-80 (ФСБ-Тх25); субстрат - раствор тетраметилбензидина (ТМБ); стоп-реагент; ванночка для реагентов. Компоненты набора расфасованы в пластиковые флаконы разного объема с завинчивающимися крышками и упакованы в коробки.

ПРИМЕР 1.

1. Подготовка исследуемого материала

Для обнаружения антигенов IPN, IHN и VHS в качестве испытуемого используют биопсийный материал внутренних органов (почка, печень, селезенка), экссудат и/или вируссодержащую надосадочную жидкость культур клеток. Для получения 10%-ной суспензии биоматериал гомогенизируют до получения однородной массы на ФСБ (рН7,2-7,4). Полученную суспензию сливают в стерильную посуду и используют для исследования.

2. Подготовка компонентов для постановки реакции

Для промывания планшетов, при постановке реакции, готовят содержащий твин-80 фосфатно-солевой буфер: размешивают содержимое флакона с ФСБ-Т*25, при выпадении в концентрате осадка прогревают его до полного растворения солей, и разводят дистиллированной водой до 700 мл. Хранят при 4°С до 5 суток.

Растворы конъюгатов 1, 2, 3 в рабочем разведении готовят непосредственно перед использованием, к 0,05 мл концентрированного раствора добавляют 15 мл раствора для разведения конъюгата (РК), тщательно перемешивают.

Раствор ТМБ готов к применению, непосредственно перед использованием отбирают в пластиковую ванночку 12 мл. Остатки раствора ТМБ из ванночки нельзя сливать во флакон с исходным раствором ТМБ. Хранят при 4°С в течение всего срока годности набора.

3. Постановка реакции

Перед началом анализа лунки планшета промывают один раз промывочным раствором. В каждую лунку вносят по 300 мкл раствора, через пять минут после заполнения лунок раствор аккуратно удаляют. Остатки влаги из лунок тщательно удаляют, постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

В первые лунки рядов планшета сенсибилизированных иммуноглобулинами к IPN, IHN и VHS вносят по 100 мкл специфических положительных антигенов (IPN К⁺, IHN К⁺, VHS К⁺). Во вторые лунки каждого ряда вносят 100 мкл отрицательного антигена. Во все остальные лунки по 100 мкл исследуемых образцов (желательно делать 2-3 повторности). Лунки на планшете сенсибилизированы следующим образом: иммуноглобулинами к IPN (1, 4, 7, 10 ряды), IHN (2, 5, 8, 11 ряды), VHS (3, 6, 9, 12 ряды). Внесение материала в плашку сопровождают тщательным перемешиванием пипетированием в течение 5-7 секунд. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут.

Растворы конъюгатов №1,2,3 в рабочем разведении готовят за пять-десять минут до окончания инкубации.

По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т от несвязавшихся антигенов, после чего удаляют влагу постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.

В лунки рядов 1, 4, 7, 10 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 1 (IPN) в рабочем разведении. В лунки рядов 2, 5, 8, 11 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 2 (IHN) в рабочем разведении. В лунки рядов 3,6,9,12 планшета вносят по 100 мкл раствора конъюгата 3 (VHS) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при комнатной температуре (21-25°С) 60 минут. По окончании инкубации планшет отмывают четыре раза ФСБ-Т после чего удаляют влагу постукиванием.

Во все использованные лунки планшета вносят по 100 мкл раствора ТМБ. Для внесения раствора ТМБ используют пластиковую ванночку, входящую в состав набора. Планшет инкубируют при комнатной температуре, в защищенном от света месте, 25-30 минут.

Реакцию заканчивают добавлением во все лунки 100 мкл стоп-реагента.

4. Учет результатов

Результаты реакции учитывают через 2-3 минуты после добавления стоп-реагента, проводя измерение оптической плотности (ОП) в каждой лунке на спектрофотометре с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм или визуально. Результаты исследований учитывают только при соблюдении следующих условий:

- значение ОП в лунке с отрицательным контролем не более 0,30 о.е.

- значение ОП в лунке с положительным контролем не менее 0,62 о.е. Реакцию оценивают по формуле и выражают в виде процента реактивности:

процент реактивности (%) = (ОП-ОПК^-)/(ОПК⁺-ОПК^-)Х100%,

где ОП - оптическая плотность образца, ОПК⁺ - оптическая плотность положительного контроля, ОПК^- - оптическая плотность отрицательного контроля.

Границы пороговых значений: при величине % >22% реакция считается положительной, значение % <10% - реакция отрицательная, а диапазон % от 10% до 22% - сомнительные результаты реакции.

ПРИМЕР 2.

Подготовку исследуемого материала, подготовку компонентов для постановки реакции, постановку реакции осуществляют аналогично описанному в примере 1, но инкубацию планшета после внесения положительных, отрицательных и исследуемых образцов проводят в течение 4-6 часов при температуре 4°С (в холодильнике), после чего работу и учет результатов продолжают по стандартной схеме. Получают результаты аналогичные таковым в примере 1.

Предложенный способ и набор позволяют в течение трех часов с достоверностью 98% определять в образцах биологического материала наличие возбудителей вирусных болезней лососевых рыб. Использование «холодной инкубации» (в течение 4-6 часов при температуре 4°С, в холодильнике) позволяет получать достоверные, аналогичные результаты в течение одного дня, с перерывом для оператора в ходе работы, что по разным причинам также может быть удобно. Лунки на планшете сенсибилизированы следующим образом: иммуноглобулинами к IPN (1, 4, 7, 10 ряды), IHN (2, 5, 8, 11 ряды), VHS (3, 6, 9, 12 ряды). В один планшет можно разместить от 2-х образцов биоматериала в трех повторностях до 24 образцов без повторений. Планшет может быть использован весь одновременно или в 4 приема, для чего использованные ранее ряды высушивают промывателем и заклеивают пленкой, или просто помечают маркером.

Диагностический набор разработан и апробирован с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ФГБНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко в период октябрь 2015 - декабрь 2016 года.

Предложенный способ найдет применение в системе мониторинга, проводимого органами ветеринарной службы страны, что позволит контролировать распространение вирусных болезней рыб и сохранять здоровье культивируемых рыб, а также в научных исследованиях для тестирования существующих и новых клеточных линий, в селекционно-племенной работе, для получения информации о закономерностях циркуляции вирусов-возбудителей IPN, IHN и VHS в аквакультуре России и диких популяциях рыб.

Источники информации

1. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 96-104.

2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и борьбе с инфекционным некрозом гемопоэтической ткани лососевых рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 87-95.

3. Инструкция о мероприятиях по борьбе с вирусной геморрагической септицемией рыб// Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб (часть 1), Москва, отдел маркетинга АМБ-агро, 1998, с. 105-113.

4. Патент №2472162 Способ серологической диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

5. Shchelkunov I. Further virus characterization, diagnostics and prevention of Siberian sturgeon herpesvirus disease / Igor Shchelkunov, Andor Doszpoly, Tatiana Shchelkunova, Inna Prokaeva, Fatima Kalabekova, Ismail Kalabekov, Dmitry Kurenkov // USA-Russia Bilateral Workshop On Aquaculture and FishHealth USGS Western Fisheries Research Center, Seattle, WA, USA October, 2012, pp. 1-5.