Результат интеллектуальной деятельности: Способ диагностики преэклампсии на сроках гестации до 34 недели по оценке уровней вазоконстриктора ANG(1-8) и возодилятатора ANG(1-7)

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии, связано с разработкой способа диагностики преэклампсии путем определения уровня соотношения Ангиотензина II (ANG (1-8) и Ангиотензина 1-7 (ANG (1-7), в том числе, у пациенток со сложностью оценки тяжести преэклампсии и недостаточными клинико-лабораторными данными.

Развитие беременности нередко осложняется разнообразными патологическими процессами и заболеваниями как со стороны матери, так и со стороны плода. К одному из наиболее грозных можно отнести преэклампсию. Преэклампсия (ПЭ) - это мультисистемное патологическое состояние, развивающееся при беременности, клинические признаки которого манифестируют после 20-й недели гестации, частота распространения достигает 2-8% [Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia // Semin Perinatol. 2009. Vol. 33(3). P. 130-137]. Повышение артериального давления является ведущим в генезе преэклампсии. Одной из наиболее значимых систем организма человека, отвечающей за повышение сосудистого тонуса и регуляцию артериального давление, является ренин-ангиотензиновая система. Известно, что ANG II (ANG (1-8)) является мощным вазоконстриктором, в то время как ANG (1-7) обладает вазодилатирующими свойствами (Brenner & Rector's the kidney Skorecki, Karl; Chertow, Glenn M; Marsden, Philip A; Taal, Maarten W; Yu, Alan S L. Tenth edition. Philadelphia, PA: Elsevier, 2016; Gironacci MM. Angiotensin-(1-7): beyond its central effects on blood pressure. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2015; 9(4):209-16).

Актуальность проблемы вызвана необходимостью поиска дополнительных критериев оценки степени тяжести преэклампсии для разработки адекватной тактики ведения беременных женщин и снижения частоты неблагоприятных исходов беременности при данном осложнении.

К настоящему времени известен способ (RU 2478966 С1, Редьков О.В и др. 10.04.13) оценки степени тяжести преэклампсии, который включает анализ плазмы периферической венозной крови беременных, вынашивающих плод мужского пола, после 20 недель беременности определяют концентрацию плодовой ДНК и при концентрации плодового генетического материала от 1,8 до 2,6 нг/мл прогнозируют преэклампсию средней степени тяжести, при концентрации 2,6 нг/мл и выше - преэклампсию тяжелой степени. Хотя данный способ очень точен, он не применим, если женщина вынашивает девочку.

Наряду с этим, описан метод диагностики преэклампсии у беременных в сроки 24-40 недель беременности (RU 2483311 Макаров О.В. и др. 27.05.13), при котором с помощью твердофазного иммуноферментного анализа сыворотки крови определяют содержание аутоантител класса IgG к двуспиральной ДНК, антигенам мембран тромбоцитов TrM-001-15 и TrM-015-12, антигенам почечной ткани KiM-05-300 и KiS-07-120 и антигену митохондрий печени НММР. Далее для каждого вида исследованных антител определяют соотношение аутоантител в опытной сыворотке к контрольной сыворотке. Однако недостатком данного метода является его трудоемкость и необходимость определения большого спектра антител.

Также известен метод оценки тяжести преэклампсии с помощью изучения содержания тромбоцитов в венозной крови, когда по уровню тромбоцитопении судят о степени тяжести преэклампсии (Преэклампсия: руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Т. Сухих, проф. Л.Е. Мурашко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. С. 226-228). Недостатком данного способа является низкая степень его достоверности из-за наличия многочисленных механизмов тромбоцитопении (включая наличие аутоиммунного механизма, связанного с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови, анемией, изменением объема циркулирующей крови и другими), в том числе и не характерных для беременности, а также отсутствием четкой зависимости между степенью тяжести преэклампсии и выраженностью тромбоцитопении.

Имеется способ диагностики преэклампсии путем определения уровня альфа-амилазы в сыворотке крови количественным методом (RU 2426129 С1, Гребенкин Б.Е. и др., 10.08.2011). При уровне альфа-амилазы 28-100 Ед./л диагностируют умеренную преэклампсию. При уровне альфа-амилазы >100 Ед./л - преэклампсию тяжелой степени. К недостаткам способа следует отнести возможность получения высоких значений альфа-амилазы и, следовательно, ложноположительного результата при наличии заболеваний поджелудочной железы. Кроме того, отсутствуют данные о точности, специфичности и чувствительности данного способа.

Зарегистрирован также способ диагностики преэклампсии (RU 2408259 С2, Абрамова и др., 10.01.2011) по сердечно-сосудистым параметрам. Если при увеличении срока беременности скорость распространения пульсовой волны снижается, диагностируют физиологическое развитие беременности, а при отсутствии снижения или при нарастании скорости прогнозируют развитие преэклампсии. Недостатком указанного способа является необходимость наблюдения пациенток в течение длительного периода. В случаях, когда существует необходимость быстрой и достоверной верификации заболевания, данный способ не может быть применим.

Существует способ диагностики преэклампсии на основании мониторинга артериального давления и частоты сердечных сокращений в течение суток (RU 2002105984 A, Гурьева В.М. и др., 20.11.2003). По результатам исследования, каждое из измеренных диастолических давлений соотносят с максимально допустимым для данной частоты сердечных сокращений (ЧСС), вычисленным по формуле АД диаст=[-0,569+17,7*log (чcс)]. В случае, когда превышение максимально допустимого диастолического давления наблюдается более чем в 55% измерений днем и/или более чем в 70% ночью, диагностируют преэклампсию тяжелой степени. Недостатки способа: способ трудоемок, длительность диагностического процесса отсрочивает правильную постановку диагноза, отсутствует возможность диагностики преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией ввиду возможности получения ложноположительного результата.

Известно, что преэклампсия с клиническими проявлениями до 34 недель относится к ранней преэклампсии, связана с задержкой развития плода, имеет наиболее тяжелое клиническое течение и неблагоприятный прогноз (Magee L.A., Pels A., Helewa М., Rey Е., von Dadelszen P. Diagnosis, evaluation and management of the hypertensive disorders of pregnancy: execultive summary // J. Obstet. Gynaecol. Can. 2014. Vol. 36. N5. P. 416-441; Гипертензивные расстройства во время беременности, родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. Клинические рекомендации (протокол лечения) 2016). Однако определение точного диагноза и, в зависимости от этого, выбор акушерской тактики является основной задачей врача.

Таким образом, несовершенство объективных способов диагностики преэклампсии приводит к недооценке истинной степени тяжести, более поздней диагностике и, как следствие, неэффективности лечебных мероприятий.

Диагностика преэклампсии на ранних стадиях имеет наиболее важное значение для определения тактики ведения беременности и сроков родоразрешения.

Целью изобретения является повышение объективности диагностики преэклампсии на сроках до 34 недель, улучшение перинатальных исходов.

Способ осуществляют следующим образом

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для диагностики преэклампсии на сроках до 34 недель гестации. Для этого посредством иммуноферментного анализа (ИФА) на образцах плазмы крови определяют концентрацию вазодилататора ANG (1-7) и вазоконстриктора ANG (1-8), а также соотношения ANG (1-7)/ANG (1-8).

Определение маркеров проводят методом количественного иммуноферментного анализа с использованием наборов Angiotensin 1-7 (Ang1-7), Angiotensin II (Ang1-8) на образцах 0,2 мл плазмы крови.

Плазма крови (0,2 мл) получают из цельной крови, взятой из локтевой вены, объемом 3 мл, в пробирку с ЭДТА, центрифугируют на оборотах 3000 об/мин в течение 20 мин, при наличии концентрации вазодилататора ANG (1-7) менее 500 пг/мл, и при соотношении ANG (1-7)/ANG (1-8) менее 25 диагностируют преэклампсию.

Методика подготовки плазмы крови:

У пациентки берут кровь из вены в пробирку с ЭДТА, объемом 3 мл. Образцы подвергают центрифугированию на 3000 оборотах в течение 20 мин. На полученных образцах плазмы можно определять концентрацию ANG (1-8) и ANG (1-7).

Протокол определения ANG (1-8)

1. Перед использованием все реагенты должны достичь комнатной температуры (18-25°С).

2. Все реагенты, стандарты, контроль, образцы подготавливаем в соответствии с инструкцией производителя используемого раствора.

3. Вносим в соответствующие лунки по 100 мкл рабочего раствора антител к ANG (1-8). Закрываем лунки микропланшета адгезивной пленкой и инкубируем 1,5 часа при комнатной температуре, и аккуратном перемешивании (1-2 цикла/сек).

4. Удаляем раствор из лунок и промываем все лунки микропланшета 4 раза, буфером для промывок, используя по 300 мкл буфера на лунку на цикл

промывки. Используем многоканальную пипетку. Для получения точных результатов полностью удаляем жидкость из лунок микропланшета между циклами промывки. После последнего цикла промывки удаляем остатки промывающего буфера декантированием.

5. Вносим в соответствующие лунки по 100 мкл стандартов, положительного контроля и образцов, а в первую лунку-бланк только рабочий разбавитель. Закрываем лунки микропланшета адгезивной пленкой и инкубируем 2.5 часа при комнатной температуре, аккуратном перемешивании (1-2 цикла/сек).

6. Удаляем раствор из лунок и промываем все лунки микропланшета 4 раза, как это указано в пункте 3.

7. Вносим во все лунки по 100 мкл приготовленного раствора конъюгата HRP-стрептавидина. Инкубируем ровно 45 минут при комнатной температуре, аккуратном перемешивании (1-2 цикла/сек).

8. Удаляем раствор из лунок и промываем все лунки микропланшета 4 раза, как это показано в пункте 3.

9. Вносим по 100 мкл раствора субстрата ТМВ во все лунки. Инкубируем 30 минут при комнатной температуре в темноте и при аккуратном перемешивании (1-2 цикла/сек).

10. Вносим по 50 мкл стоп-раствора во все лунки, немедленно считаем абсорбцию (ОП) при длине волны 450 нм.

Протокол определения ANG (1-7)

1. Все реагенты, стандарты, образцы подготавливаем в соответствии с инструкцией производителя используемого раствора. Все стандарты и образцы анализируем в дублях.

2. Вносим в соответствующие лунки микропланшета по 50 мкл стандартов, образцов, а в первую лунку-бланк рабочий разбавитель. После этого сразу же добавляем по 50 мкл рабочего раствора антител к ANG (1-7). Осторожно встряхиваем микропланшет, покрываем адгезивной пленкой. Инкубируем 1 час при 37°С.

3. Удаляем раствор и промываем все лунки микропланшета 3 раза буфером для промывок, используя по 350 мкл на лунку за один цикл промывки (время экспозиции между внесением и удалением промывающего буфера 1-2 мин.). Используем многоканальную пипетку. Для получения точных результатов полностью удаляем жидкость из лунок микропланшета между циклами промывки. После последнего цикла удаляем остатки промывающего буфера декантированием.

4. Вносим во все лунки по 100 мкл раствора коньюгата HRP-стрептавидина. Закрываем лунки микропланшета адгезивной пленкой и инкубируем 30 минут при 37°С.

5. Удаляем раствор из лунок и промываем все лунки микропланшета 5 раз, как указано в пункте 3.

6. Вносим по 90 мкл субстрат-раствора с тетраметилбензидином (ТМВ) микропланшета адгезивной пленкой и инкубируем 20-30 минут при 37°C, в защищенном от света месте.

7. Вносим по 50 мкл стоп-раствора во все лунки, немедленно считаем абсорбцию (ОП) при длине волны 450 нм.

Примеры.

Пример 1. Пациентка К., 29 лет, поступила на 32 неделе гестации с повышением давления до 150/100 мм рт.ст. У пациентки была взята кровь из вены, центрифугирована, на полученных образцах плазмы крови методом ИФА были определены уровни ANG (1-8) и ANG (1-7), которые составили 20,18 пг/мл и 406,6 пг/мл, соответственно; соотношение ANG (1-7) и ANG (1-8) было равно 20, что свидетельствовало о преэклампсии.

При последующем получении данных клинико-лабораторного исследования, наблюдения и анализа истории родов установлено наличие признаков повышения артериального давления выше 160/100 мм рт.ст., и повышенного содержания белка в суточной моче выше 0,9 г/сут, на основании чего сделано клиническое заключение о развитии у беременной тяжелой преэклампсии.

Пример 2. Пациентка С., 31 года, на 31 неделе гестации, поступила в НЦАГиП им В.Н. Кулакова с артериальным давлением 150/100 мм рт.ст., белком в моче 0,9 г в сутки. В связи с нарастанием тяжести преэклампсии перед оперативным родоразрешением, взята кровь, образцы плазмы подвергнуты иммуноферментному анализу, согласно описанной методике.

У пациентки была взята кровь из вены, центрифугирована, на полученных образцах плазмы крови методом ИФА был определен уровень ANG (1-8), который составил 25,078 пг/мл, уровень ANG (1-7) составил 404,88 пг/мл, соотношение ANG (1-7) и ANG (1-8) было равно 16, что свидетельствовало о преэклампсии.

При последующем получении данных клинико-лабораторного исследований и анализа истории родов установлено наличие признаков повышения артериального давления выше 160/100 мм рт.ст., и повышенного содержания белка в суточной моче выше 1 г/сут, на основании чего сделано клиническое заключение о развитии у беременной тяжелой преэклампсии.

Пример 3. Пациентка С. 38 лет на сроке 33 недель поступила с появлением эпизодов повышенного артериального давления и подозрением на развитие преэклампсии поступила для наблюдения и последующего родоразрешения. Перед родоразрешением, была взята кровь, образцы плазмы подвергнуты иммуноферментному анализу, согласно описанной методике.

Уровень ANG (1-8) и ANG (1-7), составили 15,3 пг/мл и 520 пг/мл, соотношение ANG (1-7) и ANG (1-8) было равно 34, что свидетельствовало об отсутствии преэклампсии. При последующем получении данных клинико-лабораторного исследований и анализа истории родов установлено наличие признаков повышения артериального давления до 145/90 мм. рт.ст., и наличия содержания белка в суточной моче до 0,1 г/сут. При анализе результатов клинического течения и лабораторных показателей белка в моче в истории родов сделано заключение о наличии гестационной артериальной гипертензии, но отсутствии у беременной преэклампсии.

Предлагаемый способ позволяет улучшить точность диагностики преэклампсии, а, следовательно, и лечения данного контингента больных.

Диагностические возможности предлагаемого способа были проверены при сопоставлении результатов иммуноферментного анализа и данных клинико-лабораторных обследований 59 беременных, находившихся на лечении в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова. У 12 из них была диагностирована преэклампсия на сроках до 34 недели гестации на сроках, у 17 - гестационная артериальная гипертензия, но не преэклампсия, у 30 - нормальное течение беременности.

Работа выполнена в рамках Государственного задания по теме «Изучение диагностической и прогностической роли молекулярно-генетических, иммунологических, эпигенетических факторов в развитии преэклампсии» №государственной регистрации 116-08-22-1-000-2.

Источники информации

1. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia // Semin Perinatol. 2009. Vol 33 (3). P. 130-137.

2. Преэклампсия: руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Т. Сухих, проф. Л.Е. Мурашко. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. С. 226-228.

3. Brenner & Rector's the kidney Skorecki, Karl; Chertow, Glenn M; Marsden, Philip A; Taal, Maarten W; Yu, Alan S L. Tenth edition. Philadelphia, PA: Elsevier, 2016.

4. Gironacci MM. Angiotensin-(1-7): beyond its central effects on blood pressure. Ther Adv Cardiovasc Dis. 2015; 9(4): 209-16.

5. Magee L.A., Pels A., Helewa M., Rey E., von Dadelszen P. Diagnosis, evaluation and management of the hypertensive disorders of pregnancy: execultive summary // J. Obstet. Gynaecol. Can. 2014. Vol. 36. N5. P. 416-441.

6. Гипертензивные расстройства во время беременности, родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия. Клинические рекомендации (протокол лечения) 2016.