Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ГЕНТАМИЦИНА СОПОЛИМЕРОМ ВИНИЛПИРРОЛИДОНА С ДИАЦЕТАЛЕМ АКРОЛЕИНА

Изобретение относится к биотехнологической или медицинской промышленности, в частности, к способу синтеза совиаля (сополимера винилпирролидона с диацеталем акролеина), модифицированного гентамицином (аминогликозидный антибиотик) за счет формирования азометиновых или одинарных ковалентных связей.

Известные научно-технические решения направлены на: (1) преодоление антибиотико-резистентности микроорганизмов; (2) повышение специфической активности и увеличение спектра противомикробного действия; (3) снижение токсичности действующего начала и увеличение периода его полувыведения из организма реципиента.

На современном этапе развития науки и техники возможно выделить два основных направления исследований и разработок, ориентированных на решение указанных выше задач:

- во-первых, создание комплексов антибиотик-носитель на основе нековалентных связей без изменения структуры действующего начала;

- во-вторых, модификация антибиотика с изменением его структуры и на основе формирования прочных ковалентных связей в составе химерного конъюгата, сохранившего противомикробную активность.

Известен способ повышения фармакологической активности и снижения уровня побочных эффектов, если в качестве носителя используется диоксид кремния, а технология изготовления лекарственного средства основана на принципах механохимии для обеспечения супрамолекулярного состояния. Способ апробирован для изготовления супрамолекулярных систем на основе антибиотиков из группы цефалоспоринов [1. Душкин А.В. // Фундаментальные исследования. 2012. №4 (часть 1). С. 47-52]. Механохимическая технология с использованием диоксида кремния рассматривается как перспективный технологический подход, позволяющий увеличить антибактериальную активность и снизить токсический эффект, поскольку бактерицидный эффект достигается за счет многократного увеличения площади адсорбционного взаимодействия, занимаемой наночастицами кремния, нагруженными антибиотиком.

Известен способ изготовления препарата диеномаст, в состав которого входит гентамицин, диоксидин и масляная основа, обеспечивающая пролонгирующий эффект за счет постепенного всасывания антибиотика [2. Инструкция по применению ДиеномастаАФ для лечения мастита у коров, регистрационный номер ПВР-2-0.2/01043, ЗАО НПП Агрофарм].

Известен способ изготовления препарата гентам на основе гентамицина и амоксициклина, выпускаемый в форме суспензии [3. Инструкция по применению препарата ГЕНТАМ, регистрационный номер ПВР-3-2.1/02697, ООО НПО «АПИ-САН»].

Известен способ изготовления препарата гентоксан, представляющего собой комплекс гентамицина сульфата, производных цинка и триптофана на основе координационных связей в составе кремнийорганического соединения [4. Инструкция по медицинскому применению лекарственного средства ГентаСЕПТ, регистрационный номер UA/1279/01/01, ПАО НПЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод»].

Перечисленные выше технические решения направлены на создание пролонгированного лекарственного средства, предназначенного в основном для наружного применения. Технологические нововведения на основе указанных решений в принципе не предназначены для производства инъекционных форм антибиотиков. В частности, комплексообразование во всех перечисленных формах гентамицинсодержащих препаратов реализуется за счет слабых нековалентных взаимодействий.

Заслуживают особого внимания результаты прикладных исследований, нацеленных на создание комплексов антибиотиков на основе синтетических (со)полимеров.

Опубликован способ модификации гентамицина и канамицина путем ковалентного присоединения их к сополимеру N-(2-гидроксипропил) метакриламида с N-метакроильным производным олигопептидов с помощью биорасщепляющего спейсера, имеющего структуру - Гли-Лей-Гли. При этом полученные производные обладают высоким уровнем антимикробной активности in vitro [5. Назарова О.В. // Прикладная химия. 1993. №3. С. 193-197]. Однако, нет данных о токсичности и биосовместимости полимера-носителя. Собственно способ модификации трудоемок и требует дорогостоящих реагентов, в частности аминокислот и пептидов. Способ может быть реализован только в лабораторном масштабе.

Опубликован способ ковалентного присоединения гентамицина с помощью азометиновой связи к диальдегиддекстрану [6. Хомяков К.П. и соавт. // Известия вузов. Химия и химическая технология. 1979. №10. С. 1267-1271]. Производное сохраняло высокий уровень антибиотической активности, хотя в состав конъюгата гентамицин-носитель вошло не более 34,8 масс % антибиотика. Также не приводятся данные о токсичности синтезированного комплекса и токсичности полимера-носителя, содержащего высокую концентрацию альдегидных групп.

Наиболее перспективными искусственными носителями являются сополимеры N-винил-2-пирролидона (ВП), благодаря их амфифильности и способности к комплексообразованию в качестве носителей и пролонгаторов лекарственных средств [7. Панарин Е.Ф., Лавров Н.А., Соловский М.В., Шальнова Л.И. Полимеры-носители биологически активных веществ. СПб: Профессия. 2014. 304 с].

Известны способы нековалентного и ковалентного связывания лекарственных средств с гидрофильными сополимерами ВП [8. Соловский М.В., Никольская Н.В. // Химико-фармацевтический журнал. 2000. Т. 34. №11. С. 21-24].

При инкубировании гентамицина с сополимерами ВП и кротоновой кислоты (или n-кротонил-аминофенилуксусной кислоты) нековалентное связывание достигается за счет ионного взаимодействия карбоксильных групп в составе полимерных цепей с положительно заряженными аминогруппами антибиотика [9. Соловский М.В., Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М., Киселев О.И., Панарин Е.Ф., Гаврилова И.И., Шульцева Е.Л. Патент РФ №2335510. БИ №28. 2008]. По-видимому, наивысший уровень связывания гентамицина с сополимерами ВП достигается также за счет формирования водородных связей, о чем свидетельствуют результаты равновесного диализа сополимернопроизводных форм гентамицина в воде и в физиологическом растворе.

Недостатком известного метода является стадия перевода гентамицин-сульфата в гентамицин-основание. Из-за процесса диссоциации комплекса гентамицин-сополимер ВП на исходные компоненты реакционную среду подвергают лиофильной сушке.

Описан способ связывания гентамицина с сополимерами N-винилпирролидона и кротоновой кислоты или n-кротоноиламино-феноксиуксусной кислоты [10. Соловский М.В. // Антибиотики и химиотерапия. 2000. №6. с. 10-12]. Конечные продукты сохраняют высокий уровень антимикробной активности. Их токсичность по величине LD₅₀ снижалась по сравнению с таковой у нативной формы гентамицина [10].

Известны исследовательские подходы по созданию комплексов гентамицина с полимерными сульфосодержащими анионами. На основе сополимеров акриламида с 2-акриламид-2-метилсульфоновой кислотой и N-2-гидроксипропилметакриламида с акриловой кислотой и декстрансульфатом были получены комплексы с гентамицином. Гентамицин в составе полианионов сохраняет высокую антибактериальную активность, в т.ч. конъюгат проявляет вироцидный эффект.

Известен способ получения модифицированных водорастворимых сополимеров [11. Панарин Е.Ф. и соавт. // авт. свид. СССР №431185. БИ №28]. В соответствии с данным способом получено азометиновое производное стрептомицина и сополимера N-винилпирролидона с виниламидом или с гидразидом акриловой кислоты. Установлено, что синтезированные комплексы обладают высоким уровнем антимикробной активности. Однако данные о токсичности конечных продуктов не приводятся. Полагают, что наличие аминогрупп в составе сополимерных носителей будет содействовать увеличению токсического эффекта синтезированного комплекса.

Известны способы химической модификации антибиотиков за счет изменения химической структуры действующего начала.

Из тейкопланина получены антибиотики MDL 62708 и MDL 62766 за счет амидирования концевой карбоксильной группировки диметиламинопропиламином. Установлено, что производное тейкопланина способно преодолевать природную резистентность грамотрицательных бактерий за счет увеличения проницаемости наружных липополисахаридных слоев клеточной стенки [12. Смирнова И.Г. и соавт. // Вестник Московского университета. Т. 41 (Серия 2). 2000].

Известны методы химической модификации антибиотиков пептидной группы. При сохранении циклической структуры действующего начала объектами модификации могут быть сложноэфирные связи, α-аминогруппы, гидрофобное ядро и аминокислотные остатки. За счет сукцинилирования ристомицина А удалось снизить нежелательные действия антибиотика [12].

Известен способ изготовления изепамицина - производного гентамицина В - химической модификацией природного антибиотика за счет ацилирования аминогруппы, находящейся в первом положении остатка дезоксистрептомицина. Изепамицин оказался более устойчив к действию аминогликозидмодифицирующих ферментов [13. Ч.Х. Танн и др. Способ получения изепамицина и промежуточные соединения // авт. свид. №2120444].

К обобщенным недостаткам известных методов относится или невозможность на их основе изготовить инъекционную форму антибиотика или необходимость дополнительного синтеза сополимерного носителя с надлежащими сорбционными свойствами, или нестабильность изготовленного комплекса на основе слабых физических связей, или химическая модификация антибиотика, не позволяющая обсуждать пролонгирующие свойства нового продукта, т.к. химическая модификация достигается за счет связывания действующего начала антибиотика с низкомолекулярными носителями (амидирование, сукцинилирование, карбоксилирование и т.д.).

Наиболее близким техническим решением является способ нековалентной модификации гентамицина сополимерами N-винил-2-пирролидона [10], которые как носители обладают необходимыми физико-химическими и физиологическими свойствами. За счет карбоксилсодержащих сополимеров N-винилпирролидона с кротоновой кислотой удалось создать комплекс с гентамицином на основе нековалентного связывания и формирования ионной сшивки, включая водородные связи. Вместе с тем нековалентное комплексообразование для технологически ориентированных решений не позволяет в объективных количественных критериях оценивать показатели качества перспективной субстанции гентамицина в составе сополимерного носителя на основе поливинилпирролидона и кротоновой кислоты. Опубликованное научно-техническое решение требует дополнительных стадий, касающихся перевода гентамицина сульфата в основание гентамицина и модификации комплекса гентамицина и сополимера из-за его диссоциации на исходные компоненты.

Задача изобретения состоит в создании комплексов с различными уровнями стабильности на основе гентамицина и сополимера винилпирролидона за счет формирования азометиновых или ковалентных связей между антибиотиком и сополимерным носителем с молекулярной массой 33 кДа.

Поставленная задача решается за счет использования сополимера винилпирролидона с диацеталем акролеина (коммерческое название Совиаль), имеющего средневзвешенную молекулярную массу в пределах 30 кДа, в составе которого акролеиновое звено занимает около 14 или 16% [14. Панарин Е.Ф., Гаврилова И.И. // авт. свид. №560425. БИ №47; 15. Аникина Т.Б., Панарин Е.Ф. // авт. свид. №522198. БИ №27]. Индукцию альдегидных групп в составе совиаля осуществляли кислотным гидролизом в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты в течение двух часов на кипящей водяной бане. Взаимодействие активированного кислотным гидролизом совиаля и гентамицина осуществляли за счет формирования азометиновых связей и перевода их в прочные ковалентные -CH-N- с помощью боргидрида натрия в условиях депротонирования реакционно-способных аминогрупп антибиотика.

Изложенный подход апробирован с использованием серийно выпускаемых инъекционных форм гентамицина сульфата и образцов совиаля.

Из анализа современного уровня научно-технических решений следует, что в реакциях белок-белок или белок-полимер достаточно часто используется принцип формирования азометиновых связей и последующий их перевод в прочные ковалентные. Для синтеза таких полимерных структур выбираются соразмерные по конформации и массе макромолекулы, а их соотношение подчиняется требованиям эквимолярности с учетом сохранения целевой функциональной активности в составе сформировавшегося производного.

Техническое решение изобретения взаимовложено в действующие регламенты на производство гентамицина. Дополнения и изменения, предусмотренные техническим решением, касаются конечных стадий производства гентамицина и не требуют существенных затрат.

Пример реализации предлагаемого способа

Стадия 1. Кислотный гидролиз акролеинового звена совиаля. Готовят раствор совиаля в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты. Для этого в лабораторном варианте в стеклянную пробирку объемом 25 мл вносят 8 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты и добавляют 400 мг порошка совиаля. После растворения навески раствор совиаля в соляной кислоте выдерживают в течение 2 часов на кипящей водяной бане.

Стадия 2. Формирование инкубационной среды. Раствор совиаля в соляной кислоте охлаждают до комнатной температуры (18±4)°С и добавляют 2,2 мл 4% раствора гентамицина, серийное производство которого в форме инъекционного лекарственного средства осуществляет Борисовский завод медицинских препаратов (Беларусь). Полученный раствор, содержащий совиаль и гентамицин, при кислом значении рН перемешивают на магнитной мешалке в течение 10-15 минут.

Расчет необходимого количества антибиотика проводили на основе следующих допущений:

а) при активации все акролеиновые звенья образуют альдегидную группу (следовательно, количество акролеиновых звеньев равно количеству альдегидных групп в молекуле совиаля после активации);

б) количество реакционноспособных аминогрупп на молекуле гентамицина может быть от 1 до 3.

Мольные соотношения гентамицин/совиаль в инкубационной среде могут быть представлены из расчета:

a) мольных соотношений соответственно n молей гентамицина на m молей совиаля;

b) мольных соотношений n молей гентамицина на 1 моль альдегидных групп в составе 1 моля активированного совиаля.

Взаимодействие аминогрупп гентамицина и альдегидных групп совиаля описывается схемой:

-NH₂+O=СН-→-N=CH-+Н₂O

Коммерческий препарат сополимера винилпирролидона с диацеталем акролеина (совиаль) характеризуется средневзвешенной молекулярной массой и величиной мольного процента акролеиновых звеньев. Совиаль, используемый в работе, имеет молекулярную массу 33 кДа и мольный процент акролеиновых звеньев 16%. Препарат гентамицина сульфата представляет собой 4% раствор для внутримышечного введения со средней молекулярной массой 477 Да.

Мольный процент представляет собой величину, которая выражает долю данной функциональной группы (ф.гр.) в сополимере (Σ гр), выраженную в процентах:

моль %=(N ф.гр/N_Σгр)*100%,

где моль % - величина мольного процента, N_ф.гр - количество мономеров данной группы в сополимере, N_Σгр - общее количество всех звеньев в сополимере.

Совиаль представляет собой сополимер винилпирролидона с диацеталем акролеина. Молекулярная масса диацеталя акролеина (далее акролеиновое звено) в молекуле совиаля равна 130 Да, а винилпирролидона - 111 Да. Мольный процент акролеинового звена равен 16%, значит, мольный процент винилпирролидона равен 84%. Исходя из этого, можно разбить молекулу совиаля на элементарное звено, в котором на одну молекулу акролеина приходится 5,25 (0,84/0,16) звеньев винилпирролидона. Молекулярный вес такого звена равен 712, 75 Да. Зная, что молекулярная масса совиаля равна 33000 Да, определяем количество таких элементарных звеньев в одной молекуле совиаля: 33000 Да/ 712,75 Да=46. Следовательно, одна молекула совиаля содержит 46 акролеиновых звеньев, т.к. одно элементарное звено содержит одно акролеиновое.

Приведем расчет количеств совиаля и гентамицина для взаимодействия с учетом того, что 1 молекула гентамицина будет связываться с каждой альдегидной группой совиаля. Из приведенного выше расчета очевидно, что мольное соотношение n(гент)/n(сов)=46. При этом массовые соотношения получим:

Гентамицин содержит 3 аминогруппы, однако одновременное взаимодействие двух групп, а тем более 3, с альдегидными группами совиаля представляется маловероятным из-за стерических препятствий.

Стадия 3. Формирование азометиновых связей между гентамицином и совиалем. С помощью 1 моль/л раствора натрия гидроксида рН инкубационной среды доводят до 11,0±0,02. Указанное значение рН с помощью 0,1 моль/л гидроксида натрия поддерживают в течение более 2 часов. Окончание реакции контролируют по отсутствию снижения рН от исходного (11,0±0,02) в течение 30 минут дополнительного инкубирования. Затем с помощью 1 моль/л раствора соляной кислоты рН инкубационной среды снижают до 7,0±0,1. В состав комплекса входят 88 мг гентамицина на 400 мг совиаля. Формирование комплекса контролируют методом инфракрасной спектроскопии (фиг. 1-2, табл. 1-2, фиг. 3, табл. 3). На фиг. 1 представлен эталонный спектр гентамицина, на фиг. 2 - эталонный спектр активированного совиаля, фиг.3 - спектр модифицированного гентамицина до восстановления.

Из расшифровки инфракрасного спектра модифицированного гентамицина до восстановления (табл. 3) видно, что в области 1680-1630 см^-1 он имеет характерные для азометиновых связей полосы поглощения со средней интенсивностью, которые отсутствуют в спектре активированного совиаля и гентамицина (фиг. 1, 2, табл. 1, 2). Продукт нестабилен при хранении его в 0,15 моль/л растворе хлорида натрия при температуре (5±3)°С. В течение 1 месяца (80±10)% конъюгата распадается на свободные исходные компоненты - гентамицин и совиаль (табл. 4).

Стадия 4. Перевод азометиновых связей в прочные ковалентные. Выполняется в соответствии с алгоритмом предыдущей стадии вплоть до операции доведения рН до (7,0±0,1). При рН (11,0±0,02) вносят 21 мг натрия боргидрида и выдерживают инкубационную среду с боргидридом натрия в течение 2-12 часов при комнатной температуре.

Расчет необходимого количества боргидрида натрия проводили на основе эквимолярных соотношений:

и следующих допущений:

а) при активации все акролеиновые звенья образуют альдегидную группу, количество альдегидных групп равно 46;

б) количество азометиновых связей в конъюгате равно количеству активированных альдегидных групп.

m(NaBH₄)=M(NaBH₄)*n(NaBH₄)=M(NaBH₄)*n(coв)*46= =-46M(NaBH₄)/M(coв)*m(coв)

Масса совиаля, используемая в эксперименте - 400 мг (0,4 г). Тогда необходимая для восстановления масса боргидрида натрия:

m(NaBH₄)=46*38/33000*0,4=21,2 мг

Формирование комплекса контролируют методом инфракрасной спектроскопии (фиг. 1-2, табл. 1-2, фиг. 4, табл. 5). Спектр модифицированного гентамицина после восстановления представлен на фиг. 4. В состав комплекса входит 88 мг гентамицина и 400 мг совиаля.

Из расшифровки инфракрасного спектра модифицированного гентамицина после восстановления (табл. 5) видно, что в области 3300-3500 см^-1 он имеет характерные для вторичных аминов полосы пропускания с большой интенсивностью, которые отсутствуют в спектре активированного совиаля и гентамицина (фиг. 1, 2, табл. 1, 2). Продукт стабилен при хранении его в 0,15 моль/л растворе хлорида натрия и температуре (5±3)°С. В течение 8 месяцев (10±5)% комплекса распадается на исходные реагенты реакции - гентамицин и совиаль (табл. 6).

Стадия 5. Удаление технологических примесей из состава инкубационной среды. Удаляли технологические примеси, включая несвязавшийся с совиалем гентамицин, из состава комплекса, сформированного за счет азометиновых связей (стадия 3) или из состава комплекса, образованного за счет перевода азометиновых связей в прочные ковалентные (стадия 4). Процедуру изменения состава инкубационной среды на физиологически приемлемый 0,15 моль/л натрия хлорид осуществляют либо колоночной хроматографией в режиме гель-фильтрации с использованием сефадекса G-25, либо ультрадиафильтрацией в тангенциальном потоке с помощью установки типа Vivaflow (ООО «Сартогосм»). Хроматографию проводят на колонке (S_осн - 5 см², h=25 см), упакованной гелем Сефадекса G-25 до объема 125 мл. Объем образца составлял 25% от объема колонки. В хроматографических фракциях контролируют наличие совиаля йодным реактивом и наличие гентамицина - методом ИФА. Собирают пробирочные подфракции, содержащие совиаль, обобщенная фракция совиаля выходит первым пиком в объеме 16±2% от общего объема геля. В пробирочных подфракциях, соответствующих общему объему геля, измеряют концентрацию гентамицина с помощью ИФА. В конечных продуктах - комплексах, образованных за счет азометиновых или прочных ковалентных связей, определяют концентрацию совиаля и гентамицина вышеуказанными методами. Концентрацию гентамицина уточняют с помощью баланса с учетом количества гентамицина, внесенного в инкубационную среду, и количества несвязавшегося гентамицина, объем выхода которого соответствует общему объему геля. Для этих целей возможно также использовать установку для ультрадиафильтрации с пределом эксклюзии мембранных фильтров 10 кДа. Контроль процесса удаления технологических примесей осуществляют по содержанию гентамицина в сливных водах и возвратной фракции. Процесс ультрадиафильтрации, т.е. перевода раствора инкубационной среды в физиологически приемлемый 0,15 моль/л раствор натрия хлорида останавливают, когда концентрация гентамицина в сливных водах снижается до 0,5 нг/мл. Концентрацию гентамицина и совиаля определяют в возвратной фракции в соответствии с вышеуказанными методами. При расчете % гентамицина в составе комплексов учитывают количество несвязавшегося антибиотика по результату определения его концентрации в сливных водах. Доля связанного гентамицина в % в зависимости от мольного соотношения реагирующих компонентов представлена в таблице 7.

Стадия 6. Определение в кровеносном русле комплекса, образованного за счет перевода азометиновых связей в прочные ковалентные (стадия 4), и свободного гентамицина сульфата проводили на основе их противомикробной активности методом диффузии в агар [16. Государственная фармакопея Российской Федерации: в 5-и частях / Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Изд. 12-е. Москва. 2008. Ч. 1. 704 с] на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов. В чашки, установленные на горизонтальном столике, наливали 20 мл расплавленной питательной среды определенного состава, зараженной тест-культурой Е. Coli (количество клеток около 10⁶, ОП₅₅₀=0,7-1,4). На застывшей поверхности агара по трафарету, подложенному под дно чашки Петри, вырезали лунки диаметром 8 мм в толще агара стерильным сверлом. В лунки вносили растворы исследуемых образцов в объеме 0,1 мл. В качестве исследуемых образцов использовали сыворотку, полученную путем центрифугирования при 3000 об/мин крови кролика, взятой через 0, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72 часа после введения либо комплекса, образованного за счет перевода азометиновых связей в прочные ковалентные (стадия 4), либо гентамицина сульфата.

После инкубации в термостате при 36-38°С в течение 16-18 ч измеряли диаметры зон задержки роста тест-микроба, отчетливо видных вокруг лунок. Результаты представлены в таблице 8.

Анализ полученных результатов показал, что модифицированный гентамицином совиаль в течение трех дней идентифицируют в кровеносном русле подопытных кроликов на основе противомикробной активности гентамицина (табл. 8).

Источники информации

1. Душкин А.В. // Фундаментальные исследования. 2012. №4 (часть 1). С. 47-52

2. Инструкция по применению ДиеномастаАФ для лечения мастита у коров. Регистрационный номер ПВР-2-0.2/01043, ЗАО НПП Агрофарм.

3. Инструкция по применению препарата ГЕНТАМ. Регистрационный номер ПВР-3-2.1/02697, ООО НПО «АПИ-САН».

4. Инструкция по медицинскому применению лекарственного средства ГентаСЕПТ. Регистрационный номер UA/1279/01/01, ПАО НПЦ «Борщаговский химико-фармацевтический завод».

5. Назарова О.В. // Прикладная химия. 1993. №3. С. 193-197.

6. Хомяков К.П. и соавт. // Известия вузов. Химия и химическая технология. 1979. №10. С. 1267-1271.

7. Панарин Е.Ф., Лавров Н.А., Соловский М.В., Шальнова Л.И. Полимеры-носители биологически активных веществ. СПб.: Профессия. 2014. 304 с.

8. Соловский М.В., Никольская Н.В. // Химико-фармацевтический журнал. 2000. Т. 34. №11. С. 21-24.

9. Соловский М.В., Еропкин М.Ю., Еропкина Е.М., Киселев О.И., Панарин Е.Ф., Гаврилова И.И., Шульцева Е.Л. Патент РФ №2335510. БИ №28. 2008

10. Соловский М. В. //Антибиотики и химиотерапия. 2000. №6. с. 10-12.

11. Панарин Е.Ф. и соавт. // авт. свид. СССР №431185. БИ №28.

12. Смирнова И.Г. и соавт. // Вестник Московского университета. Т. 41 (Серия 2). 2000.

13. Танн Ч.Х. и др. Способ получения изепамицина и промежуточные соединения // авт. свид. №2120444. 1998

14. Панарин Е.Ф., Гаврилова И.И. // авт. свид. №560425. БИ №47.

15. Аникина Т.Б., Панарин Е.Ф. // авт. свид. №522198. БИ №27.

16. Государственная фармакопея Российской Федерации: в 5-и частях / Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Изд. 12-е. Москва. 2008. Ч. 1. 704 с.