Результат интеллектуальной деятельности: Средство, обладающее противогрибковым действием в отношении грибов рода Candida

Изобретение относится к медицине, в частности к лечебным средствам из растительного сырья, и может быть применено для доклинических и клинических исследований по лечению грибковый заболеваний, в том числе развивающихся на фоне иммунодефицитных состояний.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения около трети населения земного шара имеют грибковые заболевания различной локализации. Такой масштаб поражения обусловлен высокой распространенностью устойчивых к современным антимикотикам штаммов этих микроорганизмов [http://www.lvrach.ru/2012/08/15435509]. Нельзя оставлять без внимания проблему пациентов с иммунносупрессией, у которых микозы являются побочным эффектом лечения основного заболевания или результатом нарушения работы иммунокомпетентных клеток организма. Кроме того, применение препаратов из группы антимикотиков практически всегда ограничивается их выраженной гепато- и нефротоксичностью.

В связи с тенденцией к росту грибковых заболеваний (как поверхностных, так и тяжелых висцеральных микозов, ассоциированных с ВИЧ-инфекцией, онкогематологическими заболеваниями), развитием устойчивости возбудителей к имеющимся лекарственным средствам (ЛС), выявлением видов грибов, ранее считавшихся непатогенными (в настоящее время потенциальными возбудителями микозов считаются около 400 видов грибов), возросла потребность в эффективных противогрибковых средствах. [http://www.rlsnet.ru/fg_index_id_250.htm]. Одним из источников нетоксичных лекарственных препаратов с антимикотической ативностью, в том числе и в отношении устойчивых к известным препаратам микроорганизмов, могут стать

экстракты из лекарственного растительного сырья (ЛРС), содержащие флавоноиды.

Известен тербинафина гидрохлорид, обладающий противогрибковым действием, содержащий, консервант, эмульгатор, липофильную составляющую и растворитель, в качестве основы редкосшитую полиакриловую кислоту, в качестве консерванта нипагин, в качестве эмульгатора твин-80, в качестве липофильной составляющей масло вазелиновое, а также дополнительно содержит гидроксид натрия и воду (Патент №2005123866, А61К 31/00, опубл. 10.02.2007. Дулькис М.Д., Каплун Е.Е.). Недостатками средства являются использование большого количества химических реагентов при экстракции, в том числе едкой щелочи - гидроксида натрия и длительная процедура его приготовления, что потенциально делает данный препарат более токсичным.

Известен экстракт из лихниса халцедонского (Lychnis chalcedonica L., сем. Гвоздичные), обладающий противогрибковой активностью. Способ экстракции заключается в экстрагировании комплекса биологически активных соединений из надземной части растения дистиллированной водой в течение 10-14 часов при температуре 40°C, последующем упаривании и сушке - способ получения средства, обладающего противогрибковым действием (Патент №1755440, А61К 35/78, опубл. 09.01.1995). Недостатками средства являются низкая противогрибковая активность и длительность экстракции 10-14 часов, что осложняет технологический процесс.

Известен способ получения средства с фунгицидной активностью (Патент RU 2435602 Зибарева Л.Н. опубл. 10.12.2011), заключающийся в экстракции водой надземной части лихниса халцедонского (Lychnis chalcedonica L.) и сушки, но экстракцию проводят в микроволновой печи (СВЧ-нагрев) семикратно в течение 1.5 ч и экстракт упаривают. Недостатком этого способа является использование СВЧ-излучения, при котором сложно контролировать температуру нагрева и, как следствие, риск распада активных веществ экстракта или переход их в токсичные и возможное разрушение флавоноидов.

Нами впервые получено противогрибковое средство из кроющих листьев початков антоциановой диплоидной формы кукурузы обыкновенной (Zea mays L.).

Антоциановая форма кукурузы Zea mays L., обладающая доминантными генами маркера «коричневый Саратовский» была создана на кафедре генетики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского и предложена в качестве источника для получения принципиально нового безопасного красного красителя для пищевой и фармацевтической промышленности. К преимуществам данного вида растительного сырья относятся отсутствие токсичности, канцерогенной и мутагенной активности, (Купчак Т.В., Николаева Л.О., Шимолина JI.JI. Выделение и идентификация антоцианов из гибридной кукурузы // Фармацевтический журнал. 1995. №6. С 62-64; Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Райкова С.В., Разуваева К.А., Щербаченко А.С., Альмяшев Р.Ш. Анализ химического состава и биологических свойств спиртового экстракта растительного сырья гибридной формы кукурузы Zea mays L. // Материалы IV Всерос. с междунар. участием научно-метод. конфер «Фармобразование 2010». Воронеж. 2010 а. С. 306-311; Полуконова Н.В., Федорова И.П., Гопиенко А.В., Тырнов B.C. Токсикологическая, канцерогенная и мутагенная безопасность антоциановой формы кукурузы Zea mays L. как источника красного красителя // Бюллетень ботанического сада СГУ. Вып. 9. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2010 б. С. 78-83), а также удобством выращивания и заготовки с применением автоматизированных технических средств. По данным Рейвна П.Х. с соавторами (Рейвн П.Х., Эверт Р.Ф., Айкхорн С.Е. Современная ботаника. М., Мир. 1990. Т. 2. 258 с.), растение может широко культивироваться на территории России с выходом сырья до 10 т/га.

Кроме того, в сырье содержится целый комплекс биологически активных веществ (Купчак Т.В., Николаева Л.О., Шимолина JI.JI. Выделение и идентификация антоцианов из гибридной кукурузы // Фармацевтический журнал. 1995. №6. С. 62-64; Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Райкова С.В., Разуваева К.А., Щербаченко А.С., Альмяшев Р.Ш. Анализ химического состава и биологических свойств спиртового экстракта растительного сырья гибридной формы кукурузы Zea mays L. // Материалы IV Всерос. с междунар. участием научно-метод. конфер «Фармобразование 2010». Воронеж. 2010 а. С. 306-311): фенольных соединений (не менее 28), 11 фенольных кислот и 13 флавоноидов, из них не менее четырех антоцианов. Флавоноиды представлены производными флавона и флавонола. Антоцианы, представлены производными флавия со свободными ортодигидрокси группировками в кольце В (хризантемин, идеин). Установлено отсутствие антрагликозидов, дубильных веществ, кумаринов, кардиотонических гликозоидов и алкалоидов.

Нами впервые предложено средство, обладающие противогрибковой активностью в виде экстракта кукурузы полученного ранее разработанным нами способом (RU 2482863, 15.02.2012), позволяющим получать нетоксичные экстрактивные вещества из ядовитых растений. Для полученного экстракта из кроющих листьев початков нами уже описаны положительные эффекты на организм животных с перевитым раком печени и, в то же время, негативное воздействие на опухолевые клетки, проявляющиеся как в виде цитотоксического, так и цитостатического эффектов (Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N., Bucharskaya A.B., Durnova N.A. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer // Russian Open Medical Journal 2012. P. 1-4.; Наволокин H.A., Мудрак Д.А., Матвеева O.B., Тычина С.А., Бучарская А.Б., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. Влияние растительных экстрактов, содержащих флавоноиды, на лейкоцитарную формулу и красный костный мозг лабораторных крыс с перевитой саркомой 45 // Успехи современного естествознания. 2015. №4. С. 134-14).

Исследования противогрибковой активности листьев кукурузы антоциановой (Zea mays) в доступной нами литературе не обнаружены.

Технической задачей настоящего изобретения служит расширение арсенала средств из растительного сырья, обладающих фунгицидной активностью, экономически более доступных и нетоксичных.

Преимуществом предлагаемого экстракта служит отсутствие токсичности и доступность сырья, из которого получают средство, а также наличие антимутагенной, антиоксидантной активности и общего положительного влияния на организм (Курчатова М.Н., Дурнова Н.А., Полуконова Н.В. Влияние экстрактов, содержащих биофлавоноиды, на индукцию микроядер диоксидином в эритроцитах крови беспородных белых мышей // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2014. №2. С. 58-65; Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Корчаков Н.В. Изменения лейкоцитарной формулы, красного костного мозга и опухоли лабораторных крыс с перевитой саркомой-45 при введении экстрактов аврана лекарственного, бессмертника песчаного, кукурузы антациановой. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2015. Т. 11, №3. С. 328-332).

Нами впервые установлены свойства средства, представляющего собой сухой экстракт кроющих листьев початков кукурузы антоциановой, полученного путем их измельчения, экстракцией спиртом 96%, выпариванием экстракта, добавлением хлороформа, удалением хлороформа, причем экстракцию спиртом проводят на водяной бане до кипения и кипятят в течение 14-15 минут, выпаривают при температуре 55-60°С, выпаренный экстракт разводят сначала дистиллированной водой 40-50°С, затем добавляют хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, далее отделяют водную фракцию и высушивают ее. Полученная биологически активная композиция обладает новым свойством: противогрибковым действием.

Параметры подлинности и качества средства.

Средство, полученное данным способом из кукурузы антоциановой содержит следующие вещества: этиловый эфир гексадекановой кислоты; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; 1-(4-метоксифенил)-метоксипропан; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); этиловый эфир линоленовой кислоты; 9,12-октадекановая кислота; 2-(5-хлор-2-метоксифенил) пиррол, производные прунина и нарингенина, кверцетин.

Стандартизация экстракта проводилась по содержанию кверцетина, концентрация которого составила 57,57 мкг/мл.

Полученный таким образом экстракт представляет собой биологически активную композицию, с новым фармакологическим свойством фунгицидным, ранее не известным как для растения кукуруза антоциановая, так и для описанного выше средства.

Средство представляет собой сухой экстракт, багрово-фиолетового цвета, смешивается с водой и спиртом этиловым в любых соотношениях.

Параметры подлинности и качества средства.

Полученный нами упаренный экстракт листьев кукурузы антоциановой нетоксичен, что обусловлено химическим составом и подтверждено ранее в экспериментах на крысах (N.A. Navolokin, N.V. Polukonova, G.N. Maslyakova, A.B. Bucharskaya, N.A. Durnova / Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with transplanted liver cancer // Russian Open Medical Journal 2012; 1: 0203).

Определение противогрибкового действия экстракта кукурузы антациановой.

Антифунгицидную активность водного раствора экстракта кукурузы антоциановой (Zea mays) определяли в отношении стандартного штамма: Candida albicans АТСС 13108 и 4-х клинических штаммов С. albicans взятых из музея живых культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России.

Из двухдневных культур исследуемых штаммов готовили взвеси, суспензируя в стерильном физиологическом растворе, по стандарту мутности McFarland 10 ME, доводя их до концентрации 2⋅106 КОЕ/мл путем разведений. Готовили ряд серийных разведений экстрактов в среде Сабуро от 500 мг/мл до 125 мг/мл. (Пластун В.О. Перспективы использования извлечений из очитка пурпурного (Sedum telephium L.) при разработке средств с антимикробной активностью / В.О. Пластун, Н.А. Дурнова, С.В. Райкова, Е.Э. Комарова // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. 2015. №13. С. 70-75).

В каждую пробирку с экстрактом вносили по 0,1 мл взвеси кандид. В контрольные пробирки помещалась взвесь микроорганизмов с питательной средой без экстракта. Смесь инкубировали в термостате в течение 48 ч.

Перед инкубированием производили мерный высев из контрольных пробирок на плотную питательную среду Сабуро. Чашки помещали в термостат на 48 ч. Из опытных пробирок производили высев на плотные питательные среды. Через 48 ч. производили подсчет количества выросших колоний в сравнении с контролем и делали вывод о противогрибковом действии водного раствора экстракта (Пластун В.О. Противомикробное действие экстрактов очитков пурпурного (Sedum telephium L.) и большого (S. maximum (L.) Hoffm.) / B.O. Пластун, Н.А. Дурнова, С.В. Райкова // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. 2014. №12. С. 70-75).

Результаты исследования.

Было получено, что экстракты в концентрации 250 и 500 мг/мл обладали выраженной фунгицидной активностью в отношении взятых в эксперимент штаммов грибов - роста на среде Сабуро отмечено не было. Концентрация экстракта 125 мг/мл не оказывала противогрибкого действия на экспериментальные штаммы.

Таким образом, минимально подавляющая концентрация (МПК) водного раствора экстракта кукурузы антоциановой (Zea mays) в отношении взятых в эксперимент штаммов составила 250 мг/мл.

Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии противогрибковой активности водного раствора экстракта кукурузы антоциановой (Zea mays). Мы считаем, перспективным изучение спектра противогрибковой активности полученного экстракта в отношении других видов грибов, имеющих медицинское значение. Полученные в дальнейшем данные о свойствах исследуемого экстракта позволят рекомендовать его в качестве потенциального противогрибкового препарата.

Пример 1.

Листья кукурузы измельчали и просеивали через сито с размером ячеек не более 3 мм. Взвесили 10 г измельченного сырья, поместили его в колбу объемом 500 мл, добавили 100 мл этилового спирта 96%, на водяной бане довели до кипения и кипятили в течение 14 мин. Экстракт из колбы процедили в стеклянную емкость через 4 слоя широкого бинта, остаток растительного материала тщательно отжали, залили еще 100 мл этилового спирта 96%. Довели до кипения и снова профильтровали в ту же стеклянную емкость. Полученный экстракт выпарили досуха в термостате при температуре 55°С. В стеклянную емкость с выпаренным экстрактом добавили 8 мл дистиллированной воды, затем с помощью шприца перенесли полученный раствор в пластиковую центрифужную пробирку объемом 11 мл, добавили 2 мл хлороформа, встряхнули несколько раз до однородности, остудили до комнатной температуры и центрифугировали в течение 15 мин (для удаления неполярных примесей (хлорофилла) и др.) при скорости 1500 оборотов в минуту. Водную фракцию собирали с помощью шприца, поместили в заранее взвешенную чашку Петри, высушили и в таком виде хранили до начала эксперимента. Вес сухого экстракта подсчитали как разницу между весом чашки Петри с сухим экстрактом и весом пустой чашки Петри. Получили 225 мг сухого экстракта кукурузы.

Из двухдневной культуры штамма Candida albicans АТСС 13108 готовили взвесь, суспензируя в стерильном физиологическом растворе, по стандарту мутности McFarland 10 ME, доводя их до концентрации 2⋅10⁶ КОЕ/мл путем разведений. Готовили разведение экстракта в среде Сабуро 500 мг/мл.

В каждую пробирку с экстрактом вносили по 0,1 мл взвеси кандид. В контрольные пробирки помещалась взвесь микроорганизмов с питательной средой без экстракта. Смесь инкубировали в термостате в течение 48 ч.

Перед инкубированием производили мерный высев из контрольной пробирки на плотную питательную среду Сабуро. Чашки помещали в термостат на 48 ч. Из опытной пробирки производили высев на плотные питательные среды. Через 48 ч. производили подсчет количества выросших колоний в сравнении с контролем и делали вывод о противогрибковом действии водного раствора экстракта.

Было получено, что экстракт в концентрации 500 мг/мл обладал фунгицидной активностью в отношении Candida albicans АТСС 13108 грибов рода Candida - роста на среде Сабуро отмечено не было.

Пример 2.

Экстракт, полученный способом описанном в примере 1, исследовали на клиническом штамме кандид.

Из двухдневной культуры клинического штамма грибов рода Candida готовили взвесь, суспензируя в стерильном физиологическом растворе, по стандарту мутности McFarland 10 ME, доводя их до концентрации 2⋅10⁶ КОЕ/мл путем разведений. Приготовили разведение экстракта в среде Сабуро 250 мг/мл. В каждую пробирку с экстрактом вносили по 0,1 мл взвеси кандид. В контрольные пробирки помещалась взвесь микроорганизмов с питательной средой без экстракта. Смесь инкубировали в термостате в течение 48 ч.

Перед инкубированием производили мерный высев из контрольной пробирки на плотную питательную среду Сабуро. Чашки помещали в термостат на 48 ч. Из опытной пробирки производили высев на плотные питательные среды. Через 48 ч. производили подсчет количества выросших колоний в сравнении с контролем и делали вывод о противогрибковом действии водного раствора экстракта.

Было получено, что экстракт в концентрации 250 мг/мл обладал фунгицидной активностью в отношении клинического штама грибов рода Candida - роста на среде Сабуро отмечено не было.

Таким образом, экстракт кукурузы антоциановой обладает новым свойством -, при этом экстракт не токсичен полученный путем экстрагирования 96% этиловым спиртом кроющих листьев початков антоциановой диплоидной кукурузы, при определенных условиях, с очисткой хлороформом от ядовитых веществ с их полным последующим удалением вместе с растворителем с помощью центрифугирования, упариванием водной фракции на водяной бане при температуре не более 60°С,.

Таким образом, экстракт кукурузы обладает противогрибковой активностью. Преимуществами данного средства является отсутствие токсичности при фунгицидным действием на грибы рода Candida, а также эффективность в отношении клинических штаммов. МПК экстракта кукурузы в отношении клинических штаммов с МЛУ составляет 250 мг/мл.