Рекомбинационная кассета, содержащая гены EP153R и EP364R штамма Congo (КК-262) вируса африканской чумы свиней и рекомбинантный штамм ΔСongoCD2v вируса африканской чумы свиней

Изобретение относится к области молекулярной вирусологии и генной инженерии, в частности к штаммам вируса африканской чумы свиней (АЧС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах для изучения роли белка гемагглютинина (CD2v) вируса африканской чумы свиней в репродукции вируса в культурах клеток, в восприимчивых животных, их функций в модуляции иммунного ответа, а также создания прототипных вакцинных препаратов против АЧС.

Начиная с 2007 года, во многих субъектах Российской Федерации отмечается неблагополучная эпизоотологическая обстановка по АЧС. На территорию нашей страны АЧС была занесена в ноябре 2007 г., заболевание диагностировали у кабанов в Шатойском районе Республики Чечня. В последующие годы (2007-2015 гг.) вспышки болезни регистрировали еще в 35 субъектах России.

Африканская чума свиней является сложным заболеванием, для которого нет доступной вакцины. АЧС относится к списку конвенционных трансграничных болезней, оказывающих значительный экономических и социальный ущерб регионам, в которых они обнаруживаются. Возбудитель АЧС - вирус африканской чумы свиней - единственный известный представитель семейства Asfarviridae [6]. Вирус АЧС способен инфицировать всех представителей семейства Suidae вне зависимости от возраста и пола, кроме того, способен размножаться в мягких клещах рода Ornithodoros [5, 6].

Профилактика и контроль АЧС базируется на двух принципах: раннем выявлении (на основе эпидемиологических, клинических и лабораторных исследований) и строгих санитарных мерах. Таким образом, соответствующие диагностические инструменты должны совершенствоваться, чтобы быть применимыми ко всем сценариям развития болезни и иметь решающее значение для осуществления эффективных программ управления эпидемиями [1, 2, 4].

Несмотря на многолетние исследования, до сих пор не разработаны эффективные средства специфической профилактики АЧС. Неоднократные попытки создания «классических» инактивированных и живых аттенуированных вакцин, ДНК-вакцин и субъединичных вакцин на основе рекомбинатных антигенов не увенчались успехом.

В настоящее время известно более 400 штаммов и изолятов вируса АЧС, обнаруженных на территории стран Карибского бассейна, Европы, Африки и Восточной Европы. Данные исследований различных штаммов демонстрируют, что вирус АЧС обладает выраженным плюралитетом по патогенности, иммуногенности, антигенности, способности вызывать гемадсорбцию [3]. По результатам Bastos et al., 2003 получены данные о существовании 22 генотипов вируса АЧС, на основе филогенетического анализа участка гена р72 [5]. Все отмеченные генотипы вируса циркулируют на территории африканского континента и могут быть субтипированы на группы и субтипы с использованием анализа нуклеотидных последовательностей вариабельных областей генома [4]. Генотипирование вируса АЧС позволило проследить географическое распространение и молекулярную эволюцию возбудителя, однако абсолютно не коррелировало с данными о протективных свойствах различных изолятов.

Предположения о существовании нескольких иммунологических типов вируса АЧС появились в 30-х годах прошлого столетия и получили экспериментальное подтверждение на рубеже 50-60 годов. De Tray D. обнаружил антигенные различия африканских изолятов Хинде, Уганда, Тенгани в реакции задержки гемадсорбции [3]. Используя эту реакцию и иммунологическую пробу на животных, Malmquist W. доказал существование антигенной множественности изолятов, выделенных в Африке [6]. Им установлено семь иммунологических и серологических типов с референс-штаммами: Л-57, Л-60, Хинде-2, Родезия, Дакар, 2743, Мозамбик. Однако представители даже одного иммунологического типа сильно отличались между собой по фенотипическим и биологическим свойствам, что позволило предположить участие регуляторных и репродуктивных систем вируса в данном феномене.

Согласно разработанной в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии классификации, в основу которой положены результаты РЗГАд типоспецифическими сыворотками и иммунобиологической пробы на свиньях, имеющиеся в коллекции института изоляты вируса АЧС разделены на 8 серогрупп [1]. Наиболее изученными являются штаммы вируса, отнесенные к I-IV серогруппам. Референс-штаммом I-ой серогруппы определен штамм «Лиссабон 57», II-ой - «Конго 49», III-ей - «Мозамбик 78», IV-ой «Франция 32». Нами были определены генетические маркеры, определяющие принадлежность вируса к определенной серогруппе. На основе данных нуклеотидного секвенирования локусов генома, филогенетического анализа, а также использования рекомбинантных штаммов вируса АЧС (Патент на изобретение №2571858) нами были установлены генетические маркеры серотиповой специфичности - гены EP402R (CD2v) и EP153R (C-type lectin).

В продолжение этой работы была рассмотрена гипотеза об использовании локуса C-type lectin/CD2v в качестве протективного антигена для профилактики АЧС. С целью обоснования этой гипотезы необходимо было создать рекомбинантный вирус, лишенный гена гемагглютинина (CD2v), и установить его биологические свойства.

Целью данного изобретения является получение нового рекомбинантного авирулентного штамма вируса африканской чумы свиней ΔCongoCD2v. Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v должен обладать способностью размножаться на перевиваемой клеточной линии COS-1, а также первичной культуре клеток косного мозга свиньи и лейкоцитов. Полученный штамм должен быть не патогенен для свиней и не вызывать гемадсорбцию эритроцитов на поверхности зараженных клеток в условиях in vitro.

Поставленная цель достигается путем создания рекомбинантного штамма вируса АЧС с удаленным геном EP402R (CD2v) и содержит репортерный ген EGFP. Штамм ΔCongoCD2v получен из аттенуированного штамма КК-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинационная кассета представляет собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP153R и EP364R (плечи рекомбинации), штамма КК-262 вируса АЧС, а также репортерный ген EGFP (Рис. 1). Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее вирусом АЧС штамм КК-262. Для дальнейшего скрининга клонов использовали реакцию бляшкообразования и метод предельных разведений (7 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинантного вируса была подтверждена в ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент генов EP152R и EP364R вируса АЧС, а также в ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, комплиментарных фрагментам гена EP402R (CD2v). Отсутствие нуклеотидных замен в сайте рекомбинации определяли нуклеотидным секвенированием фрагментов генома вируса.

Изобретение характеризуется следующими нуклеотидными последовательностями:

SEQ ID No 1: Нуклеотидная последовательность рекомбинантной кассеты для получения рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v, которая представляет собой плазмиду на основе вектора pUC19, содержащую фрагменты генов EP153R и EP364R штамма КК-262 вируса АЧС, а также репортерный ген EGFP под контролем р72 промотора. pUC19 - последовательность вектора pUC19, Larm (EP153R) - последовательность гена EP153R штамма КК-262 вируса АЧС, p72EGFP - последовательность репортерного гена EGFP и р72 промотора, Rarm (EP364R) - последовательность гена EP364R штамма КК-262 вируса АЧС.

Полученный рекомбинантный авирулентный штамм обозначен как штамм «ΔCongoCD2v» и депонирован в Коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии под №3148.

Молекулярно-генетические свойства.

Проводили генетическую идентификацию полученного рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v вируса африканской чумы свиней и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагмента генома. Использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации. ДНК выделяли из 0,2 мл культуры клеток макрофагов свиней, инфицированной рекомбинантным вирусом с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Германия), согласно инструкции изготовителя. ПЦР проводили с праймерами, комплементарными фрагментам генов EP152R и EP364R и представленными в таблице 1.

* Тm - температура отжига праймеров

** bp - пар оснований

Гемадсорбирующие свойства.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v утратил гемадсорбирующую активность и не взаимодействовал с эритроцитами свиньи после инфицирования культуры клеток макрофагов свиней.

Культуральные свойства.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v вируса АЧС размножается в первичной культуре клеток макрофагов свиней, а также в перевиваемой культуре клеток COS-1. Репродукция вируса в культуре клеток макрофагов свиней сопровождается развитием цитопатического эффекта (ЦПЭ). Отмечается округление клеток и отслоение от субстрата на 2 день после заражения. Инфицированные клетки формируют обособленные кластеры, которые разрушаются по мере репродукции вируса на 3-4 день после заражения. Репродукция вируса в культуре клеток COS-1 не сопровождается выраженным цитолизом. По результатам флюоресцентой микроскопии репортерную флюоресценции от EGFP наблюдают в инфицированных клетках, формирующих небольшие локусы (3-5 клеток). Количество флюоресцирующих (инфицированных) клеток увеличивается по мере культивирования вируса. Накопление вируса как в первичной, так и перевиваемой культуре клеток составляет 6,0-7,0 lg ГАЕ 50/см³.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v хранят при минус 40°С в виде лиофилизированной культуры клеток COS-1, инфицированной рекомбинантным штаммом вируса АЧС. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет.

Пример 1.

Создание рекомбинационной кассеты.

Для получения рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v вируса АЧС была сконструирована рекомбинационная кассета, представляющая собой рекомбинантную плазмиду на основе вектора pUC19, содержащая фрагменты генов EP152R и EP364R штамма КК-262 вируса АЧС и репортерный ген EGFP, кодирующий зеленый флюоресцентный белок, под контролем промотера р72 вируса АЧС. Фрагменты генов EP152R и EP364R штамма КК-262 являлись плечами рекомбинации. Клонирование всех фрагментов в бактериальный вектор проводили последовательно с использованием фермента Т4 ДНК-лигазы (NEB, США).

Пример 2.

Рекомбинантный штамм ΔCongoCD2v получен из аттенуированного штамма КК-262 вируса африканской чумы свиней путем гомологичной рекомбинации. Рекомбинантные клоны вируса были получены при одновременной трансфекции культуры клеток COS-1 рекомбинационной кассетой и инфицировании ее штаммом КК-262 вируса АЧС. В результате гомологичной рекомбинации по плечам рекомбинации (фрагментам генов EP152R и EP364R) полученный рекомбинантный вирус представлял собой делетированный мутант вируса КК-262 (не содержал ген EP402R (CD2v)). Для дальнейшего скрининга клонов использовали реакцию бляшкообразования и метод предельных разведений (7 последовательных пассажей на перевиваемой культуре клеток COS-1) и селекции мутантных вариантов вируса по репортерной флюоресценции за счет введенного в состав вируса гена EGFP. Чистота клональной популяции рекомбинатного вируса была подтверждена в ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими фрагмент гена EP402R штамма КК-262 вируса АЧС, а также в ПЦР в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, комплиментарных фрагментам гена EP402R (CD2v). Отсутствие нуклеотидных изменений в сайте рекомбинации определяли путем нуклеотидного секвенирования.

Пример 3.

Определение гемаглютинирующих характеристик рекомбинантного штамма ΔCongoCD2v.

Установлено, что рекомбинантный вирус ΔCongoCD2v утратил гемадсорбирующую активность и не вызывал адгезию эритроцитов на поверхности инфицированных клеток. На основании этих исследований рекомбинантный штамм вируса АЧС ΔCongoCD2v является негемадсорбирующим.

Источники информации:

1. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней. И.Ф. Вишняков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практической конференции ВНИИВВиМ. - Покров. - 1995. - С. 141-143.

2. Черятников Л.Л. Получение аттенуированных вариантов из различных изолятов вируса АЧС и их сравнительная оценка. / Л.Л. Черятников, Ю.И. Петров, Н.И. Митин // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии 1992. - 4.1. - С. 56.

3. D.Е. De Tray, African swine fever / De Tray D.E., // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. - 1963. - №19. P. 299-333.

4. Enhanced discrimination of African swine fever virus isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes / Gallardo C., Mwaengo D.M., Macharia J.M., Arias M., Taracha E.A., Soler A. // Virus Genes. - 2009. - №38. - P. 85-95.

5. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterization / Bastos ADS, Penrith M.L., Cruciere C., Edrich J.L., Hutchings G., Roger F., Couacy-Hymann E., Thomson G.R. // Arch. Virol. - 2003. - №148. P. 693-706.

6. W. Malmquist, D. Hay, Haemadsorption and cytopathic effect produced by African swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures /Malmquist W., Hay D. // J. Vet. Res. - 1960. - №21. P. 104-108