Способ количественного определения амантадина в плазме крови

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической фармакологии и может быть использовано для количественного определения амантадина в плазме крови для фармакокинетического сопровождения лечения пациентов, страдающих болезнью Паркинсона, получающих амантадин как монотерапию, так и в комбинации с другими противопаркинсоническими препаратами.

Амантадин - противовирусный и, одновременно, антипаркинсонический дофаминэргический препарат, по своей химической природе - трициклический аминоадамантан, производное адамантана-1-аминоадамантана гидрохлорид, или 1-адамантиламина гидрохлорид. Белый или белый со слабым желтоватым оттенком кристаллический порошок горького вкуса. Препарат был первоначально предложен в 1967 году в качестве противовирусного средства, эффективного в отношении вирусов гриппа типа А2. В дальнейшем была обнаружена его эффективность при паркинсонизме. Механизм лечебного действия амантадина при паркинсонизме объясняют тем, что он стимулирует выделение дофамина из нейрональных депо и повышает чувствительность дофаминергических рецепторов к нейромедиатору (дофамину); таким образом, даже при уменьшении образования дофамина в базальных ганглиях создаются условия для нормализации происходящих в них нейрофизиологических процессов. Имеются также данные, свидетельствующие о том, что амантадин тормозит генерацию импульсов в моторных нейронах ЦНС, являясь слабым антагонистом глутаматных NMDA-рецепторов. Амантадин в комбинации с другими препаратами используется для лечения вируса гриппа А, гепатита С, паркинсонизма и рассеянного склероза. В неврологии амантадин преимущественно применяется в фармакотерапии болезни Паркинсона. При всех своих важных положительных свойствах амантадин характеризуется достаточно большим числом побочных эффектов (особенно у пожилых лиц), минимизация которых требует привлечения наиболее чувствительных технологий терапевтического лекарственного мониторинга с оценкой содержания данного лекарственного вещества в крови пациентов. Амантадин в дозе 200 мг/день противодействует экстрапирамидным симптомам как при идиопатической болезни Паркинсона, так и в случае паркинсонических расстройств, обусловленных нейролептиками. Стационарный концентрационный уровень в крови достигается в течение 4-7 дней. Индивидуальные концентрационные значения в крови пациентов могут варьировать в терапевтическом диапазоне 200-900 нг/мл. Существует доказанная взаимосвязь между содержанием амантадина в крови и его влиянием на экстрапирамидную симптоматику. Данный препарат может вступать в лекарственные взаимодействия с другими веществами, как с положительными, так и с негативными клиническими эффектами. Так, например, амантадин усиливает подавление вирусной активности интерфероном, потенцирует антдискинезийный эффект леветирацетама у пациентов с болезнью Паркинсона и может являться причиной интенсивных и рекуррентных парамнестичеких симптомов (типа дежавю) при одновременном применении с фенилпропаноламином при лечении гриппа. Побочные эффекты амантадина, такие как тошнота, головокружение, бессонница встречаются у пациентов довольно часто (5-15%), особенно при длительном приеме (более 6 недель). Побочные эффекты амантадина включают также амфетаминоподобные эффекты, такие, как синдром повышенной нервно-рефлекторной возбудимости, тревожность, кошмарные сны, и изредка - галлюцинации. Концентрация амантадина в крови, превышающая 1600 мкг/мл считается токсичной. Лечение высокими дозами амантадина является причиной серьезных побочных эффектов, таких как инфаркт миокарда, попытки суицида, импотенция, спутанность сознания, дисфония и алопеция. Лекарственные взаимодействия напрямую зависят от сывороточной концентрации амантадина. Управление этими эффектами и тестирование комплаентности пациентов требует применения адекватного метода количественного анализа. Существующие методы анализа, такие как газовая хроматография/масс-спектрометрия, как правило, довольно сложны в исполнении, по причине необходимости применения сложной многостадийной пробоподготовки с последующей дериватизацией амантадина. Это является причиной того, что рутинный анализ амантадина представлен в очень малом числе клинических лабораторий, а также того, что терапевтический лекарственный мониторинг этого препарата недостаточно распространен. Создание метода анализа амантадина на основе жидкостной тандемной хромато-масс-спектрометрии может позволить существенно упростить пробоподготовку, уменьшить продолжительность работы и стоимость анализа одного образца, а также улучшить селективность и специфичность метода.

На сегодняшний день известен метод определения остаточного амантадина и римантадина в яйцах и цыплятах путем диспергирования твердофазной экстракции - сверхвысокой эффективности жидкостной хроматографии(СВЭЖХ)-тандемной масс-спектрометрии (Lin Т, Fan J, Liu X, Chen X, Li Y, Liu H Determination of amantadine and rimantadine residues in egg and chicken samples by dispersive solid phase extraction purification-ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Se Pu, 2015 Nov; 33(11):1169-74). Данный способ разработан только для определения амантадина, в частности его остаточного содержания, в яйцах и цыплятах.

Наиболее близким техническим решением является способ определения амантадина в плазме крови с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии, в котором авторы применяли хроматограф Surveyor MS pump, оснащенный автосамплером и трехквадрупольным детектором TSQ Quantum mass, производства фирмы Thermo Electron (США), условия хроматографирования были следующими: режим элюирования - изократический, подвижная фаза состояла из воды и ацетонитрила, взятых в соотношении 60/40 (об./об.) с добавлением муравьиной кислоты (5 г/л), скорость потока составляла - 0,2 мл/мин с общим временем хроматографирования - 3 минуты; для разделения использовали хроматографическую колонку Phenomenex Luna С8, 100×2.0 мм; с размером частиц 3 мкм. Масс-спектрометрическое определение осуществляли в режиме положительно заряженного электроспрея, в режиме мониторинга выбранных реакций, с MRM переходами: m/z 152.→135.1 при нормализованной энергии соударений 22 эВ для амантадина и m/z 214.1→135.1 при 26 эВ для внутреннего стандарта. В качестве способа пробоподготовки авторами применяется простое разведение образцов сыворотки крови деионизированной водой в соотношении 1:462 (сыворотка: вода) (Arndt Т., Guessregen В., Hohl A., Reis J. Determination of serum amantadine by liquid chromatography -tandem mass spectrometry // Clin. Chim. Acta. 2005; 359:125-131). К недостаткам указанного метода, относится то, что данный способ пробоподготовки сопряжен с сильным уменьшением концентрации целевого соединения в финальном образце, что требует применения дорогостоящего масс-спектрометрического оборудования с особо высокой чувствительностью. Это делает метод недостаточно универсальным и ограничивает сферу его применения трехквадрупольными хромато-масс-спектрометрами и другими приборами со сходными характеристиками по чувствительности. Кроме того, указанный метод, согласно приведенному описанию, относится к категории микроколоночной ультра-высокоэффективной жидкостной хроматографии, что опять же ограничивает выбор хроматографов, пригодных для реализации данного метода, позволяя применять только те хроматографические насосы, которые способны развивать давление, достаточное для того, чтобы работать с ультрамелкозернистым сорбентом (с размером частиц 3 мкм и ниже).

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа определения амантадина в плазме крови с высокой воспроизводимостью и точностью, и наиболее адаптированного для решения задач экспериментальной и клинической фармакокинетики.

Технический результат достигается тем, что проводят количественное определение амантадина в плазме крови путем ее анализа на наличие амантадина высокоселективным методом хромато-масс-спектрометрии, при этом хромато-масс-спектрометрию проводят с использованием матрицы в виде плазмы крови с амантадином и внутреннего стандарта, вещества, близкого по строению молекулы к анализируемому веществу - N-адамантил-гексаметиленимина, разделение продуктов экстракции проводят на хроматографической колонке 4,6×100 мм, заполненной мелкопористым октадецилсилильным силикагелем с размером частиц 5 мкм, при этом в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония - раствор А и смесь ацетонитрила и 10 мМ ацетата аммония в соотношении 90:10 - раствор Б, взятых в процентном соотношении раствора А к раствору Б - 42:58, соответственно, причем разделение продуктов экстракции осуществляют с температурой 30°С и скоростью подачи элюента 0,6 мл/мин, детектирование внутреннего стандарта проводят по дочернему иону с m/z 134.9, образующемуся в результате фрагментации родительского молекулярного иона с m/z 234.0, а детектирование амантадина проводят по дочернему иону с m/z 134.9, образующемуся в результате фрагментации родительского молекулярного иона амантадина с m/z 152.0 при нормализованной энергии соударений 20 eV, а его концентрацию рассчитывают по формуле: С=1198, 5306×AR, где С -концентрация амантадина (мкг/мл), AR - отношение площади хроматографического пика амантадина к площади пика внутреннего стандарта..

Способ осуществляется следующим образом.

Все растворители имели квалификацию «Для хроматографии», реактивы - не ниже «ч.д.а.». Для приготовления растворов стандартных образцов использовали субстанции стандартов амантадина (адамантан-1-амин) - C₁₀H₁₇N с молекулярной массой: 151,249 а.е.м. (производства Sigma-Aldrich, США) и N-адамантил-гексаметиленимина (см. фиг. 1А, Б). На фиг. 1А, Б показаны структурная формула амантадина (см. фиг. 1А) и N-адамантил-гексаметиленимина (см. фиг. 1Б) В качестве биологической матрицы использовали плазму крови.

Для выделения амантадина из плазмы крови и очистки экстракта используют метод жидкостной экстракции. К образцу плазмы крови объемом 500 мкл добавляют 50 мкл внутреннего стандарта (N-адамантил-гексаметиленимина, 50 мкг/мл) и 500 мкл пересыщенного раствора бикарбоната натрия (NaHCO₃, 1,14 моль/л) с целью повышения коэффициента извлечения амантадина. Затем приливают 5 мл органического экстрагента - диэтилового эфира. Образовавшуюся смесь встряхивают в течение 5 минут на вортекс-миксере Heidolph Ultra, а затем центрифугируют на скорости 3500 об/мин для разделения органического и гидрофильного слоя. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и упаривают в центрифужном вакуумном концентраторе Eppendorf Concentrator 5301 при температуре 45°С. Полученный сухой остаток перерастворяют в 500 мкл метанола. Образец переносят в хроматографическую виалу, которую помещают в автосамплер хроматографа для дальнейшего хромато-масс-спектрометрического анализа. Раствор инжектируют в петлю хроматографа в объеме 10 мкл.

В данных условиях коэффициент экстракции для амантадина составляет 88,97±1,25%, для внутреннего стандарта - 90,96±0,93%.

Для высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии используют хроматограф - «Finnigan Surveyor LC Pump Plus», детектор - масс-спектрометрический детектор «LCQ Fleet MS» (квадрупольная ионная ловушка) и аналитическую колонку - обращенно-фазную колонку Hypersil Gold фирмы Thermo Scientific, США (4,6×100 мм; 5 мкм).

Масс-спектрометрическое детектирование амантадина проводят по дочернему иону с m/z 134.9, образующемуся в результате фрагментации родительского молекулярного иона амантадина с m/z 152.0 при нормализованной энергии соударений 20 eV. Масс-спектр второго порядка для амантадина представлен на фиг. 2 А и для N-адамантил-гексаметиленимина на фиг. 2 Б (по вертикали интенсивность (Intensity) по горизонтали масса заряда (m/z).

Внутренний стандарт детектируют по дочернему иону с m/z 134.9, образующемуся в результате распада молекулярного иона внутреннего стандарта с m/z 234.0. Масс-спектрометр работал в режиме регистрации ионов, положительно заряженных электроспреем (ESI), создаваемым напряжением в 5 кВ. Скорость потока газа-небулайзера (азота): 5 л/мин, давление на распылителе - 100 psi. Температура интерфейса капилляра составляла 350°С, температура нагревателя - 300°С. Амплитуда возбуждения на концевых электродах ловушки 0,1 В. В качестве демпфирующего газа в ионной ловушке используют гелий. Данные обрабатывают с помощью компьютерной хроматографической программы Xcalibur 2.1 w/Foundation 1.0.1. (Thermo Scientific, США).

Разделение осуществляют на обращенно-фазной хроматографической колонке Hypersil Gold фирмы Thermo Scientific, США, 5 мкм, 4,6×100 мм, заполненной мелкопористым октадецилсилильным силикагелем с размером частиц 5 мкм. Подвижная фаза состоит из двух растворов: 10 мМ ацетата аммония, (раствор А) и смеси ацетонитрила и 10 мМ ацетата аммония в соотношении 90:10 соответственно (раствор Б). Растворы А и Б взяты в процентном соотношении 58А:42Б. Работа проводилась в изократическом режиме элюирования. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,6 мл/мин. Объем пробы - 10 мкл. Температура разделения 30°С. Продолжительность хроматографирования - 11 минут. Время удерживания аналита - 3,28±0,05 минут. Время удерживания внутреннего стандарта (N-адамантил-гексаметиленимина) - 7,28±0,05 минут.

Демонстрационная хроматограмма образца плазмы крови с концентрацией амантадина 500 нг/мл представлена на фиг. 3, на котором видна хроматограмма экстрагированного образца плазмы крови с концентрацией амантадина 500 нг/мл, верхний пик - пик аналита, нижний пик - пик внутреннего стандарта (по вертикали относительное содержание (Relative abundance), по горизонтали время (Time) в минутах).

Для приготовления калибровки готовили маточные растворы стандартов амантадина и внутреннего стандарта в метаноле с концентрациями 1 мг/мл. Раствор амантадина применяли для приготовления растворов рабочих стандартных образцов на плазме крови с концентрациями 31,3 нг/мл; 62,5 нг/мл; 125 нг/мл; 250 нг/мл; 500 нг/мл; 1000 нг/мл. Раствор внутреннего стандарта с концентрацией 1 мг/мл разбавляли в 20 раз для получения рабочего раствора внутреннего стандарта с концентрацией 50 мкг/мл. Калибровочная кривая амантадина в плазме крови показана на фиг. 4.

Количественное определение осуществляли по градуировочной зависимости для амантадина в плазме крови и рассчитывали по формуле:

С = 1198,5306×AR, где С - концентрация амантадина (мкг/мл), AR (Area Ratio) -отношение площадей пиков аналита и внутреннего стандарта. Коэффициент корреляции составил R2=0,9985, что соответствует надлежащей аналитической аппроксимации. Предел количественного определения - 31,3 нг/мл.

Точность и воспроизводимость.

Точность выражалась в виде коэффициента вариации (% C.V.) для каждой серии образцов согласно уравнению:

, где

SD - стандартное отклонение серии определений;

- среднее арифметическое значение полученных концентраций.

Воспроизводимость измерялась, как процент отклонения (%dev.) от теоретического значения по формуле:

, где

- среднее арифметическое значение полученных концентраций;

- теоретическая концентрация

Для метрологической валидации полученной методики определяют точность в течение рабочего дня. Каждый из образцов, предназначенных для контроля качества, анализировали в течение 1 рабочего дня (6 определений). Результаты представлены в таблице 1.

Относительная ошибка определения амантадина не превышала 10%. Таким образом, представленный метод обладает высокой эффективностью в проведении анализа, не требует использования большого количества химических реактивов. Высокая точность и чувствительность данного метода количественного определения амантадина в плазме крови обеспечивает идентификацию вещества с установленными характеристиками погрешности, что позволяет использовать данную методику для решения задач по изучению как экспериментальной, так и клинической фармакокинетики препарата.