Результат интеллектуальной деятельности: Новый сульфатированный фукоолигосахарид и способ его получения

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения новых сульфатированных фукоолигосахаридов из фукоиданов. Эти соединения могут быть использованы в научных исследованиях, а также в медицине, косметологии, сельском хозяйстве.

Фукоиданы - сульфатированные гетерополисахариды бурых водорослей обладают широким спектром биологической активности [Fitton, J.H., Stringer, D.N., and Karpiniec, S.S. (2015). Therapies from Fucoidan: An Update. Marin Drugs 13, 5920-5946]. Однако использование полимерных молекул в медицине практически невозможно из-за гетерогенности препаратов полисахаридов и невозможности их стандартизации. Поэтому стоит проблема получения из фукоидана олигосахаридов, имеющих постоянные структуры и стандартные характеристики. Применение ферментов для деполимеризации биологически активных фукоиданов и получение олигосахаридов открывает новые возможности использования этих соединений в фармацевтике и косметологии [Kusaykin, M.I., Silchenko, A.S., Zakharenko, A.M., and Zvyagintseva, T.N. (2016). Fucoidanases. Glycobiology 26, 3-12].

Описано использование фукозилированных олигосахаридов в составе композиции, используемой для предупреждения и/или лечения атопического дерматита и экземы [RU 2586776 С2, 10.06.2016], желудочно-кишечной инфекции [WO2016139333 А1, 09.09.2016]. Предложены новые N-сульфатированные олигосахариды, стимулирующие образование сосудов [RU 2559629 С2, 10.08.2015], а также новые сульфатированные производные олигосахаридов, эффективные в качестве ингибиторов гепаринсульфат-связывающих белков [RU 2483074 С2, 27.05.2013]. Известны фукоолигосахариды, которые могут быть использованы для защиты растений от патогенов [US 6984630 В1, 10.01.2006].

По сравнению с получением сульфатированных олигосахаридов многостадийным методом органического синтеза, ферментативное получение подобных олигосахаридов из фукоиданов отличается меньшей трудоёмкостью, существенно меньшим числом стадий получения и высоким выходом продуктов реакции.

Описано получение фукоолигосахаридов из фуканов деполимеризацией с помощью бактериальных эндофуканаз [US 6984630 В1, 10.01.2006].

Описано получение фукоолигосахаридов, используемых в области гликотехнологии, с помощью ферментов из фукоидана, полученного из бурых водорослей порядка Laminarinales. [US 6927289 В2, 09.08.2005].

Раннее нами были получены фукоолигосахариды ферментативным гидролизом фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens. Для этого фукоидан смешивали с нативной фукоиданазой FFA из морской бактерии Formosa algae в 0,015 М Na-фосфатном буфере, рН 7,2 и инкубировали в течение 72 ч при 25ºС. Высокомолекулярные продукты гидролиза осаждали 75% водным раствором этанола. Выпавший осадок центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Супернатант упаривали на роторном испарителе, растворяли в дистиллированной воде и наносили на термостатируемую колонку с биогелем Р-6, уравновешенную водой. Фукоолигосахариды элюировали со скоростью 0,7 мл/мин. Присутствие сахаров в исследуемых фракциях проверяли фенол-сернокислотным методом. Низкомолекулярные фракции олигосахаридов объединяли, концентрировали на роторном испарителе и рехроматографировали. В результате получали дисахариды [Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp: диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2014, стр. 69].

На фиг. 1 (А, Б) представлены структуры дисахаридов.

Задача изобретения – расширение арсенала сульфатированных фукоолигосахаридов. Задача решена разработкой способа их получения из фукоидана, выделенного из бурой водоросли Sargassum horneri.

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в получении новых сульфатированных фукоолигосахаридов постоянной структуры из фукоидана из Sargassum horneri.

В доступной патентной и другой научно-технической литературе заявляемые сульфатированные фукоолигосахариды не обнаружены.

Заявляемый сульфатированный фукоолигосахарид формулы I состоит из остатков фукозы (n=4), связанных чередующимися 1→3;1→4 гликозидными связями, сульфатные группы расположены при С2 в 1→3-связанных остатках фукозы, и при С2 и С3 в 1→4-связанных остатках фукозы.

На фиг. 2 представлена структура сульфатированного фукоолигосахарида формулы I.

Заявляемый сульфатированный фукоолигосахарид формулы II состоит из остатков фукозы (n=6), связанных чередующимися 1→3;1→4 гликозидными связями, сульфатные группы расположены при С2 в 1→3-связанных остатках фукозы, и при С2 и С3 в 1→4-связанных остатках фукозы, к третьему моносахаридному остатку, которого присоединена боковая цепь с 1→4 гликозидной связью, состоящая из 2 остатков несульфатированной фукозы, связанных между собой 1→2 гликозидной связью.

На фиг. 3 представлена структура сульфатированного фукоолигосахарида формулы II.

Заявляемый способ получения сульфатированных фукоолигосахаридов формул I и II заключается в том, что рекомбинантную фукоиданазу FFA1 в Tris-HCl буфере рН 7,2 смешивают с 5-10% раствором фукоидана из Sargassum horneri, смесь инкубируют при 37°С в течение 72-75 часов, затем нагревают до 100°С в течение 5-10 мин, далее высокомолекулярные продукты гидролиза осаждают 75% водным раствором этанола или ацетона, затем образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования при 9000-10000 g в течение 20-30 мин, а супернатант наносят на колонку с анионообменным сорбентом, уравновешенную водой, и элюируют фукоолигосахариды линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I, далее полученные фракции целевых продуктов лиофильно высушивают.

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 получают известным способом [Сильченко А.С. Фукоиданазы и альгинат-лиазы морской бактерии Formosa algae KMM 3553T и морского моллюска Lambis sp: диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, 2014, стр. 110].

Фукоидан получают из бурой водоросли Sargassum horneri по известной методике [Zvyagintseva, T. N., Shevchenko, N. M., et.al. (1999). A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr. Res. 322, 32-39].

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

ПРИМЕР 1

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 (1 мг) в Tris-HCl буфере, рН 7,2 смешивают с 5% раствором фукоидана из Sargassum horneri. Смесь инкубируют при 37°С в течение 72 ч, затем нагревают до 100°С в течение 5 мин. Образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования и отбрасывают. В супернатант добавляют этанол до достижения его концентрации 75%. Выпавший осадок (высокомолекулярная фракция) центрифугируют при 9000 g в течение 20 мин. Супернатант (низкомолекулярная фракция) наносят на колонку с сорбентом Q-Sepharose, уравновешенную водой. Олигосахариды элюируют линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I. Полученные фракции олигосахаридов лиофильно высушивают. Выход целевых продуктов составляет 5-15% от веса низкомолекулярной фракции.

ПРИМЕР 2

Рекомбинантную фукоиданазу FFA1 (1 мг) в Tris-HCl буфере, рН 7,2 смешивают с 10% раствором фукоидана из Sargassum horneri. Смесь инкубируют при 37°С в течение 75 ч, затем нагревают до 100°С в течение 10 мин. Образовавшийся осадок отделяют с помощью центрифугирования и отбрасывают. В супернатант добавляют ацетон до достижения его концентрации 75%. Выпавший осадок (высокомолекулярная фракция) центрифугируют при 10000 g в течение 30 мин. Супернатант (низкомолекулярная фракция) наносят на колонку с сорбентом Mono-Q, уравновешенную водой. Олигосахариды элюируют линейным градиентом гидрокарбоната аммония со скоростью 1 мл/мин, сначала сульфатированный фукоолигосахарид формулы II, затем сульфатированный фукоолигосахарид формулы I. Полученные фракции олигосахаридов лиофильно высушивают. Выход целевых продуктов составляет 7-20% от веса низкомолекулярной фракции.

Структура полученных олигосахаридов была установлена с помощью ЯМР спектроскопии.

На ¹H-спектре олигосахарида формулы I были обнаружены химические сдвиги, принадлежащие четырём разным остаткам α-метил-L-фукопиранозида, обозначенным буквами a-d, представленные в таблице 1. С помощью спектров 1DTOXY и COSY были определены хим. сдвиги, принадлежащие каждому остатку, и их последовательность. Из HSQC-спектра было установлено соотношение между хим. сдвигами ¹H и ¹³C. Спектр ROESY показал корреляцию между H1 остатка d и H4 остатка c, H1 остатка c и H3 остатка a, H1 остатка b и H3 и H4 остатка d. В спектре HMBC наблюдалась связь между С1 остатка d и H4 остатка c, С1 остатка c и H3 остатка a, С1 остатка b и H3 и остатка d. Аналогично протоны d1, c1 и b1 коррелировали с атомами углерода c4, a3 и d3 соответственно. На основании этого был сделан вывод, что олигосахарид формулы I имеет углеродный скелет α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp.

Спектр ¹H снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 2,225. Спектр ¹³С снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 31,45.

Аналогичным образом была установлена структура олигосахарида формулы II. ¹H-спектр показал наличие шести разных моносахаридных остатков. Спектры 1DTOXY, COSY и HSQC позволили установить протонные и углеродные хим. сдвиги каждого из них, представленные в таблице 2.

На спектре ROESY наблюдается корреляция между H1 остатка a’ и H4 остатка d’, H1 остатка e’ и H3 остатка d’, H1 остатка d’ и H4 остатка c’, H1 остатка c’ и H3 остатка b’, H1 остатка f’ и H2 остатка a’. В спектре HMBC атомы углерода a’1, d’1, e’1, f’1, c’1 коррелируют с протонами d’4, c’4, d’3, a’2 и b’3 соответственно, а протоны a’1, e’1, f’1, d’1 – с атомами углерода d’4, d’3, a’2, c’4 соответственно. Кроме того, в спектре HMBC наблюдается связь атома углерода b’3 с протоном c’1 или d’1.

Спектр ¹H снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 2,225. Спектр ¹³С снят при 700 MHz, 308 К, хим. сдвиги измерены относительно хим. сдвига ацетона 31,45.

На основании вышесказанного был сделан вывод, что олигосахарид формулы II имеет разветвлённую структуру вида

α-L-Fucp-1→2-α-L-Fucp-1↓4

α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp-1→4-α-L-Fucp-1→3-α-L-Fucp.

Положение сульфатов в моносахаридных остатках было установлено путём сравнения сдвигов их протонов с фукозой (H1 = 5,19, H2 = 3,76, H3 = 3,85, H4 = 3,80, H5 = 4,19, H6 = 1,20) и сдвигов их углеродных атомов с α-метил-L-фукопиранозидом (C1 = 100,5, C2 = 69,0, С3 = 70,6, С4 = 72,9, С5 = 67,5, С6 = 16,5). Сульфатирование в положении 2 было вычислено из смещения H2 в слабое поле на 0,8-0,9 ppm относительно фукозы и C2 – на 4-6 ppm относительно α-метил-L-фукопиранозида. По сдвигу H3 в слабое поле на 0,9-1,0 ppm и C3 – на 4-6 ppm было установлено наличие сульфатов в положении 3.

Заявляемые сульфатированные фукоолигосахариды используют в научных исследованиях в качестве субстратов фукоиданаз, фукозидаз и сульфатаз.