СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДИНАМИЧЕСКОГО ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу определения содержания триглицеридов в сыворотке крови, позволяющему на основе измерения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови коров с использованием метода регрессии определить содержание в ней триглицеридов.

Исследование липидного спектра, одним их компонентов которого являются триглицериды, рекомендовано Всемирной организацией здравоохранения в качестве одного из индикаторов риска осложнений заболеваний сердечно-сосудистой системы. На текущий момент существуют следующие показания для этого исследования: определение степени риска развития атеросклероза и связанных с ним осложнений - инфаркта, инсульта, тромбоза периферических артерий; диагностика гиперлипидемий; сахарный диабет; ожирение; панкреатит, холецистит и другие заболевания пищеварительного тракта.

Развитие ветеринарной науки предъявляет новые требования к диагностике, лечению и профилактике заболеваний у животных. Использование методов ранней, доклинической диагностики может уменьшить затраты на лечение и предотвратить снижение продуктивности сельскохозяйственных животных.

Метод регрессии активно применяется в зарубежной практике для моделирования биологических процессов (Rossau C.D., Mortensen Р.В. Risk factors for suicide in patients with schizophrenia: nested case-control study. The British Journal of Psychiatry. October 1997. vol. 171 (4). P. 355-359; Abraham H.D., Degli-Esposti S, Marino L. Seroprevalence of hepatitis С in a sample of middle class substance abusers. Journal of Addictive Disease 1999. Vol. 18(4). P. 77-87; Watson P., Petrie A. Statistics for Veterinary and Animal Science. John Wiley & Sons, 2013. 408 p.), в то время как в отечественной литературе он встречается значительно реже (Курилович С.А., Решетников О.В., Шахматов С.Г. с соавт. Распространенность и факторы риска развития желчнокаменной болезни в женской популяции Новосибирска. //Терапевтический архив. - 2000. №2. С. 21-26). Патент РФ №245692, опубл. 27.07.2012; Патент РФ №2277243, опубл. 27.05.2006). Также сравнительно новым для ветеринарии и является метод определения ДПН сыворотки крови. Известен способ определения поверхностного натяжения сыворотки крови человека (В.Н. Казаков, О.В. Синяченко, Г.А. Игнатенко и др. Межфазная тензиометрия биологических жидкостей в терапии. - Донецк: Донеччина, 2003, 584 с.) для определения эффективности проводимого лечения. В ветеринарной практике определение динамического поверхностного натяжения используется для оценки готовности лошадей к соревнованиям (Патент РФ, №2336524, G01N 33/49, опубл. 20.10.2008).

Известен способ определения жира и белка в молоке по результатам динамического поверхностного натяжения с применением регрессионной модели (Патент РФ, №2600820, G01N 33/04, опубл. 27.10.2016).

Однако состав и строение жировых компонентов молока и крови кардинально различается. Жир в молоке находится в виде эмульсии, состоящей из жировых капель или жировых шариков. Жировые шарики - это жировые ядра с окружающими их оболочками. Диаметр жировых шариков - 2,5-5,0 мкм. Непосредственно за жировым ядром, которое состоит из триглицеридов, радиально располагается слой фосфолипидов, углеродные цепи которых сцеплены с жировой фазой. В состав фосфолипидов входят: лецитин, кефалин, сфингомиелин и цереброзиды. В слое фосфолипидов находится также холестерол, который погружен в гидрофильные группы окружающей их белковой оболочки таким же образом, как и фосфолипиды в гидратную оболочку наружной белковой мембраны.

Триглицериды крови (нейтральные жиры) - это эфиры трехатомного спирта глицерина и высших жирных кислот (стеариновой, линолевой, линоленовой, пальмитиновой и др.). Они могут находиться в крови в свободном виде и в связанным с белком виде, называемом липопротеинами. Выделяют от 4 до 7 видов липопротеинов, отличающихся размерами и составом. Размеры основных липопротеиновых комплексов менее 100 нм, что значительно меньше, чем размеры жировых шариков в молоке (Кольман Я., Рём К.-Г., «Наглядная биохимия», пер.с нем., М., «Мир», 2009. с. 272-274.;.Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. «Биохимия человека», в 2 т. М., «Мир», 2003, с 257-261.). Это сказывается на их адсорбционной способности и скорости концентрирования на границе раздела фаз, что и фиксируют параметры динамического поверхностного натяжения.

Обычно компоненты сыворотки крови определяются биохимически. Определение основного липидного компонента крови - триглицеридов - в настоящее время осуществляется затратными биохимическими методами, основанными на использовании ферментного щелочного или энзиматического гидролиза с высвобождением глицерина. В основе биохимического метода анализа лежат цветные реакции, в ходе которых происходит изменение окраски реакционной среды. В свою очередь, интенсивность изменения цвета пропорциональна содержанию в исследуемом материале метаболита и определяется фотометрически. Метод дорогостоящий вследствие высокой цены используемых приборов и наборов реагентов.

Обязательным условием при проведении такого анализа является изначальная прозрачность сыворотки крови и слегка желтоватый оттенок.

Таким образом, метод имеет ограничения при наличии в исследуемом образце, например, хилеза - в этом случае помутнение обусловлено повышенным уровнем триглицеридов в сыворотке крови, что придает ей мутность, белый цвет, сметанообразную консистенцию. При этом невозможно выделить отдельные компоненты, а значит, и провести анализ. Аналогичные проблемы возникают при наличии в образце разрушенных эритроцитов (гемолиз) или превышении концентрации желчных пигментов (иктеричность).

Межфазная тензиометрия позволяет проводить измерения в окрашенных средах, что существенно расширяет возможности биохимического анализа.

Определение количества триглицеридов в сыворотке крови посредством измерения ее динамического поверхностного натяжения из уровня техники не известно.

Предлагаемый способ направлен на определение количества триглицеридов в зависимости от динамического поверхностного натяжения сыворотки крови, измеренного методом максимального давления в пузырьке на тензиометре ВРА-1Р. Способ позволит значительно сократить расходы не только на дорогостоящие приборы для биохимических исследований, но и на химические реагенты, расходуемые для анализа, а также ускорить получение результата.

Техническим результатом, достигаемым при реализации предлагаемого способа, является существенное удешевление, ускорение, упрощение определения содержания триглицеридов в сыворотке крови на основе измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН).

Указанный технический результат достигается тем, что у пробы сыворотки крови любого качества (включая наличие хилеза, гемолиза и иктеричности) объемом 1 - 3 мл измеряют динамическое поверхностное натяжение на тензиометре, работающем по принципу максимального давления в пузырьке. Может быть использована не только свежая сыворотка крови, но и после двух- или трехкратной заморозки и после хранения в холодильнике до 4-х дней; при использовании биохимического способа анализа допускается только однократная заморозка. По полученным значениям динамического поверхностного натяжения определяют содержание триглицеридов в сыворотке крови с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа, определяющих взаимосвязь между содержанием триглицеридов в сыворотке крови с его динамическим поверхностным натяжением. Для измерения динамического поверхностного натяжения пробу сыворотки крови вводят в измерительную ячейку прибора.

Определение ДПН проводится на тензиометре ВРА-1Р (Maximum Bubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies). Значительными преимуществами такой методики являются: простота в эксплуатации оборудования и программного обеспечения прибора; отсутствие расходных материалов, что сказывается на итоговой себестоимости проведения исследования; настройка и калибровка прибора проходит по воде, что не требует дополнительных расходов на калибраторы и нормы; возможность использования консервантов в работе, что позволяет проводить отсроченные исследования; возможность использовать уже измеренные образцы для других исследований.

Принцип работы прибора довольно прост. Воздух от компрессора поступает в капилляр, который опущен в исследуемую жидкость (сыворотку крови). С помощью электрического преобразователя определяется избыточное давление в системе (максимальное давление в пузырьке), которое используется для расчета поверхностного натяжения. Электрические сигналы от измерительных систем поступают в электронный блок, который посредством аналого-цифрового преобразователя соединен с персональным компьютером. В результате проведенных измерений прибор позволяет получать графики зависимости от времени поверхностного натяжения в приграничном слое жидкости. На тензиограммах с помощью программы определяются точки, соответствующие t→0 (σ₀), t=0,02 с (σ₁), t=1 с (σ₂), а также рассчитывается равновесное ПН t→∞ (σ₃) путем экстраполяции кривой в координатах σ/(t^-1/2). В ходе компьютерной обработки данных (программа ASD) меняется система координат: при определении угла наклона начального участка кривой (λ₀) используют координаты a σ/(t^1/2), а для конечного участка кривой (λ₁) координаты σ/(t^-1/2).

Таким образом,

σ₀ [мН/м] поверхностное натяжение при начале измерения (t→0)

σ₁ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=0,02 секунд,

σ₂ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=1 секунда,

σ₃ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=10 секунд,

λ₀ - [мН/м⋅с^1/2] угол наклона начального участка кривой в координатах σ/(t^1/2)

λ₁ - [мН/м⋅с^-1/2] угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t^-1/2)

Для определения влияния количества триглицеридов в сыворотке крови на параметры ее ДПН проводится корреляционный анализ между ними в программе Microsoft Excel.

На основе регрессионной модели выведены следующие формулы для расчета

[Триглицериды]=-0,11σ₁+0,14σ₂-0,1σ₃-0,09λ₁+5,79;

где σ₀ [мН/м] поверхностное натяжение при начале измерения (t→0)

σ₁ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=0,02 секунд,

σ₂ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=1 секунда

σ₃ [мН/м]- поверхностное натяжение при времени t=10 секунд,

λ₁ [мН/м⋅с^-1/2] - угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t^-1/2)

Для упрощения процесса расчетов используется программа статистической обработки данных R (версия 3.1.2.).

Полученные согласно предлагаемому способу данные могут быть использованы для определения содержания триглицеридов в сыворотке крови, что позволяет установить состояние организма животных.

Процедура измерения ДПН заключается в следующем: исследуемая проба сыворотки крови (1-3 мл) наливается в стеклянный стаканчик диаметром 1 см, высотой 2 см, ставится под капилляр прибора (радиус капилляра 0,13 мм), запускается программное обеспечение и начинается процедура измерения.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

По процедуре, описанной выше, определено динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови коровы черно-пестрой породы, проба 1. Получены параметры ее ДПН: σ₁ - 73,06 мН/м, σ₂ - 64,2 мН/м, σ₃ - 39,02 мН/м; угол наклона: λ₁ - 30,0 мН⋅м^-1 с^1/2. Параллельно, для сравнения, известным биохимическим методом на биохимическом анализаторе URIT-8030, (компания Urit Medical Electronic Co., Ltd, Китай) измерено содержание триглицеридов - 0,14 ммоль/л.

Согласно представленной выше формуле проведен расчет значений триглицеридов (ммоль/л):

[Триглицериды] =-0,11⋅73,06+0,14⋅64,2-0,1⋅39,02-0,09⋅30,0+5,79≈0,14 ммоль/л. Таким образом, содержание триглицеридов, определенное сравнительным биохимическим методом и по предложенному способу практически совпадает.

Определение динамического поверхностного натяжения позволяет более полно описать физико-химические свойства сыворотки крови, что может быть применено в мероприятиях по контролю физиологического состояния и здоровья животных.

Исследование выполнено за счет Российского научного фонда (проект №14-16-00046).