СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДИНАМИЧЕСКОГО ПОВЕРХНОСТНОГО НАТЯЖЕНИЯ

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу определения содержания холестерола в сыворотке крови, позволяющему на основе измерения динамического поверхностного натяжения сыворотки крови коров с использованием метода регрессии определить содержание в ней холестерола.

Развитие ветеринарной науки предъявляет новые требования к диагностике, лечению и профилактике заболеваний у животных. Использование методов ранней, доклинической диагностики может уменьшить затраты на лечение и предотвратить снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Определение важного липидного компонента крови - холестерола - в настоящее время осуществляется затратными биохимическими методами, чаще всего - энзиматическим колориметрическим методом. Принцип метода: при гидролизе эфиров холестерола образуется свободный холестерол. Образовавшийся в результате гидролиза и имеющийся в пробе холестерол окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярных количеств перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации холестерола в пробе и измеряется фотометрически.

Метод регрессии активно применяется в зарубежной практике для моделирования биологических процессов (Rossau CD., Mortensen Р.В. Risk factors for suicide in patients with schizophrenia: nested case-control study. The British Journal of Psychiatry. October 1997, vol. 171 (4). P. 355-359; Abraham H.D., Degli-Esposti S, Marino L. Seroprevalence of hepatitis С in a sample of middle class substance abusers. Journal of Addictive Disease 1999. Vol. 18(4). P. 77-87; Watson P., Petrie A. Statistics for Veterinary and Animal Science. John Wiley & Sons, 2013. 408 p.), в то время как в отечественной литературе он встречается значительно реже (Курилович С.А., Решетников О.В., Шахматов С.Г. с соавт. Распространенность и факторы риска развития желчнокаменной болезни в женской популяции Новосибирска. //Терапевтический архив. - 2000. №2. С. 21-26). Патент РФ №245692, опубликовано 27.07.2012; Патент РФ №2277243, опубл. 27.05.2006). Также сравнительно новым для ветеринарии является метод определения ДПН сыворотки крови. Известен способ определения поверхностного натяжения сыворотки крови человека (В.Н. Казаков, О.В. Синяченко, Г.А. Игнатенко и др. Межфазная тензиометрия биологических жидкостей в терапии. - Донецк: Донеччина, 2003, 584 с.) для определения эффективности проводимого лечения. В ветеринарной практике определение динамического поверхностного натяжения используется для оценки готовности лошадей к соревнованиям (Патент РФ, №2336524, G01N 33/49, опубл. 20.10.2008).

Известен способ определения жира и белка в молоке по результатам динамического поверхностного натяжения с применением регрессионной модели (Патент РФ, №2600820, G01N 33/04, опубликовано 27.10.2016). Однако, определение холестерола в сыворотке крови посредством измерения ее динамического поверхностного натяжения из уровня техники не известно.

Жиры или триглицериды - природные органические соединения, полные сложные эфиры глицерина и одноосновных жирных кислот; входят в класс липидов. Холестерол - природный липофильный спирт, содержащийся в клеточных мембранах всех животных организмов. Это вторичный одноатомный ароматический спирт, с полициклическим ядром циклопентанпергидрофенантрена. По химическому строению триглицериды и холестерол существенно отличаются.

В молоке жир находится в виде так называемых «жировых шариков», достаточно крупных образований (диаметром 2,5-5,0 мкм) сложной структуры. Основным компонентом жировых шариков молока, составляющим ядро, являются триглицериды, другие жировые компоненты находятся в оболочке жировых шариков и представлены в незначительном количестве (1% составляют фосфолипиды, 0,012-0,014% - холестерол и другие стерины).

В крови содержание холестерола значительно выше. Он находится в сыворотке крови в составе комплексов разной плотности с белками. На долю холестерола в таких комплексах может приходиться от 5% (в хил омикронах) до 40-50% (в ЛПНП и ЛПВП), что в сумме составляет до 5 ммоль холестерола в литре сыворотки крови. При повышенном содержании холестерола в крови возникает гиперхолестеролемия - это симптом следующих заболеваний: ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, атеросклероз, заболевания печени, заболевания почек, хронический панкреатит, рак поджелудочной железы, сахарный диабет, гипотиреоз, ожирение, дефицит соматотропного гормона (СТГ) и др. Поэтому контроль этого биохимического показателя в крови имеет важное диагностическое значение.

Обычно компоненты сыворотки крови определяются биохимически. В основе биохимического метода анализа лежат цветные реакции, в ходе которых происходит изменение окраски реакционной среды. В свою очередь, интенсивность изменения цвета пропорциональна содержанию в исследуемом материале метаболита и определяется фотометрически.

Обязательным условием при проведении такого анализа является изначальная прозрачность сыворотки крови и слегка желтоватый оттенок. Таким образом, метод имеет ограничения при наличии в исследуемом образце, например, хилеза - в этом случае помутнение обусловлено повышенным уровнем триглицеридов в сыворотке крови, что придает ей мутность, белый цвет, сметанообразную консистенцию. При этом невозможно выделить отдельные компоненты, а значит и провести анализ. Аналогичные проблемы возникают при наличии в образце разрушенных эритроцитов (гемолиз) или превышении концентрации желчных пигментов (иктеричность).

Межфазная тензиометрия позволяет проводить измерения в окрашенных средах, что существенно расширяет возможности биохимического анализа.

Предлагаемый способ направлен на определение холестерола в зависимости от динамического поверхностного натяжения сыворотки крови, измеренного методом максимального давления в пузырьке на тензиометре ВРА-1Р с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа. Способ позволит значительно сократить расходы не только на дорогостоящие приборы для биохимических исследований, но и на химические реагенты, расходуемые для анализа, а также ускорить получение результата.

Техническим результатом, достигаемым при реализации предлагаемого способа, является существенное удешевление, ускорение, упрощение определения содержания холестерола в сыворотке крови на основе измерения динамического поверхностного натяжения (ДПН).

Указанный технический результат достигается тем, что у пробы сыворотки крови любого качества (включая наличие хилеза, гемолиза и иктеричности) объемом 1-3 мл измеряют динамическое поверхностное натяжение на тензиометре, работающем по принципу максимального давления в пузырьке. Может быть использована не только свежая сыворотка крови, но и после двух- или трехкратной заморозки и после хранения в холодильнике до 4-х дней; при использовании биохимического способа анализа допускается только однократная заморозка. По полученным значениям динамического поверхностного натяжения определяют содержание холестерола в сыворотке крови с использованием формул регрессионно-корреляционного анализа, определяющих взаимосвязь между содержанием холестерола в сыворотке крови с параметрами его динамического поверхностного натяжения. Для измерения динамического поверхностного натяжения пробу сыворотки крови вводят в измерительную ячейку прибора.

Определение ДПН проводится на тензиометре ВРА-1Р (Maximum Bubble Pressure Tensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies). Значительными преимуществами такой методики являются: простота в эксплуатации оборудования и программного обеспечения прибора; отсутствие расходных материалов, что сказывается на итоговой себестоимости проведения исследования; настройка и калибровка прибора проходит по воде, что не требует дополнительных расходов на калибраторы и нормы; возможность использования консервантов в работе, что позволяет проводить отсроченные исследования; возможность использовать уже измеренные образцы для других исследований.

Принцип работы прибора довольно прост. Воздух от компрессора поступает в капилляр, который опущен в исследуемую жидкость (сыворотку крови). С помощью электрического преобразователя определяется избыточное давление в системе (максимальное давление в пузырьке), которое используется для расчета поверхностного натяжения. Электрические сигналы от измерительных систем поступают в электронный блок, который посредством аналого-цифрового преобразователя соединен с персональным компьютером. В результате проведенных измерений прибор позволяет получать графики зависимости от времени поверхностного натяжения в приграничном слое жидкости. На тензиограммах с помощью программы определяются точки, соответствующие t→0 (σ₀), t=0,02 с (σ₁), t=1 с (σ₂), a также рассчитывается равновесное ПН t→∞ (σ₃) путем экстраполяции кривой в координатах σ /(t^-1/2). В ходе компьютерной обработки данных (программа ASD) меняется система координат: при определении угла наклона начального участка кривой (λ₀) используют координаты σ/(t^1/2), а для конечного участка кривой (λ₁) координаты σ/(t^-1/2).

Таким образом,

σ₀ [мН/м] поверхностное натяжение при начале измерения (t→0),

σ₁ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=0,02 секунд,

σ₂ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=l секунда,

σ₃ [мН/м] - поверхностное натяжение при времени t=10 секунд,

λ₀ - [мН/м⋅с^1/2] угол наклона начального участка кривой в координатах σ/(t^1/2)

λ₁ - [мН/м⋅с^-1/2] угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t^-1/2)

Для определения влияния количества холестерола в сыворотке крови на параметры ее ДНН проводится корреляционный анализ между ними в программе Microsoft Excel.

На основе регрессионной модели выведены следующая формула для расчета

[Холестерол] =0,25σ₁-0,22σ₂-0,1λ₀+0,12λ₁+0,71,

где σ₁ [мН/м]- поверхностное натяжение при времени t=0,02 секунд,

σ₂ [мН/м]- поверхностное натяжение при времени t=1 секунда

λ₀ [мН/м⋅с^1/2] - угол наклона начального участка кривой в координатах σ/(t^1/2),

λ₁ [мН/м⋅с^-1/2] - угол наклона конечного участка кривой в координатах σ/(t^-1/2).

Для упрощения процесса расчетов используется программа статистической обработки данных R (версия 3.1.2.).

Полученные согласно предлагаемому способу данные могут быть использованы для определения содержания холестерола в сыворотке крови, что позволяет установить состояние организма животных.

Процедура измерения ДПН заключается в следующем: исследуемая проба сыворотки крови (1-3 мл) наливается в стеклянный стаканчик диаметром 1 см, высотой 2 см, ставится под капилляр прибора (радиус капилляра 0,13 мм), запускается программное обеспечение и начинается процедура измерения.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

По процедуре, описанной выше, определено динамическое поверхностное натяжение сыворотки крови коровы черно-пестрой породы, проба 1. Получены параметры ее ДПН: σ₁ - 72,22 мН/м, σ₂ - 64,18 мН/м; углы наклона: λ₀ - 8,56 мН⋅м^-1 с^-1/2 и λ₁ - 13,84 мН⋅м^-1 с^1/2. Параллельно, для сравнения, известным биохимическим методом на биохимическом анализаторе URIT-8030, (компания Urit Medical Electronic Co., Ltd, Китай) измерено содержание холестерола - 5,5 ммоль/л.

Согласно представленной выше формуле проведен расчет значений холестерола (ммоль/л)

[Холестерол]=0,25⋅72,22-0,22⋅64,18-0,1⋅8,56+0,12⋅13,84+0,71=5,45 ммоль/л.

Таким образом, содержание холестерола, определенное сравнительным биохимическим методом и по предложенному способу, практически совпадает (разница составляет 0,9%).

Определение динамического поверхностного натяжения позволяет более полно описать физико-химические свойства сыворотки крови, что может быть применено в мероприятиях по контролю физиологического состояния и здоровья животных.

Исследование выполнено за счет Российского научного фонда (проект №14-16-00046).