ИНАКТИВИРОВАННЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА ВЕТРЯНОЙ ОСПЫ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к композициям и способам профилактики и лечения опоясывающего лишая. Более конкретно изобретение относится к вакцинным композициям, содержащим вакцину на основе инактивированного вируса ветряной оспы (VZV), и способам получения указанных композиций.

Предпосылки создания изобретения

Первичная инфекция вирусом ветряной оспы (VZV) вызывает ветряную оспу, как правило, у детей и подростков. Хотя клинические проявления ветряной оспы, как правило, разрешаются самостоятельно в течение короткого периода времени, VZV может сохраняться в латентном состоянии в сенсорных нейронах в течение многих лет после инфекции. Реактивация и репликация латентного VZV, как правило, через десятилетия может вызывать опоясывающий лишай (HZ), широко известный как опоясывающий герпес, болезненные высыпания, которые, как правило, ограничены только дерматомом. Такая реактивация VZV коррелирует со снижением клеточного иммунитета, которое возникает в пожилом возрасте, или у лиц с ослабленным иммунитетом (Weinberg et al., Journal of Infectious Diseases (2009) 200: 1068-77). У некоторых пациентов боль, ассоциированная с HZ, может сохраняться в течение месяцев или даже лет после лечения высыпаний HZ, осложнение, обозначаемое как постгерпетическая невралгия (PHN).

В настоящее время существует живая аттенуированная вакцина (ZOSTAVAX®, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ) для профилактики опоясывающего лишая у здоровых пациентов пожилого возраста (патенты США 6214354 и 5997880). Такая вакцина заметно снижает неблагоприятное воздействие HZ в популяциях иммунокомпетентных пациентов (Oxman MN, Clin. Infect. Dis. (2010) 51(2):197-213, Sanford and Keating, Drugs Aging (2010) 27(2): 159-76, Oxman et al., N. Engl. J. Med. (2005) 352: 2271-83). Однако живые аттенуированные вакцины могут быть неподходящими для пациентов с иммунной недостаточностью.

Частота возникновения HZ у индивидуумов с ослабленным иммунитетом, включая пациентов, страдающих гематологическими злокачественными новообразованиями, пациентов, перенесших иммуносупрессивную терапию, пациентов, которым проводили трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток (HCT) или трансплантацию целого органа (SOT), ВИЧ-инфицированных пациентов и пациентов с аутоиммунными заболеваниями, выше относительно общей популяции. Кроме того, такие популяции пациентов подвержены повышенному риску возникновения тяжелых и опасных для жизни осложнений (Gourishankar et al. (2004) Am. J. Transplant. 4: 108-115, Ragozzino et al. (1982) Medicine (Baltimore) 61: 310-316, Wung et al. (2005) Am. J. Med. 118: 1416.e9-1416.el8, Dworkin & Schmader (2003) Clinical Infectious Diseases 36: 877-882, Gebo et al. (2005) J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 40: 169-174, Mattiuzzi et al. (2003) Clinical Cancer Research 9: 976-980, Dworkin et al. (2003) Neurology 60: 1274-1283), таких как менингоэнцефалиты (Tauro et al (2000) Bone Marrow Transplant 26: 795-796), поперечный миелит, нарушение зрения (Walton et al. (1999) Bone Marrow Transplant 23: 1317-1320), пневмония (Wacker et al. (1989) Bone Marrow Transplant 4: 191-194), гепатит (Rogers et al. (1995) Bone Marrow Transplant 15: 805-807, Schiller et al. (1991) Bone Marrow Transplant 7: 489-491), бактериальная суперинфекция, рубцевание кожи и обезображивание (Schuchter et al. (1989) Blood 74: 1424-1427). Несмотря на высокий риск заболеваемости и смерти, ассоциированных с HZ, у индивидуумов с ослабленным иммунитетом, для этой популяции не допускается вакцинация живой аттенуированной вакциной против HZ, такой как ZOSTAVAX®. Таким образом, существует существенная необходимость в вакцинах, которые являлись бы безопасными и эффективными для популяций пациентов с иммунной недостаточностью для предотвращения HZ или уменьшения тяжести или продолжительности HZ, или ассоциированных с ним осложнений.

Вопросы безопасности в отношении пациентов с иммунной недостаточностью подтолкнули исследователей к исследованию применения инактивированных вакцин против вирусных патогенов, таких как субъединичные вакцины, вакцины на основе вирусоподобных частиц и инактивированных цельных вакцин. Многие одобренные инактивированные вакцины содержат вирусы, которые инактивированы с использованием формалина, включая вакцины против гепатита A, полиомиелита и японского энцефалита. Касательно HZ предполагают, что более безопасную вакцину для индивидуумов с ослабленным иммунитетом можно получать путем инактивации нагреванием VZV или применением субъединичной вакцины (Cohen J.I., (2008) J. Infect. Dis. 197(Suppl 2): S237-S241). У Redman et al (J. Infectious Diseases (1997) 176: 578-85) описана инактивированная вакцина против VZV, которую инактивировали нагреванием при 50°C, что приводило к содержанию вирусов ≤ 1,2 БОЕ/0,5 мл. Такой уровень инфекционности не желателен для продукта, который необходимо вводить пациентам с иммунной недостаточностью. В патентах США 6214354 и 5997880 также упоминается возможное использование инактивированной вакцины против VZV, и описан пример получения и тестирования термически обработанной вакцины.

В медицине был бы существенно востребован способ инактивации VZV, в результате которого получат образец VZV, который являлся бы безопасным и эффективным для пациентов с иммунной недостаточностью, т.е. не обладал бы остаточной инфекционностью, но сохранял бы иммуногенность и антигенность неинактивированного образца.

Сущность изобретения

В настоящем описании показано, что образец VZV можно инактивировать гамма-облучением таким образом, что инфекционность образца находится на неопределяемом уровне, однако это не приводит к существенной потере в иммуногенности и/или антигенности и к значительным изменениям в структуре VZV после инактивации способами, описываемыми в настоящем описании, относительно не подвергнутого инактивации образца VZV.

В одном из аспектов изобретение относится к инактивированному вирусу ветряной оспы (VZV), где инфекционность VZV не обнаруживается и где при введении пациенту инактивированный VZV вызывает иммунный ответ к VZV. Изобретение также относится к фармацевтической композиции/вакцине, содержащей терапевтически эффективное количество инактивированного VZV и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции по изобретению находятся в жидком или замороженном состоянии, например, лиофилизированном. В некоторых вариантах осуществления композиций, описываемых в настоящем описании, VZV инактивирован гамма-облучением.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения инактивированной вакцины против VZV, где способ включает гамма-облучение содержащего VZV образца с применением от приблизительно 5 кГр до приблизительно 50 кГр гамма-облучения. В предпочтительных вариантах осуществления источник гамма-облучения представляет собой ⁶⁰Co, хотя другие известные в данной области изотопы также могут быть пригодными в этом отношении. В некоторых вариантах осуществления описываемого в настоящем описании способа получения образец до облучения лиофилизируют. В альтернативных вариантах осуществления нефасованный жидкий препарат подвергают гамма-облучению без предварительной лиофилизации.

Изобретение также относится к способу лечения или иммунизации против HZ или другого заболевания, ассоциированного с реактивацией VZV, где способ включает введение индивидууму вакцины или фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество инактивированного VZV и фармацевтически приемлемый носитель, где VZV инактивирован гамма-облучением. В некоторых вариантах осуществления способов лечения, описываемых в настоящем описании, способ введения композиции/вакцины является подкожным или внутримышечным. В конкретных вариантах осуществления такого аспекта изобретения возраст пациента составляет 50 лет или более, и/или пациент страдает иммунной недостаточностью.

На всем протяжении описания и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если из контекста явно не следует иное.

На всем протяжении описания и в прилагаемой формуле изобретения используют следующие ниже определения и сокращения:

Термин "лечение" относится к терапевтическому лечению и профилактическим или превентивным мерам. К нуждающимся в лечении индивидуумам относятся индивидуумы уже с нарушением, а также склонные к нарушению индивидуумы или индивидуумы, у которых нарушение необходимо предотвратить. Лечение пациента инактивированным VZV по изобретению включает одно или несколько из перечисленного ниже: индуцирование/усиление иммунного ответа у пациента против VZV, предотвращение, улучшение состояния, устранение или снижение вероятности реактивации VZV у пациентов, инфицированных ветряной оспой или получавших живую вакцину против VZV, предотвращение или снижение вероятности развития HZ и/или другого заболевания, или осложнения, ассоциированного с реактивацией VZV, такого как PHN, уменьшение тяжести или продолжительности HZ и/или другого заболевания, или осложнения, ассоциированного с реактивацией VZV, такого как PHN.

Термин "терапевтически эффективное количество" означает достаточную вакцинную композицию для оказания желаемого действия, включая, но, не ограничиваясь ими, индуцирование/усиление иммунного ответа у пациента против VZV, предотвращение, улучшение состояния или устранение реактивации VZV у пациентов, инфицированных ветряной оспой или получавших живую вакцину против VZV, предотвращение HZ и/или PHN, уменьшение тяжести или продолжительности HZ и/или PHN. Специалист в данной области понимает, что этот уровень может изменяться.

Термин "иммунный ответ" относится к клеточному (T-клетка) иммунному ответу и/или к образованию антител (B-клетка).

Термин "пациент" относится к любому человеческому существу, которое должно получать инактивированные вакцины против VZV или фармацевтические композиции, описываемые в настоящем описании, включая иммунокомпетентных индивидуумов и индивидуумов с иммунной недостаточностью. Как определено в настоящем описании, "пациент" включает уже инфицированных VZV пациентов путем естественной инфекции или вакцинации.

Термин "нефасованный" относится к жидкому составу или композиции, содержащей более одной дозы вакцины.

Термин "неопределяемые уровни" по отношению к инфекционности конкретного вакцинного состава или композиции означает, что состав или композиция содержит ≤0,050 инфекционных доз или бляшкообразующих единиц ("БОЕ") вируса инфекционной VZV на мл образца, предпочтительно ≤0,040 БОЕ/мл, ≤0,030 БОЕ/мл, ≤0,020 БОЕ/мл, ≤0,015 БОЕ/мл, ≤0,010 БОЕ/мл, ≤0,009 БОЕ/мл или ≤0,008 БОЕ/мл, более предпочтительно ≤0,007 БОЕ/мл, ≤0,006 БОЕ/мл, ≤0,005 БОЕ/мл, ≤0,004 БОЕ/мл ≤0,003 БОЕ/мл, более предпочтительно ≤0,002 БОЕ/мл или ≤0,001 БОЕ/мл. БОЕ конкретного образца можно определять с применением, например, анализа образования бляшек ветряной оспы, такого как анализ, описанный в примере 1, а также описанный у Krah et al. (J. Virol. Methods (1990) 27: 319-26). Инфекционность образца также можно подтверждать способом иммуноокрашивания, как описано в примере 1.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 представлена кинетика инактивации γ-облученного лиофилизированного VZV (log БОЕ/мл в сравнении с дозой облучения, см. пример 4). Флаконы с VZV облучали при различных уровнях ⁶⁰Co-излучения с использованием ⁶⁰Co-облучателя Gammacell®. Остаточные БОЕ/мл каждого флакона на дозу облучения (Гр) определяли с использованием анализа образования бляшек ветряной оспы на клетках MRC-5. Наблюдаемые экспериментальные значения показаны в виде темноокрашенных ромбиков ("наблюдения"), и максимальные значения, определенные анализом, показаны в виде серых ромбиков ("<= значение").

На фигуре 2 представлена кинетика инактивации γ-облученного нефасованного препарата VZV (титр log БОЕ/мл по отношению к времени облучения, см. пример 4). Для облучения нефасованного препарата VZV использовали различные уровни ⁶⁰Co-излучения. Облученный нефасованный препарат анализировали на остаточную инфекционность анализом образования бляшек ветряной оспы с использованием клеток MRC-5.

На фигурах 3A-3F представлен ответ VZV (SFC/10⁶ PBMC) после инактивации VZV при различных условиях, как определено анализом ELISPOT на IFNγ VZV (см. пример 5). Представлены данные для 6 образцов донорских PBMC (фигуры A-F) для пяти термически обработанных нефасованных препаратов VZV и двух гамма-облученных нефасованных препаратов VZV. Также показаны ответы VZV пяти (необработанных) образцов VZV из нефасованных препаратов, которые использовали выше, и серию VZV, которую инактивировали обработкой УФ-излучением (VZV серия №96,07).

На фигурах 4A-4C представлены изображения вирусных частиц VZV, как определено посредством крио-ПЭМ (см. пример 6). Показаны необработанные лиофилизированные образцы (фигура 4A), облученные 25 кГр (фигура 4B) и облученные 50 кГр (фигура 4C).

На фигуре 5 представлены результаты исследования иммуногенности мышей, в котором титр VZV (ответ IgG) для набора инактивированных препаратов VZV, полученных различными способами инактивации (см. пример 8), оценивали анализом ELISA в отношении VZV. Рассчитанные титры VZV (титр VZV минус титр MRC-5) представлены для каждой мыши вместе со средним геометрическим титра. Также представлены результаты 2 мышей из термически обработанной лиофилизированной группы, которые были расценены как выпадающие наблюдения.

На фигуре 6 представлен статистический анализ gpELISA образования антител к VZV в различные моменты времени у реципиентов вакцины, являющихся людьми, которые получали термически обработанную вакцину против VZV (N=65) или гамма-облученную вакцину против VZV (N=63), как описано в примере 9.

На фигуре 7 представлен статистический анализ gpELISA образования антител к VZV в различные моменты времени у реципиентов вакцины, являющихся людьми, которые получали гамма-облученную вакцину B против VZV (16-25 кГр, N=64) или гамма-облученную вакцину C (25-50 кГр, N=65), как описано в примере 10.

Подробное описание изобретения

В настоящем описании показано, что нефасованный или лиофилизированный образец VZV может быть инактивирован гамма-облучением таким образом, что инфекционность VZV в образце находится на неопределяемом уровне (например, инфекционность инактивированных образцов VZV, описываемых в настоящем описании, составляла ≤0,001 БОЕ/мл). Инактивированный VZV, получаемый описываемыми в настоящем описании способами, можно составлять совместно с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции или вакцины для применения в способах лечения/иммунизации по изобретению. Не обнаружено существенной потери в иммуногенности и/или антигенности, и существенных изменений в структуре VZV после инактивации описываемыми в настоящем описании способами относительно неинактивированного образца VZV. Таким образом, когда пациентам вводят фармацевтические композиции по изобретению, вызванный композицией иммунный ответ существенно не отличается от иммунного ответа, вызванного контрольным образцом, содержащим аналогичное количество неинактивированного VZV. Как используют в настоящем описании, иммунный ответ, вызванный инактивированным образцом, который "существенно не отличается" от неинактивированного контрольного образца приблизительно на 50% или менее, более предпочтительно приблизительно на 40% или менее, приблизительно на 30% или менее, даже более предпочтительно приблизительно на 20% или менее, 15% или менее, 10% или менее или 5% или менее.

Иммунный ответ, вызванный инактивированным и контрольным образцами, можно определять на подходящей модели на животных или популяции людей в клиническом испытании, например, измеряя один или несколько следующих параметров: (1) частоту встречаемости специфичных к VZV иммунореактивных клеток (как, описано у Calandra et al., в патенте WO 94/002596), (2) цитотоксические T-клетки против VZV (CTL) или специфичные к VZV клетки CD8⁺, (3) Т-хелперы против VZV или специфичные к VZV клетки CD4⁺, (4) уровень специфических антител к VZV или (5) уровень лимфокинов, таких как интерферон или интерлейкин.

Способы, пригодные для определения иммунного ответа, известны в данной области и включают, но, не ограничиваются ими, анализ T-клеточной иммунной реакции, анализ активности, анализ ELISPOT IFNγ VZV и анализ ELISA.

Для определения достаточности иммунного ответа, вызываемого вакцинами/фармацевтическими композициями по настоящему изобретению и вызванного описываемыми в настоящем описании способами, а также эффективности инактивированной вакцины пригодным может оказаться определение клинических исходов в клиническом испытании на добровольцах/индивидуумах, являющихся людьми, для определения, например, уменьшения продолжительности или тяжести HZ и/или уменьшение продолжительности PHN у индивидуума в течение периода менее одного месяца после возникновения опоясывающего лишая, снижение частоты возникновения опоясывающего лишая в популяции пациентов на статистическом уровне ниже частоты возникновения, обнаруженной в общей популяции, или у аналогично находящихся в группе риска или у индивидуумов с иммунной недостаточностью.

Как указано выше, в настоящем изобретении показано, что препараты VZV можно инактивировать до неопределяемых уровней, в то же время все еще сохраняющих антигенность и иммуногенность, аналогичную неинактивированному VZV. Таким образом, один из аспектов изобретения относится к инактивированному VZV, где инфекционность VZV не обнаруживается, и где при введении пациенту инактивированный VZV вызывает иммунный ответ против VZV.

Специалист в данной области может легко определить подходящее количество антигена VZV для применения в качестве терапевтически эффективного количества VZV. Такое количество варьирует в зависимости от назначаемого применения или других факторов, таких как конкретная популяция пациентов. В некоторых вариантах осуществления описываемых в настоящем описании способов и композиций количество VZV составляет от приблизительно 1 приблизительно 10 до антигенных единиц VZV/доза, где 1 антигенная единица VZV приблизительно равна 1 мкг очищенного белка VZV. В конкретных вариантах осуществления количество содержащегося в композиции антигена VZV составляет от приблизительно 2 до приблизительно 8 антигенных единиц VZV/доза или от приблизительно 3 до приблизительно 6 антигенных единиц VZV/доза. Количество антигена можно определять подходящим антигенным анализом, например, конкурентным ELISA, описанным в настоящем описании в примере 2. Специалист в данной области может определить другие подходящие анализы для измерения количества антигена в образце.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество описанного выше инактивированного VZV и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или разбавитель. Пригодные для использования в композициях по изобретению фармацевтически приемлемые носители включают любое совместимое средство, которое не является токсичным для пациентов в используемых дозах и концентрациях, такое как вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол, буферы и т.п., и их сочетания. Носитель также может содержать дополнительные компоненты, такие как стабилизатор, солюбилизатор, модификатор тоничности, такой как NaCl, MgCl₂ или CaCl₂ и т.д., поверхностно-активное вещество и их смеси.

Изобретение также относится к многодозовым композициям, содержащим более одной дозы инактивированного VZV, противомикробного консерванта, который предотвращает случайное микробное загрязнение при введении шприца во флакон, содержащий композицию и фармацевтически приемлемый носитель. Такие многодозовые композиции можно вводить пациентам более одного раза после того, как пройдет определенное количество времени, или более чем одному пациенту.

В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой жидкий нефасованный препарат, содержащий более одной дозы инактивированного VZV. В альтернативных вариантах осуществления композиция является лиофилизированной. Способы лиофилизации известны в данной области. Изобретение также относится к лиофилизированному составу, который разбавляют подходящим разбавителем, таким как стерильная вода для инъекций или бактериостатическая вода для инъекций.

Гамма-облучение широко используется для стерилизации устройств и оборудования для медицинского применения. Его также используют для уничтожения любых потенциальных патогенов в биологических препаратах, таких как препараты крови и препараты антител. Для этих целей организм инактивирован без учета сохранения функций организма. Существует ограниченное количество литературных источников, в которых описана инактивация вирусов гамма-облучением.

Rosen et al. (Int. J. Radiat. Biol. 52:795-804 (1987)) оценивали интактные вирусные частицы вируса простого герпеса на сохранение способности бляшкообразования и очищенные геномы на повреждение молекул ДНК после обработки ⁶⁰Co-излучением. В исследовании не оценивали антигенность или иммуногенность вируса после облучения. В другом исследовании Elliott et al. (J. Clin. Micobiol. 16: 704-708 (1982)) оценивали инактивацию вирусов Ласса, Марбурга и Эбола с использованием ⁶⁰Co-излучения. Для вирусов Ласса, Эбола и Марбурга наблюдали линейную кинетику инактивации, и инактивацию вируса проводили гамма-облучением с применением ⁶⁰Co-излучения. Elliott et al. наблюдали, что для инактивации вируса в замороженном состоянии требовалась более высокая доза, по сравнению с жидким состоянием. Подобно исследованию Rosen et al., в этом исследовании не удалось определить антигенность или иммуногенность вирусов после гамма-облучения. Alsharifi et al. (WO 2010/012045) описывают гамма-облучение для инактивации вируса гриппа, РНК-содержащего вируса семейства Orthomyxoviridae, для применения в качестве вакцины.

В описываемом в настоящем описании изобретении показано, что гамма-облучение может уменьшать инфекционность вирусного препарата VZV до неопределяемых уровней при сохранении антигенности, иммуногенности и структурных характеристик неинактивированного контроля. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения VZV инактивирован гамма-облучением, которому можно подвергать VZV посредством экспонирования подходящим изотопом, таким как ⁶⁰Co, ¹³⁷цезий, ⁹⁹технеций или ^99mTc. В предпочтительных вариантах осуществления VZV подвергают гамма-облучению посредством экспонирования ⁶⁰Co-излучением.

Количество гамма-облучения, пригодного для инактивации VZV, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 50 кило грей (кГр) гамма-облучения. Грей (Гр) представляет собой стандартную единицу поглощенной дозы, где один грей равен поглощенной дозе 1 Джоуль/килограмм (100 рад). Специалисту в данной области будет понятно, что количество облучения, которому подвергают образец, и количество времени следует варьировать для получения желаемой поглощенной дозы облучения (доза = плотность потока × время). Специалист в данной области также сможет изменять количество облучения, которому подвергается образец, в зависимости от размера контейнера, в который помещен образец таким образом, что обеспечивают точную дозу облучения всему образцу без избыточного экспонирования части образца, например, наиболее близкой к радиоактивному источнику части.

В некоторых вариантах осуществления способов и композиций по изобретению, описываемых в настоящем описании, количество гамма-облучения, применяемое для инактивации VZV, составляет приблизительно 25 кГр или менее. В альтернативных вариантах осуществления количество гамма-облучения находится в диапазоне от приблизительно 5 кГр до приблизительно 40 кГр, от приблизительно 5 кГр до приблизительно 35 кГр, от приблизительно 5 кГр до приблизительно 30 кГр, от приблизительно 5 кГр до приблизительно 25 кГр, от приблизительно 5 кГр до приблизительно 20 кГр, от приблизительно 5 кГр до приблизительно 10 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 50 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 40 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 35 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 30 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 25 кГр, от приблизительно 10 кГр до приблизительно 20 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 50 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 40 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 35 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 30 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 25 кГр, от приблизительно 15 кГр до приблизительно 20 кГр.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, как описано выше, и способам получения указанной композиции, где композиция представляет собой жидкий нефасованный препарат, и количество гамма-облучения, применяемое для инактивации VZV, составляет от приблизительно 5 кГр до приблизительно 10 кГр или от приблизительно 5 кГр до приблизительно 12,5 кГр. В других конкретных вариантах осуществления композицию подвергают лиофилизации до гамма-облучения, и в таком варианте осуществления количество гамма-облучения составляет от приблизительно 5 кГр до приблизительно 25 кГр или от приблизительно 15 кГр до приблизительно 25 кГр.

В настоящем описании показано, что наблюдали линейную кинетику инактивации для VZV, инактивированного гамма-облучением, которое представляет собой существенное преимущество при проведении моделирования инактивации, т.е. достоверной оценки уровня остаточной инфекционности образца, содержащего инактивированный VZV. Такую линейную кинетику инактивации не наблюдали для термически обработанного инактивированного VZV. Grieb et al. (Biologicals (2002) 30:207-216 and Biomaterials (2005) 26:2033-2042) описали два специфических механизма инактивации вирусов гамма-облучением, которое способствует линейной кинетике инактивации, наблюдаемой для VZV. Первый механизм является "непосредственным результатом поглощенной энергии фотона целью". Такой прямой перенос энергии приводит к "перемещению электронов внешней оболочки молекулы и разрыву ковалентных связей". Второй, "опосредованный", механизм является результатом химического воздействия на свободные радикалы и активные формы кислорода, как правило, генерируемых при взаимодействии излучения с молекулами воды и кислородом. В конкретных вариантах осуществления композиций и способов, описываемых в настоящем описании, VZV подвергают лиофилизации до инактивации гамма-облучением, таким образом, маловероятно многочисленное взаимодействие с молекулами воды, т.к. воду удаляют из продукта при лиофилизации.

Redman et al. (J. Infectious Diseases (1997) 176: 578-85) описывают инактивированную вакцину против VZV, которую инактивировали нагреванием до 50°C, что приводило к содержанию инфекционного вируса ≤ 1,2 БОЕ/0,5 мл. Показано, что термически обработанная вакцина, описанная Redman и соавторами, уменьшает тяжесть заболевания, ассоциированного с реактивацией VZV у 24 пациентов, ожидающих аутологическую BMT, или инъекцию стволовых клеток периферической крови, или другую BMT. Такой уровень инфекционности не подходит для всех пациентов, таких как пациенты с ослабленным иммунитетом. Кроме того, для способов инактивации VZV с применением термической обработки необходимы длительные периоды времени для получения низких уровней инфекционности, которая является неэффективной и экономически нецелесообразной.

Наконец, изобретение относится к инактивированному VZV и фармацевтическим композициям/вакцинам, содержащим указанный инактивированный VZV, где инфекционность VZV находится на неопределяемом уровне, т.е. ≤0,050 БОЕ/мл, где указанные композиции инактивированного VZV являются более безопасными, чем описанные ранее вакцины для лечения и/или профилактики HZ или заболевания, ассоциированного с реактивацией VZV, и подходят для более эффективного способа получения. Инактивированные VZV по настоящему изобретению сохраняют структурные физические характеристики, иммуногенность и антигенность неинактивированного контроля VZV после инактивации. В некоторых вариантах осуществления инфекционность составляет ≤0,040 БОЕ/мл, ≤0,030 БОЕ/мл или ≤0,020 БОЕ/мл. Изобретение также относится к вариантам осуществления, где величина инфекционных доз составляет ≤0,015 БОЕ/мл, ≤0,010 БОЕ/мл, ≤0,009 БОЕ/мл или ≤0,008 БОЕ/мл. В альтернативных вариантах осуществления инфекционность VZV составляет ≤0,007 БОЕ/мл, ≤0,006 БОЕ/мл, ≤0,005 БОЕ/мл, ≤0,004 БОЕ/мл или ≤0,003 БОЕ/мл. В дополнительных альтернативных вариантах осуществления инфекционность составляет ≤0,002 БОЕ/мл или ≤0,001 БОЕ/мл.

В некоторых вариантах осуществления композиций и способов, описываемых в настоящем описании, инфекционность (БОЕ) образца определяют с использованием анализа образования бляшек ветряной оспы, такого как анализ, описанный в примере 1, а также описанный у Krah et al. (J. Virol. Methods (1990) 27: 319-26). Специалисту в данной области будет понятно, что другие способы также пригодны для определения инфекционности образца VZV или композиции VZV, и их можно использовать вместо анализа образования бляшек ветряной оспы.

В композициях и способах, описываемых в настоящем описании, можно использовать любой штамм VZV, в том числе штамм ветряной оспы дикого типа или аттенуированный штамм, такой как штамм Ока, как описанный в патенте США 3985615 и доступный от American Type Culture Collection (номер доступа VR-795™, ATCC, Manassas, VA). Штамм Ока изначально был получен от здорового мальчика с инфекцией обычной ветряной оспы и пересеян на эмбриональные клетки легких человека. Его адаптировали для выращивания на клеточных культурах эмбриональных клеток морской свинки и клеточных культурах диплоидных фибробластов легких человека (например, клетках MRC-5). В предпочтительных вариантах композиций и способов, описываемых в настоящем описании, VZV представляет собой штамм Ока или производное штамма Ока, такое как штамм VZV Ока/Мерк. Как используют в настоящем описании, "производное штамма Ока" представляет собой штамм, полученный способом дополнительного пересевания штамма Ока на подходящий тип клеток для достаточной аттенуации штамма таким образом, чтобы он являлся пригодным, например, в качестве живой аттенуированной вакцины. В описываемых в настоящем описании способах и композициях по изобретению живой или аттенуированный VZV, такой как штамм Ока или его производное, инактивируют гамма-облучением до введения пациенту.

Настоящее изобретение также относится к способу получения инактивированного VZV, включающему гамма-облучение образца, содержащего VZV, с применением от приблизительно 5 до приблизительно 50 кГр гамма-облучения. В предпочтительных вариантах осуществления такого аспекта изобретения образец подвергают гамма-облучению посредством экспонирования образца ⁶⁰Co-излучением. В конкретных вариантах осуществления такого аспекта изобретения количество гамма-облучения является таким, как описано выше.

Изобретение также относится к инактивированному VZV, полученному или получаемому способами, описываемыми в настоящем описании. Дополнительно изобретение относится к вакцине, содержащей терапевтически эффективное количество инактивированного VZV, полученного описываемыми в настоящем описании способами, и фармацевтически приемлемый носитель.

В одном из аспектов изобретение также относится к способу лечения, профилактики, иммунизации против или снижения вероятности возникновения опоясывающего лишая и/или другого заболевания или осложнения, ассоциированного с реактивацией VZV, например, постгерпетической невралгии, у пациента, где способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества вакцины или фармацевтической композиции, содержащей инактивированный VZV и фармацевтически приемлемый носитель, где VZV инактивирован гамма-облучением. Ввиду того, что реактивация VZV коррелирует со снижением клеточного иммунитета, способы лечения в настоящем описании пригодны для усиления клеточного иммунного ответа у пациента, который был предварительно экспонирован ветряной оспой путем естественной инфекции или вакцинации, но у которого снизился иммунный ответ вследствие возраста и/или дисфункции иммунной системы.

В описанных выше способах лечения/иммунизации фармацевтическую композицию, содержащую инактивированный VZV, можно вводить пациенту любым подходящим способом, включая, но, не ограничиваясь ими, подкожную инъекцию, внутрикожное введение, вдавливание через кожу или другие способы введения, такие как внутривенная, внутримышечная или ингаляционная доставка. В предпочтительных вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем описании, способ введения представляет собой подкожный или внутримышечный.

Описанные выше способы и композиции пригодны для предотвращения HZ и/или PHN или уменьшения их тяжести или продолжительности в популяциях иммунокомпетентных пациентов и пациентов с иммунной недостаточностью, включая, но, не ограничиваясь ими, здоровых пациентов и пациентов с иммунной недостаточностью, которые перенесли трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток (HCT) или трансплантацию целого органа (SOT), ВИЧ-инфицированных пациентов, пациентов с аутоиммунными заболеваниями, индивидуумов со злокачественными новообразованиями крови, индивидуумов, получающих химиотерапию в отношении широкого диапазона солидных опухолевых злокачественных новообразований, пациентов, получающих длительную иммуносупрессивную терапию в отношении широкого диапазона состояний, включая ревматоидный артрит (RA), системную красную волчанку (SLE), болезнь Крона, псориаз и рассеянный склероз. В некоторых вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем описании, инактивированную вакцину против VZV вводят пациенту с повышенным риском HZ вследствие заболевания, например, указанных выше заболеваний, или лечения заболевания (такого как гематологические злокачественные новообразования, солидные опухолевые злокачественные новообразования или химиотерапия, аутоиммунные заболевания).

В некоторых вариантах осуществления любого из описанных выше способов и композиций возраст пациента составляет 50 лет или старше, и пациент может быть здоровым или с иммунной недостаточностью. В других вариантах осуществления возраст пациента составляет 55 лет или старше, 60 лет или старше, 65 лет или старше, 70 лет или старше или 75 лет или старше. В альтернативных вариантах осуществления возраст пациента составляет от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет или от приблизительно 65 до 70 лет.

В дополнительных вариантах осуществления способов, описываемых в настоящем описании, вакцину или фармацевтическую композицию вводят совместно с другими общепринятыми "стандартными терапиями" или с другими вакцинами для целевых популяций пациентов, включая, например, пневмококковую вакцину, такую как PNEUMOVAX™ 23 (PN23, Merck & Co., Inc.), вакцину против гепатита B (HBV), такую как RECOMBIVAX™ HB или ENGERIX-B™ (GlaxoSmithKline Biologicals), и вакцины против гриппа.

В частных вариантах осуществления способов лечения/предотвращения, описываемых в настоящем описании, способ дополнительно включает обеспечение прохождения соответствующего определенного количества времени и введение пациенту одной или более дополнительных доз фармацевтической композиции. В указанных вариантах осуществления одну дополнительную дозу можно вводить пациенту после того, как прошло соответствующее количество времени, альтернативно, можно вводить две, три или четыре дополнительные дозы после того, как прошло соответствующее количество времени. В иллюстративном варианте осуществления пациенту вводят 3 или 4 дозы в рамках режима дозирования, который соответствующим образом разделен в течение всего периода времени. Специалисту в данной области будет понятно, что количество времени между дозами может варьировать в зависимости от популяции пациентов, дозирования вакцины и/или соблюдения пациентом схемы лечения. В иллюстративном варианте осуществления допускают прохождение периода времени приблизительно 3 недели, приблизительно 1 месяц, приблизительно 6 недель, приблизительно 2 месяца или приблизительно 3 месяца или более между введениями каждой дозы пациенту. В одном конкретном варианте осуществления вакцину вводят пациенту, которому предстоит трансплантация, до трансплантации, например, за 3 недели, 1 месяц или 2 месяца до трансплантации, и пациенту вводят дополнительные одну или более доз в соответствующие периоды времени после трансплантации, например, через 3 недели, 1 месяц или 2 месяца после трансплантации после прохождения определенного количества времени между введением каждой дозы.

Все публикации, указанные в настоящем описании, включены посредством ссылки с целью иллюстрации и описания способов и веществ, которые можно использовать применительно к настоящему изобретению. Ничто в настоящем описании не следует истолковывать как допущение того, что изобретение не наделено правом предшествовать такому раскрытию на основании предшествующего изобретения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения с ссылками на прилагаемые чертежи следует понимать как то, что изобретение не ограничено этими конкретными вариантами осуществления, и что специалист в данной области может проводить различные изменения и модификации в нем, не выходя за рамки объема или сущности изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Следующие ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

ВЕЩЕСТВА И СПОСОБЫ

ПРИМЕР 1

Анализ образования бляшек ветряной оспы

Титры инфекционности препаратов вируса ветряной оспы (VZV) определяли с использованием жидкого двухфазного способа, описанного Krah et al. (J. Virol. Methods (1990) 27: 319-326). Анализ проводили следующим образом: клетки MRC-5 (диплоидные фибробласты легких человека) высевали на 60 мм планшетах для культивирования тканей при 600000 клеток в 5 мл объема BME (минимальная среда Игла со сбалансированным солевым раствором Хенкса) с 100 мг/л галактозы, 50 мкг/мл неомицина, 2 мМ L-глутамата и инкубировали при 35±1°C в 5%±1% CO₂ инкубаторе. После инкубации в течение 24-56 часов клетки достигали 50-80% конфлюентности, и их использовали для анализа образования бляшек. Среду для выращивания клеток удаляли аспирацией, и клетки инфицировали 100 мкл аликвотами раствора VZV, разбавленного в соответствующем разбавителе, таком как стабилизатор PGS (PBS с сахарозой и гидролизованным желатином).

Вирусу давали распространиться в течение ≥1 часа при 35±1°C в 5%±1% CO₂ инкубаторе. Затем культуры покрывали 5 мл объема поддерживающей среды (минимальная поддерживающая среда с солями Игла (MEM), 2% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 50 мкг/мл неомицина и 2 мМ L-глутамата) и снова оставляли инкубироваться при 35±1°C в 5% ± 1% CO₂ инкубаторе в течение 6-7 суток для образования бляшек. Затем среду из плашек аспирировали и визуализировали бляшки посредством окрашивания клеток 0,2% (масс./об.) раствором Кумасси синего R-250 в этаноле, 1% уксусной кислотой. Количество бляшек представляло собой среднее 3-5 повторений, и его умножали на коэффициент разбавления (обратную величину соответствующего разбавления тестируемых вирусов) и на объемный корректирующий фактор инокулята (10 при доведении от 0,1 мл до 1 мл) для получения бляшкообразующих единиц/мл (БОЕ/мл).

Учитывая особо важную необходимость в обеспечении отсутствия ложно-положительных результатов БОЕ для инактивированных образцов (в которых могли появляться бляшкообразные пятна в монослое клеток, используемых для анализа образования бляшек вследствие случайного царапания монослоя или вследствие наличия скопления клеток), разрабатывали способ иммуноокрашивания и применяли для подтверждения того, что очаги, подсчитанные как бляшки, фактически являлись очагами инфицированных VZV клеток (бляшки VZV). В кратком изложении, окрашивание Кумасси синим в стандартном анализе образования бляшек следующее, культуры с видимыми бляшками инкубировали с поликлональной сывороткой против VZV, разбавленной в PBS, 0,05% Tween 20, и инкубировали в течение 1 часа при 35°C. Клетки отмывали PBS, 0,05% Tween 20 для удаления несвязавшегося антитела, и детектировали связавшееся антитело с использованием конъюгированного с пероксидазой антитела козы к IgG человека и субстрата пероксидазы (раствора диаминобензидина), которой образовывал осадок при реакции с пероксидазой. Коричневый осадок образовывался вокруг очагов, содержащих VZV, и дополнительных бляшек, кроме тех, что обнаруживали при окрашивании Кумасси синим, не детектировали. Таким образом, такой способ иммуноокрашивания с использованием комбинации первичной сыворотки против VZV, конъюгированного с пероксидазой антитела к первичному соединению, и субстрата пероксидазы обеспечивает способ, подтверждающий, является ли фактически предполагаемая бляшка в инактивированном образце остаточным инфекционным VZV.

ПРИМЕР 2

Анализы конкурентного ELISA антигена VZV и неконкурентного ELISA антигена VZV

Для характеристики и количественного определения антигена VZV использовали два формата антигенного анализа. В выбранных исследованиях использовали конкурентный ELISA антигена, в котором воспроизводят тест, используемый для оценки антигена VZV в коммерческом продукте VZV, и применяют одну поликлональную сыворотку для детекции антигена VZV. Для получения дополнительной характеристики реактивности антигена VZV после гамма-облучения или других инактивирующих обработок разработали и применяли неконкурентный ELISA, где тестируемый образец непосредственно адсорбировался на планшетах для микротитрования ELISA, а затем его детектировали с использованием моноклональных или поликлональных антител.

Конкурентный ELISA для количественного определения антигена VZV

В кратком изложении этот анализ проводили посредством инкубации антигена VZV из тестируемых образцов с фиксированным количеством поликлональной сыворотки против VZV в растворе. Остававшееся свободное антитело (не связавшееся с антигеном) оставляли для связывания со стандартным антигеном VZV, иммобилизованным на планшетах для микротитрования ELISA. Количество антитела, способного связываться с планшетами, обратно пропорционально количеству антигена в тестируемом образце. Связывание антител с планшетами количественно определяли по реакции со связанным с ферментом античеловеческим антителом и соответствующим субстратом с получением окрашенного продукта, который количественно определяли спектрофотометрически.

Способ тестирования включал следующие стадии: (1) Планшеты ELISA покрывали гликопротеинами (gp) от инфицированных VZV или неинфицированных клеток MRC-5, а затем покрывали 1% (масс./об.) бычьим сывороточным альбумином для уменьшения адсорбции неспецифических антител на планшетах. (2) Тестируемые антигены VZV разбавляли стабилизатором PGS в полипропиленовых микропробирках. Антигенный препарат VZV известного антигенного титра включали в качестве контроля. Образцы, как правило, серийно разбавляли 1:1,25 разбавлений для получения концентраций антигена в диапазоне от 2,6 до 0,9 антигенных единиц/мл. Для построения калибровочной кривой для определения антигена в тестируемых образцах использовали серии разведений стандарта VZV. (3) Сыворотку человека против VZV разбавляли в стабилизаторе PGS до двукратного желаемого конечного разбавления. (4) Объемы по триста мкл разбавленного антигена разливали в полипропиленовые микропробирки, смешивали с 300 мкл разбавленной сыворотки против VZV и инкубировали при 35-37°C в течение 15-30 минут. В качестве контроля использовали сыворотку против VZV плюс разбавитель (не антиген). (5) Аликвоты по 100 мкл из каждой смеси сыворотка-антиген (и контроля) добавляли к 2 повторениям лунок, покрытых гликопротеинами VZV, и к 2 лункам, покрытым гликопротеинами MRC-5. (6) Планшеты инкубировали в течение 15-30 мин при 35-37°C для обеспечения связывания свободного антитела (не образовавшего комплекс с тестируемым антигеном в растворе) с гликопротеинами антигена, иммобилизованного на планшетах. (7) Несвязавшееся антитело удаляли промыванием и добавляли в лунки раствор конъюгированного с щелочной фосфатазой антитела козы к IgG человека для детекции связавшегося антитела человека. (8) После инкубации в течение 15-30 минут при 35-37°C несвязавшийся конъюгат удаляли промыванием. Связавшийся конъюгат детектировали посредством инкубации в течение 10-15 мин при 35-37°C с п-нитрофенилфосфатным субстратом. (9) После остановки реакции субстрата добавлением 50 мкл 3M NaOH количественно определяли проявление окраски (OD при 405 нм) с использованием микропланшетного спектрофотометра.

Расчеты и интерпретация тестов включала следующие стадии: (1) Соответствующие повторные значения OD для повторных лунок, покрытых гликопротеинами VZV и MRC-5, усредняли. Опытным путем установлено, что OD MRC-5 различных образцов и разбавлений совпадает. Таким образом, значения OD гликопротеинов MRC-5 для всей тестируемой серии, как правило, усредняли и использовали для коррекции неспецифического связывания первого антитела (сыворотки против VZV). Усредненные OD гликопротеинов MRV-5 вычитали из соответствующих усредненных OD гликопротеинов VZV для получения специфических значений (ΔOD) VZV. (2) Построение калибровочной кривой для определения количеств антигенов: строили график калибровочной кривой как зависимость значений ΔOD от известных концентраций антигена (антигенные единицы VZV/мл). Данные вводили в соответствующую графическую программу, определяли линейный участок кривой и получали "формулу линейного соответствия" (y=a+bx) для этой линейной кривой. (3) Расчеты количеств антигена тестируемых образцов: поскольку значения a и b заданы формулой линейного соответствия, и y (ΔOD) известно, неизвестное значение x, представляющее собой антиген единицы/мл, можно, таким образом, рассчитать и скорректировать в соответствии с разбавлением образца для получения концентрация антигена исходного (неразбавленного) тестируемого образца. Описанная концентрация антигена представляет собой концентрацию, полученную с наименее разбавленным образцом, обеспечивающим значение ΔOD на линейном участке калибровочной кривой.

ELISA детекция связывания антигена VZV

В кратком изложении данный анализ проводили посредством инкубирования разбавлений антигена VZV из тестируемых образцов в 96-луночных планшетах для микротитрования для иммобилизации антигена с последующей детекцией антигена, связавшегося с моноклональными или поликлональными антителами к VZV. Связавшиеся антитела к VZV количественно определяли реакцией со связанным с ферментом антителом к соответствующему соединению и соответствующему субстрату с получением окрашенного продукта, который количественно определяли спектрофотометрически. Затем сравнивали кривые титрований OD по отношению к разбавлению образцов (количественно определяли как разницу степени разбавления кривых титрований ("сдвиг кривой").

Способ тестирования включал следующие стадии: (1) Планшеты ELISA с высоким связыванием покрывали 200 мкл антигена (вакцины), разбавленного PBS 1:20 из 1:2560 в серийных 2-кратных разбавлениях. Планшеты закрывали и хранили при 2-8°C в течение ночи. (2) Жидкость со стадии № 1 выливали и ополаскивали планшеты 3 раза PBS+0,05% Tween 20. Удаляли последнее ополаскивание и добавляли разбавленное антитело (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 35°C. (3) Жидкость со стадии № 2 выливали и ополаскивали планшеты 3 раза PBS+0,05% Tween 20. Последнее ополаскивание удаляли и добавляли разбавленный конъюгат (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 35°C. (4) Жидкость со стадии № 3 выливали и ополаскивали планшеты 3 раза PBS+0,05% Tween 20. Последнее ополаскивание удаляли и добавляли субстрат (неразбавленный). Затем планшеты инкубировали в течение 30 минут при 35°C. (5) Реакцию останавливали NaOH. (6) Оптическую плотность (OD) определяли считыванием планшета при 405 нм.

Применяемые в этом эксперименте антитела представляли собой следующие: EPP сыворотка и очищенные моноклональные антитела к gE (Biodesign кат. № mab8612), gB (Chemicon кат. № C05102M, Millipore Corp., Billerica, MA) и gH (Biodesign кат. № C05104M и Virusys кат. № VA033-100, Virusys Corp., Taneytown, MD). Используемые конъюгаты представляли собой античеловеческий IgG (BioSource кат. №AHI0305, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) или козий антимышиный IgG (Pierce кат. № 31322, Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL). 100 мл щелочной фосфатазы pNPP (Sigma кат. № p7988, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) использовали в качестве субстрата.

ПРИМЕР 3

Анализ ELISPOT IFNγ VZV

В кратком изложении серийные разведения тестируемых антигенов в диапазоне от 1 до 0,125 антиген единиц VZV/мл инкубировали с PBMC от 6 доноров в двух повторных лунках. После инкубации клетки, отвечающие на антиген VZV, определяли по их способности продуцировать гамма-интерферон. Продукцию гамма-интерферона детектировали с применением антитела мыши к гамма-интерферону, нанесенного на планшет для микротитрования, и подходящего конъюгированного с ферментом вторичного антитела к IgG мыши и субстрата, позволяющим детекцию субстрата, преципитированного вокруг продуцирующих гамма-интерферон клеток ("пятна"). Количество образующих пятна клеток (SFC: клетки, которые образуют пятна, указывая на секрецию гамма-интерферона) определяли посредством автоматического устройства для чтения планшетов ELISPOT, и результаты представляли как SFC на 10⁶ PBMC.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ПРИМЕР 4

Кинетика инактивации гамма-облученного VZV

Ранее авторы исследовали термическую обработку как способ инактивации лиофилизированного VZV для применения в качестве вакцины для пациентов с иммунной недостаточностью, но обнаружили, что этот способ приводит к остаточной инфекционности вирусного препарата (см. ниже). Предполагают, что такая остаточная инфекционность не является оптимальной характеристикой "инактивированной" вакцины. Более эффективную инактивацию жидкой нефасованной вакцины получали по отношению к лиофилизированной вакцине, но термическая обработка нефасованной вакцины была определена, как не обеспечивающая оптимальный способ получения. Таким образом, исследовали альтернативный способ инактивации лиофилизированной вакцины против вируса ветряной оспы (Ока/Мерк) с применением гамма-облучения ⁶⁰Co, чтобы выяснить, можно ли установить способ более эффективной инактивации инфекционности (получение более благоприятного и более безопасного профиля), чем при термической обработке. Целью такой оценки являлось, во-первых, определить, можно ли получать более эффективную инактивацию инфекционности облучением ⁶⁰Co, а затем, во-вторых, отличаются ли антигенные свойства, полученные после гамма-облучения, от антигенных профилей термически обработанного вещества, и являются ли они пригодными для применения в клинических исследованиях. Флаконы с VZV облучали с использованием ≈1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 кГр (2007) или 0,45, 1,35, и 2,7 кГр. Облучение проводили с применением облучателя ⁶⁰Co Gammacell® (Best Theratronics Ltd. Corporation, Ottawa, Ontario, Canada).

Остаточные БОЕ/мл каждого флакона на дозу облучения (Гр) определяли с использованием анализа образования бляшек ветряной оспы на клетках MRC-5. Строили график зависимости log БОЕ/мл от дозы облучения, и экспериментальные данные демонстрировали обратную линейную зависимость инактивации (фигура 1). После исследования кинетики авторы тестировали 100 мл инактивированной вакцины против VZV, облученной ⁶⁰Co-излучением до 12 кГр (инактивированной лиофилизированной), для обеспечения расширенного подтверждения степени инактивации (путем тестирования большего общего объема). В 100 мл образца не было детектировано бляшек.

Дополнительно ⁶⁰Co-излучение использовали для облучения нефасованного препарата VZV. Нефасованный препарат размораживали и разливали по аликвотам в PETG бутылки для облучения при 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 кГр (фигура 2). Облученный нефасованный препарат анализировали на остаточную инфекционность анализом образования бляшек ветряной оспы с использованием клеток MRC-5. В 100 мл образца облученного нефасованного препарата (6 кГр) не было детектировано бляшек. Линейную кинетику инактивации получали построением графика зависимости тира log БОЕ/мл от времени облучения.

ПРИМЕР 5

Оценка иммуногенности анализом ELISPOT IFNγ VZV

Для оценки влияния различных способов инактивации на иммуногенность проводили анализ ELISPOT IFNγ VZV, как описано в примере 3, с использованием 6 донорских образцов мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Это исследование проводили, чтобы установить, снижается ли образование IFNγ после инактивации VZV при различных условиях. Тестировали пять термически обработанных нефасованных препаратов VZV, а также два гамма-облученных нефасованных препарата VZV. Термически обработанные препараты VZV состояли из образцов, которые обрабатывали при следующих условиях: (1) 40°C в течение 24 часов, (2) 45°C в течение 3,5 часов, (3) 45°C в течение 4,5 часов, (4) 56°C в течение 30 минут и (5) 56°C в течение 90 минут. Гамма-облученные образцы состояли из нефасованных препаратов VZV, гамма-облученных в течение 3 или 4 часов при 5,92 кГр. Для сравнения также тестировали живые (необработанные) образцы VZV из аналогичных нефасованных препаратов, таких как используемые выше для получения инактивированных образцов.

Также включали серию VZV, которая была инактивирована обработкой УФ-излучением, в качестве антигена ELISPOT (VZV серия № 96.07), в качестве контроля серийного анализа, а также PHA (положительный контроль) и среду (отрицательный контроль). Все антигены оценивали в серийном двукратном разбавлении от 1:40 до 1:320. Один серийный анализ проводили, тестируя 6 образцов PBMC, выбранных для получения диапазона уровней ответа на VZV.

Подсчет получавшихся пятен VZV (SFC/10⁶ PBMC) представлен на фигурах 3A-F. Не были получены данные, свидетельствующие о различиях в ответе на VZV для инактивированных антигенных препаратов по сравнению с необработанными антигенными препаратами в тестируемых донорских образцах. Также не были получены данные о существенной взаимосвязи препарата (обработки) и ответа при конкретных уровнях разбавления. В отношении препарата живого VZV различия уровней в подсчете ELISPOT для 8 инактивированных препаратов VZV, включая исходную VZV серию № 96.07, находились в диапазоне от в 1,15 раз меньше (56°C в течение 90 минут) до в 1,14 раз больше (40°C в течение 24 часов, серия № 96.07) относительно препарата живого VZV. В отношении препарата живого VZV ни для одного из 8 инактивированных препаратов VZV не получали статистически значимое более низкое количество пятен ELISPOT в тестируемых донорских образцах.

Таким образом, при тестировании ELISPOT с использованием PBMC от группы доноров, являющихся людьми, не показано значимого отличия в ответах для препаратов VZV, инактивированных различными способами (термической обработкой при 40°C, 45°C, 56°C или гамма-облучением нефасованного препарата).

ПРИМЕР 6

Анализ электронной микроскопии инактивированной вакцины против VZV

Анализы ЭМ термически обработанных и гамма-облученных нефасованных препаратов и лиофилизированной вакцины проводили для получения дополнительной характеристики эффектов инактивации на инактивированные препараты VZV. Выбранный способ анализа представлял собой крио-просвечивающую электронную микроскопию (крио-ПЭМ) в стекловидном льду для лучшего сохранения целостности вируса при проведении анализа ЭМ. Крио-ПЭМ проводили в Nanoimaging Services, Inc (San Diego, CA).

Для анализа ЭМ получали образцы инактивированного VZV для оценки эффектов инактивации на целостность частицы/внешний вид. Лиофилизированные образцы регидратировали 700 мкл стерильной дистиллированной воды и в дальнейшем не разбавляли до визуализации. Образцы хранили в тонком слое стекловидного льда, закрепленного на 2,0×0,5 мкм C-Flat перфорированной углеродной пленке (Protochips, Inc., Raleigh, NC) на медной сетке 400 меш. Непосредственно перед использованием сетки очищали в устройстве Solarus plasma cleaner (10 секунд, 25% O₂, 75% Ar). Все образцы получали нанесением капли (≈3 мкл) суспензии образца на сетку, очищенную от плазмы, промоканием фильтровальной бумаги и непосредственной обработкой остеклованием в жидком этане с использованием устройства FEI Vitrobot™ (4C, 95% RH). Сетки хранили в жидком азоте до переноса на электронный микроскоп для визуализации. Электронную микроскопию проводили с использованием электронного микроскопа FEI Tecnai™ T12 (FEI Company, Hillsboro, OR), работающего при 120 кэВ, оснащенного камерой FEI Eagle™ 4K×4K CC (FEI Company). Изображения каждой сетки получали в многократных масштабах для оценки общего распределения образца. После идентификации целевых областей для визуализации при более низких увеличениях получали пары изображений при более высоком увеличении.

Образцы оценивали с использованием устройства Nanoimaging Systems (увеличение 21K-52K). Сравнивали необработанный лиофилизированный VZV, лиофилизированный VZV, термически обработанный в течение 77 суток при 56°C, и лиофилизированный VZV, облученный при 25 или 50 кГр с использованием источника ⁶⁰Co.

Результаты крио-ЭМ свидетельствуют о потенциальных эффектах частиц при высоких дозах гамма-облучения с уменьшением электронной плотности (возможно, отражающей деградацию вирусной ДНК), но без достоверного эффекта на полную частицу и внешнего вида белка для лиофилизированных образцов. Тем не менее лиофилизация может предохранять от таких изменений, т.к. для лиофилизированных инактивированных образцов было показано уменьшение электронной плотности, но частицы оставались интактными при более высоких дозах. (См. фигуру 4).

ПРИМЕР 7

Определение антигенной реактивности

Анализы ELISA антигена VZV проводили для определения содержания антигенов (Ag) термически или гамма-облученных инактивированных образцов нефасованного препарата или гамма-облученного лиофилизированного VZV с использованием поликлональной сыворотки человека и моноклональных антител (mAb) к gB, gH, gE VZV в качестве детектирующих антител. Для гамма-облученного нефасованного препарата или лиофилизированных образцов не было выявлено изменений в антигенной реактивности. Однако для образцов, термически обработанных при 56°C в течение 90 минут, было показано изменение в антигенной реактивности поликлональных антител и моноклональных антител к gE и gH.

Дополнительные образцы нефасованного препарата VZV подвергали гамма-облучению при 25 кГр и 50 кГр для того, чтобы подтвердить применение 50 кГр в качестве наиболее высокого экспонирования для терминальной стерилизации. Эти образцы тестировали анализом неконкурентного ELISA антигена с поликлональной сывороткой против VZV и mAb к gpE, gB и gH.

Гамма-облучение лиофилизированной вакцины против VZV в условиях стерилизации (25-50 кГр) не изменяет на обнаруживаемом уровне ELISA-реактивность антигена поликлональной сыворотки или моноклональных антител к gE или gB. Результаты применения mAb gH являлись неубедительными вследствие высокой фоновой окраски. Повышенный фоновый сигнал с этим моноклональным антителом (но не с моноклональными антителами к gE или gB) также наблюдали с использованием другого планшета ELISA (Maxisorp).

ПРИМЕР 8

Иммуногенность у мышей

Для оценки набора инактивированных препаратов VZV (iVZV), полученных различными способами инактивации, проводили исследование иммуногенности у мышей. Образцы сыворотки, полученные в ходе исследования, оценивали анализом ELISA VZV для определения относительного титра антител к VZV, индуцированных различными инактивированными препаратами VZV. Получали и оценивали два различных нефасованных препарата VZV: (1) нефасованный препарат VZV, термически обработанный при 56°C в течение 90 минут, и (2) нефасованный препарат VZV, подвергнутый гамма-облучению 5924,7 грей (Гр) в течение 3 часов. Также получали и оценивали два различных препарата лиофилизированной вакцины против VZV: (1) лиофилизированная вакцина против VZV, термически обработанная при 56°C в течение 50 суток, и (2) лиофилизированная вакцина против VZV, подвергнутая гамма-облучению 25000 Гр. Оценивали нефасованный препарат живого (необработанного) VZV и живую (необработанную) лиофилизированную вакцину против VZV для сравнения с нефасованными препаратами iVZV.

Мышей BALB/c (n=16 для каждой группы) иммунизировали интраперитонеально (и./п.) 4,5 антигенными единицами VZV (Е)/мышь (9 Е/мл) на 0, 14 и 29 сутки. Кровь (сыворотку) собирали на сутки -1 (до иммунизации) и на 13, 28 и 43 сутки. Сыворотку 28 суток (14 суток после введения дозы 2) оценивали ELISA VZV на образование IgG.

Приведенные титры VZV (титр VZV минус титр MRC-5) представлены на фигуре 5. Отобранную до иммунизации сыворотку тестировали с соответствующей группой на 28 сутки для определения порогового титра MRC-5 и VZV. Лунки планшетов для ELISA покрывали УФ-обработанным VZV или экстрактом клеток MRC-5, а затем инкубировали с разбавленной тестируемой сывороткой мышей для определения относительного количества специфических антител к VZV в сыворотке мышей.

Результаты демонстрируют, что титр IgG термически обработанного нефасованного препарата был в среднем в 5,57 раз ниже (95% CI=(3,45, 8,99)), и титр IgG обработанного гамма-облучением нефасованного препарата был в среднем в 2,43 раза ниже (95% CI=(1,51, 3,93)) относительно необработанного нефасованного препарата. Термически обработанный лиофилизированный титр был в среднем в 1,38 раза ниже (95% CI=(1,00, 1,90)), и обработанный гамма-облучением лиофилизированный титр был в среднем в 1,66 раза ниже (95% CI=(1,22, 2,26)), чем необработанного лиофилизированного вируса. Титр антител с обработанным гамма-облучением нефасованным препаратом был в среднем в 2,29 раза выше (95% CI=(1,54, 3,41)), чем титр, полученный после иммунизации термически обработанным нефасованным препаратом. Титр антител с обработанным гамма-облучением лиофилизированным вирусом был в среднем в 1,20 раза ниже (95% CI=(0,89, 1,61), чем титр, полученный после иммунизации термически обработанным лиофилизированным препаратом. Все данные подтверждают, что гамма-облучение лиофилизированного вируса оказывает наименьшее влияние на иммуногенность на этой модели.

Результаты демонстрируют, что образование антител (IgG) у мышей было снижено после иммунизации 2 дозами инактивированных препаратов по сравнению с необработанными нефасованными препаратами.

ПРИМЕР 9

Введение инактивированной вакцины против VZV здоровым пациентам в возрасте 50-59 лет

Обработанную гамма-облучением вакцину против VZV вводили здоровым взрослым в возрасте от 50 до 59 лет в мультицентровом рандомизированном двойном слепом исследовании II фазы, которое предназначалось для оценки безопасности, переносимости и иммуногенности вакцины. Целью этого исследования являлось исследование безопасности, переносимости и иммуногенности серии вакцин, инактивированных способами обработки гамма-облучением или термической обработки.

В общей сложности 161 здоровый индивидуум в возрасте от 50 до 59 лет разделяли в случайном порядке 2:2:1 для получения обработанной гамма-облучением вакцины против VZV "A", инактивированной от 16 до 25 кГр (n=65), термически обработанной вакцины против VZV (n=63) или плацебо (n=33), вводимых при 4-кратном режиме дозирования. Каждую дозу вводили приблизительно через 30 суток. Термически обработанную вакцину и обработанную гамма-облучением вакцину "A" получали из независимых серий нефасованного препарата, но проверенных на одинаковое содержание антигена.

Первичная гипотеза заключалась в том, что обработанная гамма-облучением вакцина против VZV (A), инактивированная при уровне от 16 до 25 кГр, будет вызывать приемлемый специфичный к VZV иммунный ответ, как измерено gpELISA на 28 сутки после введения дозы 4. Вспомогательная гипотеза заключалась в том, что термически обработанная вакцина против VZV будет вызывать приемлемый специфичный к VZV иммунный ответ, как измерено gpELISA на 28 сутки после введения дозы 4. Статистический критерий благоприятного исхода, соответствующий нижней границе двустороннего 95% доверительного интервала повышения среднего геометрического (GMFR), в группе реципиентов термически обработанной вакцины против VZV составляет >1,0. Результаты иммуногенности реципиентов вакцины в этом исследовании представлены на фигуре 6.

Результаты демонстрируют, что благоприятные исходы, проверяемые первичной и дополнительной гипотезами, выполнялись, т.е. обработанная гамма-облучением вакцина против VZV A и термически обработанная вакцина VZV являлись иммуногенными при введении здоровым индивидуумам. Обе группы вакцины обладали показателями безопасности, аналогичными таким, как в группе плацебо.

ПРИМЕР 10

Введение серий вакцин против VZV, инактивированных при различных уровнях гамма-облучения, здоровым добровольцам в возрасте от 50 до 59

Второе исследование проводили для получения клинических данных о сериях вакцин, инактивированных при более широких диапазонах гамма-облучения. В этом исследовании в общей сложности 129 здоровых индивидуумов в возрасте от 50 до 59 лет случайным образом разделяли 1:1 для введения обработанной гамма-облучением вакцины против VZV "B", облученной при от 16 до 25 кГр (n=64) или обработанной гамма-облучением вакцины против VZV "C", облученной при от 25 до 50 кГр (n=65), водимых при 4-кратном режиме дозирования, где каждую дозу вводили приблизительно через 30 суток. Серии вакцин B и C, которые использовали в этом исследовании, получали из аналогичной серии нефасованного препарата и аналогичного наполнения/состава идентичного содержания антигенов VZV, но инактивированных при различных уровнях гамма-облучения.

Первая первичная гипотеза этого исследования заключалась в том, что обработанная гамма-облучением вакцина против VZV (C), инактивированная при уровне от 25 до 50 кГр, вызывает специфичный к VZV иммунный ответ, как определяемый gpELISA на 28 сутки после введения дозы 4. Вторая первичная гипотеза заключалась в том, что обработанная гамма-облучением вакцина против VZV (B), инактивированная при уровне от 16 до 25 кГр и соответствующего антигенного содержания вакцины, инактивированной при от 25 до 50 кГр, вызывает приемлемый специфичный к VZV иммунный ответ, как определяемый gpELISA на 28 сутки после введения дозы 4. Статистический критерий благоприятного исхода для каждой гипотезы, соответствующий нижней границе двустороннего 95% доверительного интервала GMFR, в группе реципиентов обработанной гамма-облучением вакцины составляет >1,0. Результаты иммуногенности реципиентов вакцины в этом исследовании представлены на фигуре 7.

Результаты данного исследования демонстрируют, что благоприятные исходы проверяемых первичных гипотез выполнялись, т.е. обработанная гамма-облучением вакцина против VZV B (обработанная гамма-облучением при 16-25 кГр) и обработанная гамма-облучением вакцина против VZV C (обработанная гамма-облучением при 25-50 кГр) являлись иммуногенными при введении здоровым индивидуумам. Обе группы вакцины обладали аналогичными показателями безопасности.

Результаты данного исследования также демонстрируют, что существовало неравенство фонового среднего геометрического титра (GMT), в группе B фоновый GMT составлял ≈313, в группе C фоновый GMT составлял ≈429. Хотя разницы в повышении не являлись значительными, различия фоновых титров можно объяснить различиями повышения, наблюдаемыми в испытании. Кроме того, данные анализа указывают на то, что более высокая доза гамма-облучения (>25 кГр) вызывает более высокую деградацию антигена.