Результат интеллектуальной деятельности: Способ экспресс-диагностики скрытых воспалительных процессов молочной железы и репродуктивных органов коров

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для экспресс-диагностики скрытых воспалительных процессов молочной железы и репродуктивных органов коров.

Известна диагностика субклинического мастита у коров, заключающаяся в исследовании секрета молочной железы путем внесения реагента в пробу свежевыдоенного молока. Существует множество реагентов разных производителей, которые изменяют окраску и консистенцию секрета. К таким методам относится проба с мастидином.

Сущность метода. Действие мастидина основано на выявлении увеличенного количества лейкоцитов и изменений реакции (рН) молока. В каждое углубление пластинки из соответствующей четверти вымени надаивают по 1 мл молока и добавляют 1 мл мастидина из бутылки с автоматом-клювиком. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в течение 15-20 секунд. Реакция учитывается в крестах по густоте желе, а изменение цвета является ориентирующим и дополняющим показателем. При использовании мастидина цвет смеси при нормальной реакции (рН) молока светло-сиреневый, дымчатый, при кислой - почти белый, при щелочной - темно-сиреневый, фиолетовый, отрицательная реакция - однородная жидкость; сомнительная реакция - следы образования желе; положительная реакция - ясно видимый сгусток (от слабого до плотного), который наполовину или целиком выбрасывается из луночки пластинки палочкой при перемешивании, [http://www.studfiles.ru/preview/1153267/]

Недостатком способа является то, что в первые дни после отела и перед запуском количество клеток, в том числе и лейкоцитов, в молоке увеличивается, поэтому такое молоко иногда может давать с мастидином сомнительную или положительную реакцию, поэтому могут понадобиться дополнительные методы диагностики.

Под скрытым хроническим эндометритом понимают воспалительный процесс эндометрия, протекающий без ясно выраженных клинических признаков и обычно при отсутствии патологических выделений из матки в периоды между течками. Диагностируется он только во время течки по наличию гнойных прожилок и других вкраплений в течковой слизи и является причиной многократных неплодотворных осеменений коров (микробные токсины и другие продукты воспаления губительно действуют на зародыш). Ритм половых циклов чаще всего не нарушается. У внешне здоровых коров отмечают многократные безрезультатные осеменения и бесплодие, что нередко и является основанием предполагать о наличии у них данной патологии. [http://webmvc.com/bolezn/livestock/tocology/endom3.php]

Достоверный диагноз по клиническим признакам поставить затруднительно. Хронический скрытый эндометрит диагностируют по обнаружению во время охоты патологических выделений из матки. Они бывают не прозрачными, как в норме, а мутными с примесью хлопьев гноя и более обильными. Через 1-3 дня после охоты патологические выделения из матки прекращаются и вновь не отмечаются до наступления очередной течки и охоты.

Более точно диагностировать хронический скрытый эндометрит, можно только используя лабораторные методы.

В качестве лабораторной диагностики используют исследование цервикальной слизи по Г.М. Калиновскому.

Сущность метода заключается в выявлении в слизи серосодержащих аминокислот, которые отмечаются при воспалении. В пробирку вносят 4 мл 0,5%-ного раствора свинца уксуснокислого, к которому по каплям добавляют 20%-ный раствор едкого натрия до образования осадка (гидрата окиси свинца). Через 15-20 с снова добавляют раствор едкого натрия до исчезновения осадка. Затем в пробирку вносят 1,5-2,0 мл слизи, взятой у коровы перед осеменением. Содержимое пробирки легко встряхивают и нагревают, не доводя до кипения. При наличии скрытого эндометрита в результате образования сернистого свинца смесь приобретает цвет крепко заваренного чая.

Аналогом является также способ определения гистамина в моче по В.Г. Гавришу.

Сущность метода заключается в выявлении при воспалительных процессах гистамина, продуцируемого тучными клетками эндометрия. В пробирку вносят 2 мл мочи животного и добавляют 1 мл 5%-ного водного раствора ляписа. Кипятят в течение 2 мин. Образование черного осадка указывает на воспаление эндометрия, а коричневого или светлого - на нормальное состояние.

Недостатком способов постановки диагноза по лабораторному исследованию цервикальной слизи или мочи, является то, что взять цервикальную слизь, мочу достаточно трудоемко и занимает большое количество времени, а реактивы для реакции малодоступны. Кроме того, эти методы используется только при постановке диагноза на хронический эндометрит

Ближайшим аналогом по лабораторной диагностике скрытого воспалительного процесса является способ определения гистамина в плазме крови (Патент на изобретение №: 2302632, кл. G01N, 2006 г.).

Сущность способа заключается в определении гистамина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и осуществляется в надосадочной жидкости, полученной в результате осаждения белков плазмы ацетонитрилом.

Для определения используют венозную кровь, консервированную гепарином. Кровь центрифугируют при 8000 об/мин в течение 20 минут для осаждения форменных элементов. Затем к 1 мл полученной плазмы добавляют 2 мл 100%-ного ацетонитрила для осаждения белков плазмы. Полученную суспензию сразу тщательно перемешивают стеклянной палочкой для формирования равномерного осадка. Затем пробу центрифугируют при 8000 об/мин в течение 15 минут для формирования плотного осадка. Для исследования забирают надосадочную жидкость.

Полученную надосадочную жидкость хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы (элюэнта) смесь 0,1 М раствора дигидрофосфата натрия и ацетонитрила при градиенте концентрации последнего от 0 до 50%. Скорость подачи потока элюэнта составляет 90 мкл/мин, объем элюирования 1500 мкл, температура хроматографической колонки 35°С. Детекцию проводят при длине волны 210 нм.

Гистамин в плазме идентифицируют путем сопоставления времени удерживания пика, полученного на хроматограмме анализируемой пробы, со временем удерживания стандартного образца. Для подтверждения полученных результатов добавляют стандартный раствор гистамина в анализируемую пробу и наблюдают увеличение предполагаемого пика гистамина, сравнивают спектры поглощения в УФ-области стандартного образца и обнаруженного гистамина в плазме, записанные при остановленном потоке элюэнта во время выхода вещества из колонки.

Количественное определение гистамина в плазме проводят путем построения градуировочного графика, хроматографируя серию разведений стандартного образца гистамина в воде. Концентрацию гистамина в плазме вычисляют по формуле: C=W(R)×D/V, где W(R) - вычисленное по градуировочной зависимости количество вещества в пике, D - разведение пробы, V - объем пробы (2 мкл).

[http://www.ntpo.com/patents_medicine/medicine_6/medicine_2247.shtml]

Недостатком способа является то, что он является трудоемким, лабораторную диагностику можно осуществить только в помещении, оборудованном хроматографом, ввиду сложности экономически нецелесообразно использовать для с/х животных.

Техническим результатом является обеспечение доступности предлагаемого способа, возможность его применения на ферме, сокращение себестоимости способа, сокращение трудозатрат с условием сохранения достоверности диагностики воспалительных процессов у с/х животных.

Технический результат достигается тем, что в способе экспресс-диагностики скрытых воспалительных процессов молочной железы и репродуктивных органов коров, включающем определение гистамина в надосадочной жидкости, полученной в результате осаждения белков жидкой части крови ацетонитрилом, согласно изобретению осаждение белков жидкой части крови осуществляют ацетонитрилом, который берут в соотношении 1:2, взбалтывают, выдерживают не более 2 мин, добавляют 90-100 мкл едкого натрия и 400-500 мкл 2%-ного медного купороса, встряхивают смесь и определяют наличие гистамина в надосадочной жидкости и по изменению окраски устанавливают реакцию: светло-голубая - положительная, а фиолетовая окраска - реакция отрицательная.

Новизна предлагаемого способа заключается в качественной реакции на гистамин и позволяет в течение 5 минут и с высокой достоверностью определить наличие скрытого воспалительного процесса в организме коров.

Способ экспресс-диагностики осуществляют следующим образом.

Для определения используют сыворотку крови. Затем к 500 мкл сыворотки крови добавляют 1000 мкл ацетонитрила взбалтывают и дают постоять 2 минуты. Если взять сыворотки крови меньше 500 мкл, то осуществление реакции невозможно, а если более 500 мкл - нецелесообразно. Затем добавляют 90-100 мкл 10%-ного раствора едкого натрия (NaOH), после чего сразу вносят 400-500 мкл 2%-ного раствора медного купороса (CuSO₄), встряхивают смесь и проводят читку реакции. Если взять 2%-ный раствор медного купороса в объеме менее 400 мкл или более 500 мкл, то осуществление реакции невозможно, если взять 10%-ный раствор едкого натрия менее 90 мкл или более 100 мкл, то осуществление реакции невозможно. При наличии гистамина в крови у коров окраска надосадочной жидкости светло-голубая - реакция положительная. При отсутствии гистамина - окраска фиолетовая - реакция отрицательная.

Примеры конкретного осуществления способа.

При апробации метода в хозяйстве «Искра» Выселковского района была взята кровь у 20 лактирующих клинически здоровых коров в 4-5 месяцев стельности. Получили сыворотку крови. Затем к 500 мкл сыворотки крови добавляли 1000 мкл ацетонитрила взбалтывали и оставляли на 2 минуты. Затем добавляли 100 мкл 10%-ного раствора едкого натрия (NaOH), после чего сразу вносили 500 мкл 2%-ного раствора медного купороса (CuSO₄), встряхивали смесь и проводили читку реакции. У 5 коров сыворотка окрасилась в светло-голубой цвет, что говорит о положительной реакции на наличие гистамина. У 15 коров сыворотка была окрашена в фиолетовый цвет, что говорит об отрицательной реакции на наличие гистамина. У всех коров были взяты пробы молока из всех долей и проверены на скрытый мастит пробой с мастидином. У 5 коров с положительной реакцией в одной или 2 долях реакция на скрытый мастит оказалась положительной (образовался фиолетовый желеобразный сгусток). У 13 коров с отрицательной реакцией на гистамин реакция на скрытый мастит оказалась отрицательной (в лунках была однородная жидкость светло-сиреневого цвета) и только у 2 коров с отрицательной реакцией на гистамин реакция на скрытый мастит в 1 доле была положительной (в лунках пластины образовался сгусток фиолетового цвета). По результатам апробации на лактирующих коровах достоверность метода составила 90%.

Проведенная апробация способа выявления скрытого воспалительного процесса в организме коров на 17 коровах показала, что у 12 коров, у которых наблюдались перегулы и безрезультатные осеменения, реакция на наличие гистамина в сыворотке крови была положительной. Биохимический анализ крови показал высокое содержание общего белка в крови коров, а также белковых фракций (γ-глобулинов), что подтверждает наличие воспалительного процесса в организме коров. У 3 коров с отрицательной реакцией после первого осеменения наступила стельность. У 2 коров оплодотворение не наступило. Биохимический анализ крови не выявил факторов воспаления у животных. Белки и белковые фракции были в пределах нормы согласно физиологическому состоянию. У коров с положительной реакцией на гистамин был подтвержден диагноз на скрытый хронический эндометрит. По результатам апробации достоверность составила 88%.

Пример. Корова Лада, 2014 года рождения. 5 месяцев стельности, период лактации, клинически здорова. Взята кровь из яремной вены, получена сыворотка. Затем к 500 мкл сыворотки крови добавляли 1000 мкл ацетонитрила, взбалтывали и оставляли на 2 минуты. Затем добавляли 100 мкл 10%-ного раствора едкого натрия (NaOH), после чего сразу вносили 500 мкл 2%-ного раствора медного купороса (CuSO₄), встряхивали смесь и проводили читку реакции. Сыворотка окрасилась в светло-голубой цвет, что говорит о положительной реакции на наличие гистамина. После - этого пробой с мастидином, был проверен секрет вымени на наличие субклинического мастита. В секрете из правой передней доли образовался желеобразный сгусток фиолетового цвета, что говорит о наличии в этой доле субклинического мастита. Корова направлена на лечение. Молоко из правой передней доли подлежит выбраковке до наступления выздоровления животного.

Пример. Корова Вакса, 2013 года рождения, отел наступил 62 дня назад. У коровы после отела наблюдался острый эндометрит, животное было подвергнуто лечению до наступления клинического выздоровления. На момент взятия крови общее состояние коровы без изменений, половая цикличность не нарушена. Корову после отела осеменяли 1 раз, но безрезультатно. У Ваксы была взята кровь из яремной вены, получили сыворотку крови. Затем к 500 мкл сыворотки крови добавляли 1000 мкл ацетонитрила взбалтывали и оставляли на 2 минуты. Затем добавляли 100 мкл 10%-ного раствора едкого натрия (NaOH), после чего сразу вносили 500 мкл 2%-ного раствора медного купороса (CuSO₄), встряхивали смесь и проводили читку реакции. Сыворотка окрасилась в светло-голубой цвет, что говорит о положительной реакции на наличие гистамина. После этого провели биохимический анализ крови, который показал увеличение общего белка, а также γ-глобулинов. Общий анализ крови выявил увеличение общего числа лейкоцитов, а в лейкоформуле регистрировалось увеличение лимфоцитов, что говорит о наличии воспалительного процесса в организме коровы. Исследование мочи по В.Г. Гавришу выявило наличие гистамина в моче животного. Корове был поставлен диагноз: скрытый хронический эндометрит и назначено необходимое лечение.